蔡傳書 王培榮 黃 雄 呂文龍

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，福建 福州 350005)

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5種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

蔡傳書 王培榮 黃 雄 呂文龍

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，福建 福州 350005)

目的 探討CD133、滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原-2(TROP-2)、CD44、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ABCG2)及神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75(p75NTR)五種腫瘤干細(xì)胞(CSC)標(biāo)志物在非小細(xì)胞肺癌(NSCIC)組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。方法 選取80例NSCLC組織、33例癌旁組織、28例正常組織為研究對象，采用免疫組化法檢測各組織中CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR蛋白表達(dá)的差異，分析其與NSCLC患者病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果 (1)CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在NSCLC組織中的陽性率分別為80.00%、87.50%、50.00%、62.50%、68.75%；在癌旁組織中的陽性率分別為6.06%、30.30%、15.15%、21.21%、12.12%；在正常組織中的陽性率分別為46.43%、10.71%、21.43%、21.43%、21.43%，各指標(biāo)在不同組織間的陽性率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)隨著細(xì)胞分化程度的降低，NSCLC組織中的CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的陽性率均呈上升趨勢(P<0.05)，CD133、TROP-2陽性率與NSCIC患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，ABCG2及p75NTR陽性率與NSCIC患者年齡及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 NSCLC組織中CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的表達(dá)水平異常，且均與NSCLC腫瘤細(xì)胞分化密切相關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；腫瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞(CSC)是腫瘤組織中具有自我更新、增殖以及多向分化的腫瘤細(xì)胞，也是腫瘤不斷生長、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)根源〔1〕。CD133是一種經(jīng)典的CSC標(biāo)志物〔2，3〕，眾多研究表明，滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原-2(TROP-2)、CD44、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ABCG2)及神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75(p75NTR)等也具有CSC特性，可以作為CSC篩選標(biāo)志物，與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、侵襲息息相關(guān)〔4，5〕。本研究采用免疫組化法檢測CSC標(biāo)記物CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、癌旁及正常組織中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 抽選2010年3月至2015年7月在我院行手術(shù)切除術(shù)的80例NSCLC患者，留取手術(shù)組織標(biāo)本存檔。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床上均經(jīng)組織學(xué)檢查，確診為NSCLC；②患者術(shù)前均未予以放、化療治療或者其他抑制腫瘤治療，排除其他類型肺癌患者。男30例，女50例，年齡44～73歲，平均(62.8±8.6)歲。取33例癌旁組織、28例正常組織進(jìn)行檢測，其中癌旁組織男12例，女21例，年齡48～77歲，平均(63.8±9.1)歲。正常組織：其中男10例，女18例，年齡45～75歲，平均(62.9±8.9)歲。三組性別、年齡資料比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑 CD133多克隆抗體購自英國Abcam公司。ABCG2、p75NTR、EnVisionTM檢測試劑盒購自Gene Tech公司，CD44兔抗人抗體購自武漢博士德公司，羊抗人TROP-2多抗購自美國R&D公司，DAB顯色劑(DAB003)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法 所有組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋組織，連續(xù)切片，厚度4 μm，利用二甲苯和乙醇脫蠟水化等處理。切片入pH6.0檸檬酸緩沖液進(jìn)行沖洗，高溫、高壓抗原修復(fù)。自來水沖洗冷卻至室溫后，采用PBS進(jìn)行液洗3次，5 min/次。用3% H2O2滴加至切片上，室溫孵育30 min，繼而PBS洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，每張切片上滴加50 μl稀釋后的CD133多克隆抗體、ABCG2、p75NTR、CD44兔抗人抗體、羊抗人TROP-2多抗；濕盒內(nèi)孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加EnVisionTM試劑盒試劑1，室溫孵20 min，繼而PBS洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加EnVisionTM試劑盒試劑2，室溫孵育30 min，繼而PBS 洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加DAB 顯色液，封片，顯微鏡下觀察，用PBS磷酸緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 由2名病理醫(yī)生在對標(biāo)本資料不知情的情況下獨(dú)立完成。標(biāo)準(zhǔn)：DAB陽性染色為棕色或黃色，計數(shù)4個不重疊的高倍視野下大約200個癌細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)>10%為陽性，≤10%為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件，計量資料組間采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 5種CSC標(biāo)志物在NSCIC、癌旁組織、正常組織中的表達(dá) CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在NSCLC組織中的陽性率分別為80.00%、87.50%、50.00%、62.50%、68.75%；在癌旁組織中的陽性率分別為6.06%、30.30%、15.15%、21.21%、12.12%；在正常組織中的陽性率分別為46.43%、10.71%、21.43%、21.43%、21.43%，各指標(biāo)在不同組織間的陽性率比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.2 5種CSC標(biāo)志物表達(dá)與NSCIC病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。隨著細(xì)胞分化程度的降低，NSCLC組織中的CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的陽性率均呈上升趨勢(P<0.05)；此外，CD133、TROP-2陽性率與NSCIC患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，ABCG2及p75NTR陽性率與NSCIC患者年齡及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

表1 5種CSC標(biāo)志物表達(dá)與NSCIC病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

臨床病理參數(shù)nCD133(n=64)陽性率 P值CD44(n=70)陽性率 P值TROP-2(n=40)陽性率 P值A(chǔ)BCG2(n=50)陽性率 P值p75NTR(n=55)陽性率 P值年齡(歲)<653621(58.33)<0.0527(75.00)>0.0513(36.11)<0.0517(47.22)<0.0519(52.78)<0.05≥654443(97.73)43(97.72)27(61.36)33(75.00)36(81.82)性別男3024(80.00)>0.0529(96.67)>0.0516(53.33)>0.0520(66.67)>0.0520(66.67)>0.05女5040(80.00)41(82.00)24(48.00)30(60.00)35(70.00)吸煙指數(shù)<4004534(75.56)>0.0540(88.89)>0.0522(48.89)>0.0530(66.67)>0.0530(66.67)>0.05≥4003530(85.71)30(85.71)18(51.43)20(57.14)25(71.43)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有1612(75.00)>0.0515(93.75)>0.058(50.00)>0.0515(93.75)<0.0515(93.75)<0.05無6452(81.25)55(85.94)32(50.00)35(54.69)40(62.50)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有3028(93.33)<0.0528(93.33)>0.0523(76.67)<0.0520(66.67)>0.0522(73.33)>0.05無5036(72.00)42(84.00)17(34.00)30(60.00)33(66.00)TNM分期Ⅰ3625(69.44)<0.0531(86.11)>0.0510(27.78)<0.0520(55.56)>0.0527(75.00)>0.05Ⅱ1915(78.95)17(89.47)10(52.63)13(68.42)13(68.42)Ⅲ2524(96.00)22(88.00)20(80.00)17(68.00)15(60.00)腫瘤長徑<3cm4534(75.56)>0.0541(91.11)>0.0523(51.11)>0.0529(64.44)>0.0530(66.67)>0.05≥3cm3530(85.71)29(82.86)17(48.57)21(60.00)25(71.43)細(xì)胞分化高分化2717(62.96)<0.0521(77.78)<0.059(33.33)<0.0513(48.15)<0.0513(48.15)<0.05中分化4035(87.50)36(90.00)20(50.00)24(60.00)29(72.50)低分化1312(92.31)13(100.00)11(84.62)13(100.00)13(100.00)病理類型鱗癌3529(82.86)>0.0532(91.43)>0.0520(57.14)>0.0522(62.86)>0.0526(74.29)>0.05腺癌2519(76.00)21(84.00)11(44.00)18(72.00)18(72.00)肺泡細(xì)胞癌1512(80.00)13(86.67)9(60.00)10(66.67)11(73.33)大細(xì)胞未分化54(80.00)4(80.00)000

3 討 論

現(xiàn)代腫瘤手術(shù)、放化療、生物治療技術(shù)均在不斷進(jìn)步，但隨著放化療抵抗的發(fā)生，NSCLC等腫瘤患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率、臨床死亡率仍居高不下〔6，7〕，故尋找NSCLC治療的新靶點(diǎn)，對患者個體化治療及預(yù)后具有重要臨床價值。近年研究發(fā)現(xiàn)，靶向CSC是根治腫瘤的一個臨床新方向〔8〕，CSC是腫瘤細(xì)胞中的特殊細(xì)胞，具有極強(qiáng)的自我更新、分化能力，發(fā)揮多種功能；此外，CSC具有較強(qiáng)遷徙以及運(yùn)動能力，可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，引發(fā)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等〔9，10〕，另外，CSC還可長期維持正常機(jī)體的相對穩(wěn)定休眠狀態(tài)，有較強(qiáng)的耐藥性。有研究認(rèn)為〔11〕，CSC是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)的源泉，腫瘤生長以及分化最終取決于其組織中CSC表達(dá)，同時腫瘤本身具有轉(zhuǎn)移潛力，當(dāng)機(jī)體CSC表達(dá)達(dá)到一定程度時，腫瘤的轉(zhuǎn)移將不可避免。研究人員近年來相繼在膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌等中發(fā)現(xiàn)CSC表達(dá)〔12〕，而NSCLC組織中的CSC表達(dá)及作用機(jī)制一直存在較大爭議。研究發(fā)現(xiàn)，肺組織中存在細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞(BASCs)，這為CSC對肺癌的發(fā)病作用提供了實驗依據(jù)〔13〕。

CD133是Prominin 家族成員，存在于外周血、骨髓、臍帶血及其他組織中〔14〕，CD133+對腫瘤增殖、分化、復(fù)發(fā)有著關(guān)鍵作用〔15，16〕。有研究發(fā)現(xiàn)，CD133+表達(dá)與腫瘤預(yù)后相關(guān)，高水平的CD133結(jié)直腸癌病人預(yù)后較差〔17〕。本研究提示CD133在NSCLC組織中異常高表達(dá)，同時腫瘤細(xì)胞分化程度越低、TNM分期越高，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的陽性表達(dá)率越高，這說明CD133陽性表達(dá)參與了NSCLC腫瘤干細(xì)胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移等過程。

CD44是一種廣泛存在于表皮細(xì)胞與間皮細(xì)胞中的黏附分子，主要參與異質(zhì)性黏附，即腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞和宿主基質(zhì)的黏附，異質(zhì)性黏附在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用，與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔18〕。國外文獻(xiàn)報道，CD44在前列腺癌組織中表達(dá)升高，與癌細(xì)胞生長存在相關(guān)性〔19〕。國內(nèi)有研究〔20〕報道，CD44在NSCLC組織中的陽性率為65.33%，明顯高于正常肺組織的20.00%且CD44過量表達(dá)患者的生存率低于正常水平者。本研究與上述研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實CD44的異常表達(dá)與NSCLC的發(fā)病有關(guān)。此外，本研究中CD44陽性表達(dá)率隨著腫瘤細(xì)胞分化程度的降低而呈上升趨勢，提示CD44陽性表達(dá)影響著NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。

TROP-2是一種跨膜糖蛋白，在正常人體合包體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層及復(fù)層上皮細(xì)胞均存在表達(dá)，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移的作用。近年來，已證實TROP-2在鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等許多實體瘤中表達(dá)水平增高〔21〕。本文結(jié)果也說明TROP-2與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

ABCG2是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在維持細(xì)胞自身穩(wěn)定及機(jī)體正常生理功能等方面起著重要作用，主要定位于細(xì)胞膜上，正常生理下可保護(hù)機(jī)體，而對腫瘤而后則可導(dǎo)致其耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)僅在干細(xì)胞上表達(dá)，具有分化調(diào)節(jié)干細(xì)胞作用〔22〕。p75NTR是腫瘤壞死因子受體成員，主要在神經(jīng)細(xì)胞的早期發(fā)育過程中大量表達(dá)，通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)以神經(jīng)細(xì)胞為主的細(xì)胞增殖、遷移、分化、生存、凋亡、突觸的建立和神經(jīng)的形成,發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)。早期認(rèn)為p75NTR僅參與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育早期的增殖、遷移、凋亡，近年來研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR陽性細(xì)胞自我更新、增殖及多向分化能力較強(qiáng)，證實為食管上皮CSC〔23〕。本研究結(jié)果顯示，ABCG2及p75NTR的表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮作用，但其相關(guān)性仍需加大樣本量分析。

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〔2016-07-15修回〕

(編輯 郭 菁)

蔡傳書(1965-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤診斷與放射治療方面的研究。

R73

A

1005-9202(2016)23-5905-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.058