王鳳琴 章許晶

(武漢市第三人民醫(yī)院耳鼻喉科，湖北 武漢 430060)

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黏著斑激酶在鼻咽癌細(xì)胞系6-10B中的表達(dá)及其對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

王鳳琴 章許晶

(武漢市第三人民醫(yī)院耳鼻喉科，湖北 武漢 430060)

目的 探討?zhàn)ぶ呒っ?FAK)在鼻咽癌細(xì)胞6-10B中的表達(dá)及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的影響。方法 鼻咽癌細(xì)胞6-10B培養(yǎng)后利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)下調(diào)FAK在6-10B中的表達(dá)水平，通過(guò)RT-PCR、Real-time PCR、Western印跡檢測(cè)其干擾效率，通過(guò)Western印跡檢測(cè)干擾后凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，通過(guò)Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。結(jié)果 干擾后 FAK在鼻咽癌細(xì)胞6-10B中表達(dá)量較低、下調(diào)明顯(P<0.05)；鼻咽癌細(xì)胞系6-10B干擾FAK后，Bcl-2和Bax的表達(dá)量發(fā)生較明顯改變(P<0.05)；Hoechst染色結(jié)果顯示干擾后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。結(jié)論 干擾FAK后促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，提示可以通過(guò)下調(diào)FAK表達(dá)水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，為鼻咽癌的基因治療提供新的思路。

黏著斑激酶；鼻咽癌細(xì)胞；RNA干擾；凋亡相關(guān)蛋白

鼻咽癌(NPC)是一種具有區(qū)域特性的惡性腫瘤，發(fā)病過(guò)程與環(huán)境致癌因素、遺傳易感性和EB病毒相關(guān)〔1〕。黏著斑激酶(FAK)是一種細(xì)胞質(zhì)非受體型蛋白酪氨酸激酶，屬于黏附斑復(fù)合物家族。FAK在貼壁細(xì)胞中起抗凋亡作用，具體的分子機(jī)制不很清楚〔2〕。但有研究表明FAK對(duì)腫瘤增殖、生存、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成等行為起著重要的調(diào)控作用〔3，4〕，因此被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生進(jìn)程的關(guān)鍵分子之一，可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的能特異性地靶向特定序列的mRNA，并進(jìn)一步促進(jìn)其發(fā)生降解，從而導(dǎo)致基因沉默的一種方式〔5〕。本實(shí)驗(yàn)觀察FAK基因表達(dá)下調(diào)對(duì)NPC細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 NPC細(xì)胞系6-10B由本實(shí)驗(yàn)室保存，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶購(gòu)自研科生物公司；一抗及二抗購(gòu)自武漢三鷹公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Costar公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自abm公司；qPCR 試劑盒(SYBR Green I)購(gòu)自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce Chemical公司，5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、SDS、吐溫緩沖液(Tris)、甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、過(guò)硫酸銨、脫脂奶粉購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D-Hank緩沖液為自行配制。

1.1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司；高速冷凍離心機(jī)為Heraeus公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；T1 Thermocycler PCR儀為Biometra公司產(chǎn)品；RNA濃度測(cè)量?jī)xNanodrop2000購(gòu)自Thermo Scientific公司；光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；-80℃冰箱為中國(guó)海爾集團(tuán)產(chǎn)品；板式酶標(biāo)儀購(gòu)自北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.3 引物 引物序列:GAPDH上游引物：GAGATCCCTCCAAAATCAAGTG，下游引物：GAGTCCTTCCACGATACCAAAG；產(chǎn)物長(zhǎng)度282 bp，退火溫度58℃,循環(huán)數(shù)30個(gè)；siRNA上游引物：GCGAAATCCATAGCAGGCCACTATAGTGAGTCGTATTACC，下游引物：ACGTGGCCTGCTATGGATTTCTATAGTGAGTCGT ATTACC，產(chǎn)物長(zhǎng)度127 bp，退火溫度55℃，循環(huán)數(shù)30個(gè)；FAK上游引物：TGGTGCAATGGAGCGAGTATT，下游引物：CAGTGAACCTCCTCTGACCG，產(chǎn)物長(zhǎng)度279 bp，退火溫度60℃，循環(huán)數(shù)38個(gè)。由銳博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA制備 Non-target siRNA作為陰性對(duì)照。特異性干擾FAK的靶序列所對(duì)應(yīng)的mRNA序列siFAK：5′-GCGAAATCCATAGCAGGCCACTATAGTGAGTCGTATTACC-3′;Non-targeting siRNA的靶序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染NPC細(xì)胞系6-10B 將生長(zhǎng)在RPMI1640(10%小牛血清)中的NPC細(xì)胞系6-10B，以106的密度接種于六孔板中，24 h后觀察細(xì)胞密度達(dá)60%～80%。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染混合液：A液(100 μl)：3 μl lipofectamin RNAiMAX+97 μl Opti-MEM；B液(100 μl)：5 μl siRNA(終濃度為100 nmol/L)+95 μl Opti-MEM。A、B液混合，室溫靜置12 min，加入3 500 μl全血清培養(yǎng)基，混合后將液體加入培養(yǎng)基內(nèi)，左右移動(dòng)，使其充分混勻細(xì)胞表面，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后收集細(xì)胞，抽提RNA和蛋白，檢測(cè)干擾效果，進(jìn)一步分析FAK的表達(dá)水平及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。

1.2.3 細(xì)胞總RNA的提取 制備總RNA的器皿需要去RNase處理：玻璃器皿洗凈后，180℃烤箱烤8 h左右；塑料制品用含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的無(wú)菌水浸泡24 h，高壓滅菌，烤干備用。

1.2.4 RNA的制備 取細(xì)胞1瓶，約1×106個(gè)細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.2，0.01 mol/L)洗滌2次，加入TRIzol 1 ml，反復(fù)吹打均勻；置冰上8 min，加入氯仿200 μl，上下顛倒3次，冰上靜置8 min，12 500 r/min，4℃離心20 min，吸取上層液體，加異丙醇500 μl，置于-20℃靜置30 min，13 000 r/min 4℃離心15 min，75%乙醇洗滌，用無(wú)酶水溶解，-80℃保存。

1.2.5 總RNA的鑒定 1.2%瓊脂糖凝膠，電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，測(cè)定濃度。

1.2.6 兩步法差異RT-PCR 按abm說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)條件：RT-PCR：42℃ 50 min，85℃ 5 min，-20℃保存；qPCR：25℃ 10 min，42℃ 15 min，置-20℃保存。根據(jù)每個(gè)樣本RNA濃度不同，取1～5 μl不等。

1.2.7 PCR反應(yīng) RT-PCR反應(yīng)體系：10×Mix(10 μmol/L)2 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl ，滅菌雙蒸水16 μl，總體系20 μl。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30～34個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。

qPCR反應(yīng)體系：SYBR Green(2×)10 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，滅菌雙蒸水8 μl，總體系20 μl。每個(gè)樣品同時(shí)做FAK和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，重復(fù)3個(gè)孔，反應(yīng)條件：第一階段：95℃ 10 s，1個(gè)循環(huán)；第二階段：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析由PCR儀自動(dòng)完成。

1.2.8 免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

1.2.8.1 蛋白樣品的獲得 (1)蛋白裂解液的配制(100 μl體系)，100×蛋白酶抑制劑1 μl，蛋白裂解液加至100 μl。(2)蛋白抽提，用預(yù)冷的D-Hank液清洗3次轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞，每一個(gè)孔加入蛋白裂解液，將其置于冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮刀將孔中細(xì)胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，在4℃ 離心機(jī)中以12 000 r/min的速度離30 min，離心完畢后將其取出置于冰上，分裝備用。

1.2.8.2 BCA法蛋白定量 采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進(jìn)行。

1.2.8.3 蛋白變性 按比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，置于金屬浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷卻，最后放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8.4 Western印跡分析 (1)電泳：根據(jù)待檢測(cè)蛋白質(zhì)的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每泳道上樣40 μg，先70 V電泳30 min，再130 V電泳至溴酚藍(lán)染料跑出膠后停止電泳，冰上進(jìn)行。(2)轉(zhuǎn)膜：斷掉電源，取出電泳板，根據(jù)樣品數(shù)量及蛋白分子量大小剪下合適大小的膠，用尺子量好長(zhǎng)和寬后放置于盛有轉(zhuǎn)膜液的平皿中。根據(jù)膠的尺寸大小裁剪合適孔徑的聚偏氟乙烯(PVDF)膜以及專用濾紙，按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙順序放置，將轉(zhuǎn)膜板卡緊，放入轉(zhuǎn)膜槽中，打開(kāi)電源100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1～2 h(根據(jù)蛋白的大小不同而不同，蛋白分子量大的轉(zhuǎn)膜時(shí)間久)。(3)封閉：5%脫脂牛奶，用TBST稀釋，室溫封閉1 h。(4)一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書(shū)用TBST將一抗稀釋到適合的比例。 (5)洗膜：TBST液體洗滌3次，每次10～15 min。(6)二抗孵育：根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用一抗的種屬選擇對(duì)應(yīng)的二抗，并用TBST將二抗稀釋到適合的比例，并將其置于搖床上室溫孵育1 h。(7)洗膜：同上。(8)顯影：在膜表面滴入適量的HRP化學(xué)顯影液，使之覆蓋膜的整個(gè)表面，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.3 Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 將生長(zhǎng)在RPMI1640(10%小牛血清)中的鼻咽癌細(xì)胞系6-10B，以105的密度接種于六孔板中，24 h后觀察細(xì)胞密度達(dá)50%左右，PBS洗3次，加入500 μl Hoechst(1∶2 000)，避光孵育15 min，PBS洗滌，熒光顯微鏡下拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR、qPCR分析轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中FAK基因在mRNA水平的表達(dá) 分別抽提6-10B shFAK和6-10B-shvector細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用于PCR檢測(cè)，所用引物為跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段大小為279 bp。

以內(nèi)對(duì)照GAPDH為參照，6-10B shFAK與6-10B-shvector細(xì)胞相比，6-10B shFAK細(xì)胞中可檢測(cè)到FAK的表達(dá)明顯下調(diào)，qPCR顯示下調(diào)達(dá)80%以上。

2.2 兩組細(xì)胞的總蛋白 shFAK 組中Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bax/Bcl-2比值上升，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1，表1。

表1 蛋白表達(dá)量的灰度分析

基因灰度值干擾前干擾后t值P值FAK613620199534124.1570.000Bcl-226426716045920.1660.002Bax16806873621257.1260.000

圖1 Western印跡檢測(cè)干擾FAK后凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)水平

2.2 Hoechst染色結(jié)果 干擾FAK后藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)，并且細(xì)胞核出現(xiàn)明顯固縮，甚至出現(xiàn)凋亡小體(圖2)。

圖2 Hoechst染色結(jié)果顯示干擾FAK后細(xì)胞核形態(tài)改變

3 討 論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，在包括食管癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中，F(xiàn)AK的核酸及蛋白水平處于高表達(dá)和過(guò)度激活的狀態(tài)〔6〕。FAK表達(dá)異常升高與腫瘤細(xì)胞增殖、逃避凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲具有密切關(guān)系，通過(guò)抑制FAK表達(dá)或許能成為抑制腫瘤惡性表型發(fā)生的關(guān)鍵〔7〕。因此，抑制FAK的表達(dá)有望成為腫瘤基因治療的新熱點(diǎn)。Tavora等〔8〕研究表明，在內(nèi)皮細(xì)胞中沉默F(xiàn)AK 對(duì)血管本身的功能沒(méi)有明顯影響，但是在血管周的腫瘤細(xì)胞和阿霉素放射治療老鼠中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，增殖減少。許呂宏等〔9〕的研究表明：FAK基因的表達(dá)能夠顯著提高白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，其結(jié)果在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也得到了充分證實(shí)。提示靶向降低FAK 基因表達(dá)水平有望成為治療惡性腫瘤的新方法。劉華聯(lián)等〔10〕的研究表明沉默F(xiàn)AK基因可以促使失巢凋亡，從而使舌癌細(xì)胞失巢凋亡抗性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，是一個(gè)潛在的抗舌癌轉(zhuǎn)移分子治療的靶點(diǎn)。

Bcl-2是一種與凋亡有關(guān)的基因，也是最為主要的調(diào)控細(xì)胞發(fā)生凋亡的基因。Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用，Bax對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用〔4〕。Bax可以和Bcl-2形成同源或異源二聚體來(lái)共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程。Bcl-2與細(xì)胞凋亡存在負(fù)相關(guān)，而B(niǎo)ax則情況相反〔11，12〕。

FAK在NPC組織中的表達(dá)鮮有報(bào)道。筆者認(rèn)為，抑制FAK基因的表達(dá)可促進(jìn)NPC細(xì)胞凋亡。

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〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

章許晶(1984-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事耳鼻喉科疾病研究。

王鳳琴(1971-)，女，主管護(hù)師，主要從事耳鼻喉科疾病護(hù)理研究。

R739.6

A

1005-9202(2016)23-5844-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.031