姚翠萍,周湘連,王晶,王波,黃康,張鎮(zhèn)西

(西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室, 710049, 西安)

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納米金標(biāo)記細(xì)胞的熒光壽命成像及其三維重建

姚翠萍,周湘連,王晶,王波,黃康,張鎮(zhèn)西

(西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室, 710049, 西安)

為了研究在基于納米金的腫瘤光動力學(xué)療法以及腫瘤熱療中納米金在細(xì)胞中的分布及代謝,利用多光子熒光顯微鏡技術(shù)對在熱療中納米金結(jié)合的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了多次掃描成像,并采用一種基于區(qū)域的活動輪廓模型圖像分割算法,對與納米金結(jié)合的細(xì)胞的多光子熒光顯微圖像進(jìn)行處理,在一幅具有多個細(xì)胞的圖像中分割出單個細(xì)胞的輪廓。根據(jù)細(xì)胞斷層切片圖像的輪廓采用移動立方體算法,對細(xì)胞進(jìn)行三維重建,繪制出細(xì)胞表面的三維模型,再利用納米金的熒光壽命和光強(qiáng)來標(biāo)定納米金在細(xì)胞具體位置的分布。結(jié)果表明,在一定時間內(nèi),納米金會進(jìn)入細(xì)胞并在不同的區(qū)域內(nèi)呈現(xiàn)一定的分布。這與抗原抗體結(jié)合會導(dǎo)致抗體的內(nèi)化,從而使納米金進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的事實相符。這種技術(shù)將會為更加直觀、全面地研究納米金與細(xì)胞的相互作用以及納米金在細(xì)胞內(nèi)具體位置(比如某個細(xì)胞器內(nèi)的分布)提供一種可行的方法。

熒光壽命成像;金納米微粒;三維重建

多光子顯微成像對于癌癥的早期診斷是一種強(qiáng)有力的技術(shù)手段,它能夠非侵入式地對組織里上百微米深處亞細(xì)胞特征進(jìn)行成像[1]。多光子顯微成像在三維分辨率、探測深度、信噪比等方面的優(yōu)點都是以往的激光顯微鏡不具備的,其成像原理見圖1。通過對非熒光觀測目標(biāo)注入熒光造影劑,就能夠?qū)Χ喾N其他生物分子特征進(jìn)行多光子顯微成像,從而更好地監(jiān)測癌細(xì)胞[2]。傳統(tǒng)的有機(jī)染料是最早使用的造影劑之一,它能夠發(fā)出明亮的熒光,可以用于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的標(biāo)記,但是它的抗光漂白能力差。熒光半導(dǎo)體量子點具有較寬的吸收波長范圍,但是卻有潛在的細(xì)胞毒性,使得它不適合在體臨床應(yīng)用[1]。另一類熒光造影劑金屬納米粒子,不僅具有較高的熒光發(fā)光效率,而且與細(xì)胞有著很好的生物相容性。以金納米顆粒作為熒光造影劑,與多光子顯微成像結(jié)合進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)成像是目前的研究熱點[3-5]。另外,納米金目前在選擇性光熱治療、藥物遞送方面的研究也取得了很大的進(jìn)展[6],但是目前納米金的代謝機(jī)理還不是很清楚,這使其應(yīng)用于臨床受到了限制。在納米金輔助的光動力療法中,由于納米金的分布不清楚,導(dǎo)致納米金在細(xì)胞內(nèi)的局域場增強(qiáng)效應(yīng)無法發(fā)揮的原因也無法確定[7]。因此,納米金在細(xì)胞內(nèi)的分布有助于提高納米金輔助的光動力療法,并對納米金在活體內(nèi)的代謝通路研究有所促進(jìn),進(jìn)而推進(jìn)納米金體內(nèi)代謝的研究進(jìn)展。

在納米金輔助的光動力療法中,納米金結(jié)合的光敏劑被細(xì)胞吸收后,光照射的結(jié)果可以使光動力效果提高,但是卻沒有發(fā)揮納米金等離子體共振效應(yīng)[7],可能的原因是進(jìn)入細(xì)胞后,納米金和光敏劑分布在細(xì)胞的部位不同。

圖1 多光子顯微成像系統(tǒng)示意圖

本文利用抗原抗體把納米金特異性結(jié)合到卵巢癌細(xì)胞OVCAR3上,孵育15 min,然后利用多光子熒光顯微鏡的熒光壽命成像,對細(xì)胞進(jìn)行多層掃描成像,獲得一系列的二維圖形。最后,利用圖像分割算法,劃分出單個細(xì)胞輪廓,并進(jìn)行三維重建,利用熒光壽命的長短以及光強(qiáng)標(biāo)定納米金在細(xì)胞中或細(xì)胞表面的具體分布。如果再對不同的細(xì)胞器標(biāo)記不同熒光壽命的染料,利用同樣的方法,就可以定位納米金在具體細(xì)胞器中的分布,與光敏劑所在部位進(jìn)行比較,就可以獲得其具體的分布信息。這種方法對于研究納米金與細(xì)胞膜的相互作用以及納米金的代謝通路提供了一種有力的工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實驗中所使用的卵巢癌細(xì)胞OVCAR3從美國模式培養(yǎng)中心(ATCC)獲得,貼壁生長在含有10 mmol/L的4-羥乙基哌嗪磺酸(Hepes)和1 mmol/L的L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基RPMI-1640(Sigma,USA)中,其中還加入了體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、1%的青霉素/鏈霉素(PAA,USA)以及1.5 g/L的碳酸氫鈉,置于37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),CO2與空氣的體積分?jǐn)?shù)分別為5%、95%,培養(yǎng)環(huán)境相對飽和濕度為95%。

把細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中,當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿瓶底的時候,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶(含有Ethylene Diamine Tetraacetie Acid(EDTA),Sigma)消化細(xì)胞5 min,并對其在20 ℃以21 100 g的速度離心20 min,以2.0×105mL-1的密度懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。接著以細(xì)胞與納米金個數(shù)比等于1∶104的濃度加入結(jié)合有Erbitux抗體的30 nm納米金(British Biocell International公司)和細(xì)胞上對應(yīng)的表面生長因子受體(EGFR)反應(yīng),在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min后,沖洗掉多余的納米金,將樣品拿到多光子熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光壽命成像。

1.2 熒光壽命成像

成像所用設(shè)備為德國JenLab公司的DermaInspect多光子顯微成像系統(tǒng)。系統(tǒng)包括一個固態(tài)鎖模鈦寶石激光器(MaiTai,Spectra Physics,Darmstadt,德國),波長從710～920 nm可調(diào),頻率為80 MHz,800 nm時的平均輸出功率大于900 mW,脈寬為75 fs。掃描模塊包括電動光束衰減器、雙軸電控掃描儀、壓電驅(qū)動,工作距離為140 μm的物鏡(Plan Neofluar×40,NA 1.3,Zeiss,Goettingen,德國)等。通過二向色鏡和低通濾波片(BG39,Schot,Mainz,德國)對激發(fā)光和背景噪聲進(jìn)行濾除,發(fā)光信號由光電倍增管模塊(H7732-01,hamamatsu,Herrsching,德國)進(jìn)行探測[8-9]。熒光壽命成像模塊是通過時間關(guān)聯(lián)單光子計數(shù)法來測量的[10-11]。

1.3 圖像分割與細(xì)胞三維重建

測試獲得二維的熒光壽命成像結(jié)果,其視野內(nèi)一般不會只有一個細(xì)胞,因此首先要把每個細(xì)胞分割出來,再進(jìn)行重建。對于細(xì)胞的分割,本文采用了文獻(xiàn)[12]提出的一種基于局部區(qū)域的活動輪廓模型算法。在此模型中,圖像分割是在一個較小的局部區(qū)域里劃分出前景和背景。首先,需要建立一個合適形狀的初始化輪廓,初始化輪廓用水平集表示,根據(jù)所選模型(例如chan-vese模型)計算初始化輪廓上每個點的局域化能量。然后,通過均值區(qū)分方法,使局部能量最優(yōu)化,進(jìn)行曲線演化,最終達(dá)到使曲線上所有點的總能量最小。這時,經(jīng)過一系列曲線演化所得到的分割結(jié)果就是目標(biāo)細(xì)胞的外輪廓。

細(xì)胞的三維重建采用的是移動立方體(MC)算法,是一種三維等值面重建算法,它是由文獻(xiàn)[13]提出來的。在醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域里,MC算法是最常用的面繪制三維重建算法,采用分而治之的方法,以上下兩層切片的8個像素點形成的立方體為單位對所有的切片數(shù)據(jù)進(jìn)行逐個處理。每個立方體與設(shè)定的閥值相比較,在立方體里形成一個三角形表面,所有三角形連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),就構(gòu)成了三維表面。

1.4 納米金細(xì)胞內(nèi)空間分布標(biāo)記

在熒光壽命成像中,通過對所采集的數(shù)據(jù)與所設(shè)定的模型(特定函數(shù))進(jìn)行擬合,使數(shù)據(jù)和模型之間的方差最小,其中每個點可以由幾個不同的發(fā)色團(tuán)疊加。在本測量中,對任意一點設(shè)置為兩個發(fā)色團(tuán)的疊加(納米金和細(xì)胞)。因此,在對納米金進(jìn)行空間標(biāo)記的時候,同時設(shè)置3個條件:熒光壽命小于200 ps,每個像素中短壽命占比例大于80%,每個像素強(qiáng)度大于150(根據(jù)圖像獲得任意單位)。只有滿足以上3個條件,才認(rèn)為某個點是納米金。最后,把獲得的細(xì)胞三維模型與納米金的分布模型進(jìn)行疊加,就可以得到納米金在細(xì)胞中的分布。

2 實驗結(jié)果

2.1 熒光壽命成像

(a)熒光壽命成像偽彩圖

(b)熒光壽命成像強(qiáng)度

(c)熒光壽命分布直方圖圖2 結(jié)合有納米金的細(xì)胞的熒光壽命成像

納米金標(biāo)記的OVCAR3細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度、偽彩色熒光壽命和熒光壽命分布如圖2所示。所使用的激發(fā)波長為750 nm,激發(fā)功率為25 mW。從圖中可知,納米金分布在細(xì)胞上。根據(jù)文獻(xiàn)報道,納米金的熒光壽命小于100 ps[14]。由于儀器最小分辨率為180 ps,而根據(jù)細(xì)胞各部分的熒光壽命均在納秒級[15-16],可以認(rèn)為系統(tǒng)中熒光壽命小于180 ps的成分主要來自納米金,后續(xù)程序中還會根據(jù)其強(qiáng)度的大小對其進(jìn)一步限制。從獲得的偽彩熒光壽命圖像和其相應(yīng)的熒光壽命分布直方圖可以看出,熒光壽命小于200 ps的部分可以代表納米金,而細(xì)胞的熒光壽命通常大于1 500 ps。對于一個樣品,在縱軸方向上每隔0.4 μm掃描一次,獲得一副二維圖像,要獲得完整的一個細(xì)胞就要進(jìn)行大約50多次的掃描,在每一個深度上都獲得一個二維圖像。

2.2 圖像分割與三維重建

進(jìn)行圖像分割的目的是劃分出圖像中目標(biāo)細(xì)胞的外輪廓用于細(xì)胞表面三維重建。為了方便進(jìn)行三維重建,分割出來的輪廓要求是閉合的曲線。通過比較閾值分割、Canny算子、Log算子、區(qū)域生長、模糊聚類等算法,本文最終選擇了活動輪廓模型算法。該算法雖然速度稍慢,但是滿足對圖像輪廓精確劃分的要求,且能進(jìn)行局部分割。當(dāng)需要在一幅包含多個類似目標(biāo)的圖像中分割出感興趣的目標(biāo)時,這個模型的分割效果尤其好。目標(biāo)細(xì)胞分割以及三維重建算法都通過Matlab平臺實現(xiàn)。圖3是根據(jù)活動輪廓算法對圖像中的一個目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分割的結(jié)果,對其余的50多幀圖像都進(jìn)行了同樣的分割,然后將所有的分割結(jié)果進(jìn)行三維重建,組成一個細(xì)胞的完整三維模型,如圖4所示。

(a)熒光壽命成像偽彩圖

(b)灰度化并選定目標(biāo)細(xì)胞

(c)目標(biāo)細(xì)胞分割后結(jié)果圖3 對感興趣細(xì)胞的分割過程

圖4 重構(gòu)后的細(xì)胞三維模型

2.3 納米金在細(xì)胞的空間分布

根據(jù)前述的方法獲得了如圖5所示納米金在三維細(xì)胞內(nèi)的空間分布圖。從圖中可以看出,經(jīng)過15 min培育后,大部分納米金已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,而細(xì)胞膜表面上的納米金只占了少部分。這些分布從動態(tài)三維圖中可以分辨得更清楚。

圖5 納米金在三維細(xì)胞內(nèi)的空間分布

3 討論與結(jié)論

多光子顯微鏡為觀察完整組織等比較厚的樣品中的活細(xì)胞提供了一個很好的工具[17]。這項技術(shù)為很多不方便成像或者不能提供有用信息的實驗提供了一種可能性。納米金的多光子發(fā)光被認(rèn)為是等離子體輔助成像、光熱治療以及觀察細(xì)胞器的一種最重要的工具之一[18-20]。通過多光子顯微鏡,在生理條件下可以直接觀察到納米金,同時通過熒光壽命成像可以很清楚地分辨出納米金和細(xì)胞的自體熒光。而且,由于在多光子激勵中,當(dāng)物鏡數(shù)值孔徑在1.2～1.4時,熒光總能量的80%來自于物鏡焦點700～1 000 nm厚度的范圍內(nèi),這么窄范圍的多光子激勵只會誘導(dǎo)焦點處的物質(zhì)發(fā)光。因此,當(dāng)使用激光掃描多光子熒光顯微鏡在z軸方向上以0.4 μm的間隔進(jìn)行成像時,就可以獲得納米金在細(xì)胞內(nèi)的具體分布。從圖3、圖5可以看出,納米金有的分布在細(xì)胞膜上(顏色不同),有的分布在細(xì)胞內(nèi)部,這是因為表皮生長因子受體在連接配體后會很快被內(nèi)化[21]。

此外,從圖5可以看出,通過利用熒光壽命和光強(qiáng)進(jìn)行標(biāo)記,可以比較清楚地觀察到納米金在細(xì)胞內(nèi)的分布,并且分布并不均勻,也許這和OVCAR3細(xì)胞膜上的表面生長因子受體分布有關(guān),也可能和納米金進(jìn)入細(xì)胞后形成內(nèi)吞泡有關(guān),具體的原因需要進(jìn)一步研究。如果納米金不和細(xì)胞上的受體結(jié)合,只是單純地和細(xì)胞進(jìn)行一定時間的培育,此時要使納米金進(jìn)入細(xì)胞可能需要比較長的時間,其在細(xì)胞內(nèi)的分布也會有所不同,即使這樣,本文算法同樣適用。除此之外,還可以用于其他情況,比如納米金的穿膜載藥等。

在算法方面,基于局部區(qū)域的活動輪廓模型對于初始化輪廓較為敏感,所以初始化輪廓應(yīng)盡量接近目標(biāo)輪廓,本文采用圓形或者橢圓形能達(dá)到良好的分割效果,同時也能提高分割效率。實驗中,改變z軸距離進(jìn)行成像,可能會使細(xì)胞發(fā)生位移,分割所得每層圖像中目標(biāo)細(xì)胞的外輪廓可能不在一條軸線上,所以有時需要對軸線進(jìn)行校正才能保證三維重建得到正確的結(jié)果。由于圖像分割算法采用水平集描述活動輪廓,運算量較大,運行時間相對較慢,但對于不要求實時進(jìn)行的圖像后處理階段還是可以接受的。后期可以通過c-Matlab聯(lián)用或者并行算法提高運算速率,節(jié)省運算時間。三維細(xì)胞以及納米金分布后期還可以通過一些專業(yè)軟件進(jìn)行精細(xì)渲染,并添加一些旋轉(zhuǎn)、平移、縮放功能,實現(xiàn)良好的視覺和互動效果。

本文的最終目的是想了解納米金在細(xì)胞內(nèi)的具體位置,包括具體的細(xì)胞器等的分布,因此后續(xù)研究中還需對不同的細(xì)胞器進(jìn)行標(biāo)記,將納米金的細(xì)胞器分布進(jìn)行重合才會有進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)。而且,如果要對納米金細(xì)胞內(nèi)的代謝進(jìn)行研究時,還需在不同時間段內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記研究,才能發(fā)現(xiàn)更有意義的現(xiàn)象,得出更有價值的結(jié)論。

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(編輯 杜秀杰)

Fluorescence Life Imaging of Gold Nanoparticle-Labeled Cells and Its 3D Reconstruction

YAO Cuiping,ZHOU Xianglian,WANG Jing,WANG Bo,HUANG Kang,ZHANG Zhenxi

(Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

To analyze the distribution and metabolism of gold nanoparticles in cells during the gold nanoparticles-based photodynamic therapy and photo-thermal therapy, the multiphoton fluorescence microscopy was used to image the gold nanoparticles labeled cells, and a region-based active contour model image segmentation algorithm was chosen to process the multiphoton fluorescence images of gold nanoparticles labeled cell. 60 thin slice images were reconstructed for a 3D cell image to draw a three-dimensional model of cell surface. The locations of gold nanoparticles in or on the cell were marked according to the fluorescence lifetime and intensity of gold nanoparticles. The results show that the gold nanoparticles can get into the cells, which is in accordance with the fact that antibody is internalized when the antibody combines with antigen. This technology is expected to more comprehensively investigate the interaction between gold nanoparticles and cell as well as the specific distribution of gold nanoparticles, for instance, in a certain cell organelle.

fluorescence lifetime imaging; gold nanoparticle; 3D reconstruction

2015-07-15。 作者簡介:姚翠萍(1971—),女,副教授。 基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(61575156);國家自然科學(xué)基金重大國際(地區(qū))合作研究資助項目(61120106013)。

時間:2016-01-04

10.7652/xjtuxb201604023

R318.15

A

0253-987X(2016)04-0153-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http:∥www.cnki.net/kcms/detail/61.1069.T.20160104.1837.004.html