劉 偉 徐 鑫 王英芳 許文華

(河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050200)

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光敏劑喜泊分對H22肝癌小鼠移植瘤的放射增敏效果

劉 偉 徐 鑫1王英芳 許文華

(河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050200)

目的 觀察光敏劑喜泊分對H22肝癌小鼠移植瘤的放射增敏效果。方法 建立H22肝癌細(xì)胞小鼠移植瘤模型，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為對照組、放療1組、聯(lián)合治療1組、放療2組、聯(lián)合治療2組、放療3組、聯(lián)合治療3組，觀察第14天瘤體積、抑瘤率、增敏系數(shù)、小鼠生存時間、病理、細(xì)胞凋亡等指標(biāo)。結(jié)果 喜泊分聯(lián)合放療能夠抑制小鼠移植瘤生長，尤其聯(lián)合治療2組，第14天瘤體積明顯減小、增敏系數(shù)>1，有最佳增敏效果，能夠明顯延長小鼠生存時間，病理HE染色顯示，聯(lián)合治療2組腫瘤細(xì)胞壞死數(shù)量最多，壞死范圍最大，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡顯示聯(lián)合治療2組凋亡率最高。結(jié)論 喜泊分聯(lián)合放療可以有效減小瘤體積，提高抑瘤率，延長小鼠生存時間，促使細(xì)胞凋亡，具有良好的放射增敏效果。

肝癌；喜泊分；抑瘤率；放射增敏；凋亡

目前治療肝癌的方法不斷改進(jìn)，主要有手術(shù)切除、放化療、肝臟移植、細(xì)胞免疫等治療方法，但總體來說，對肝癌的治療仍然是很局限的，在預(yù)防方面和治療手段的選擇上都不太成熟〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)通過對H22肝癌細(xì)胞小鼠移植瘤模型的研究，測試國產(chǎn)光敏劑血卟啉衍生物喜泊分對X線照射的抑瘤增敏作用，闡明其與放療結(jié)合增加射線對肝癌放射敏感性的潛在意義及增敏程度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠H22腹水型肝癌細(xì)胞株，由河北醫(yī)科大學(xué)提供；6周齡健康雄性SPF級昆明小鼠，體重20～25 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；電子分析天平JA5003(上海精科水平廠)；CO2恒溫培養(yǎng)箱 TC2323(美國SHELDON公司)；普通光學(xué)顯微鏡 BX-50(日本Olympus)；細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技公司；放療設(shè)備由河北省人民醫(yī)院腫瘤放療科提供，直線加速器：SIMENS PRIMUS型。

1.2 細(xì)胞株復(fù)蘇及傳代培養(yǎng) 將小鼠H22肝癌細(xì)胞從液氮中取出，置入37℃水浴中復(fù)蘇，置于DMEM培養(yǎng)液中離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)顯微鏡下細(xì)胞生長狀況進(jìn)行細(xì)胞換液與傳代，每2～3 d換液1次。待細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)瓶底時，1∶3分瓶傳代。

1.3 小鼠腹水傳代及模型建立 體外培養(yǎng)傳代生長良好的H22小鼠肝癌細(xì)胞以無菌生理鹽水配成濃度為1.0×107/ml，取健康昆明小鼠3只，腹部用75%酒精嚴(yán)格消毒，腹腔內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞懸液0.5 ml/只，接種后8 d可見小鼠腹部增大，抽取小鼠腹水，用生理鹽水稀釋至5×106個瘤細(xì)胞/ml后小鼠腹腔3次傳代，腹水形成后，于無菌條件下收集腫瘤細(xì)胞生長良好的腹水，參照有關(guān)文獻(xiàn)〔3，4〕，臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生存率>99%、HE 染色見大量腫瘤細(xì)胞時可用。用生理鹽水將腹水稀釋至約 2×106個瘤細(xì)胞/ml，取健康昆明小鼠80只，75%酒精消毒小鼠右前肢皮膚后皮下注射腫瘤細(xì)胞懸液0.2 ml，可見局部有黃豆大小皮丘隆起，觀察1 min，如無瘤液溢出，送回飼養(yǎng)籠。接種后第3天注射部位可觸及腫瘤結(jié)節(jié)，第7天結(jié)節(jié)平均體積可達(dá)到0.8 cm左右，視為模型制作成功，模型制作成功率為100%。選取腫瘤長徑為5.5～6.5 mm結(jié)節(jié)形狀較規(guī)則、與肌肉皮膚無粘連小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 荷瘤小鼠隨機(jī)分組及處理 將H22皮下移植肝癌荷瘤小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、放療1組(5 Gy組)、聯(lián)合治療1組(5 Gy+15 mg/kg喜泊分組)、放療2組(10 Gy組)、聯(lián)合治療2組(10 Gy+15 mg/kg喜泊分組)、放療3組(15 Gy組)、聯(lián)合治療3組(15 Gy+15 mg/kg喜泊分組)共7組，每組10只，共80只予背部皮膚墨水標(biāo)記，分籠飼養(yǎng)。具體處理如下。

1.5 觀察腫瘤體積變化、計算腫瘤生長抑制率并繪制腫瘤生長曲線 治療開始后動態(tài)觀察各組腫瘤外觀、質(zhì)地、活動度等生長情況。用游標(biāo)卡尺每隔1 d測量各處理組腫瘤的最長徑(LD)及最短徑(SD)并詳細(xì)記錄，直至治療開始后第14天。按照Steel經(jīng)驗(yàn)公式計算腫瘤體積如下：腫瘤體積(mm3)V=LD×SD2/2。根據(jù)各組平均體積繪制腫瘤生長曲線。

1.6 腫瘤生長延緩時間與增敏系數(shù) 計算腫瘤生長3倍倍增時間(TGT3)：腫瘤體積生長至放射治療前3倍所需時間為3倍倍增時間。腫瘤生長延遲時間(TGD)：不同實(shí)驗(yàn)組與空白對照組的TGT3之差為腫瘤生長延遲時間。增敏系數(shù)(EF)=給藥照射組TGD/單純照射組TGD，EF>1表示有放射增敏效應(yīng)，EF>1.6說明有較好的放射增敏效應(yīng)。

1.7 荷瘤小鼠生存期觀察并繪制生存曲線 治療第14天各組剩余6只荷瘤小鼠不處死，繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)，讓其無干預(yù)病死，觀察各組小鼠生存期，計算其生命延長率，并根據(jù)生存時間繪制小鼠生存曲線。生命延長率計算公式如下：生命延長率=(治療組平均生存天數(shù)-對照組平均生存天數(shù))/對照組平均生存天數(shù)×100%。

1.8 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查 將小鼠腫瘤組織保存、固定、浸蠟、包埋，制作成蠟塊，連續(xù)切片制作成厚度約5 μm 的石蠟切片，HE 常規(guī)染色，顯微鏡下觀察各組切片腫瘤組織壞死情況。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況 將每組剝離腫瘤部分組織剪成黃豆大小腫瘤組織小塊(約8×8 mm3大小)，置于于70%酒精4℃冰箱中保存，檢測時將組織取出(出血壞死部分切除)研磨-過濾-離心-棄上清液-上機(jī)分析，處理后上流式細(xì)胞儀檢測腫瘤組織凋亡情況。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法。

2 結(jié) 果

2.1 各組第14天腫瘤體積及生長抑制率 各治療組瘤體積控制及腫瘤生長抑制率均優(yōu)于對照組(P<0.05)，以聯(lián)合治療2組效果最明顯，見表1，圖1。

2.2 腫瘤生長延緩時間與EF 3個聯(lián)合治療組EF均大于1，使單獨(dú)放療的敏感性提高1.722 5倍，聯(lián)合治療2組>聯(lián)合治療1組>聯(lián)合治療3組。說明3組均能延緩腫瘤生長，具有放療增敏作用。其中聯(lián)合治療2組EF最大。見表2。

組別瘤體積(mm3)生長抑制率(%)對照組5827.1±191.104650放療1組4400.7±311.0284224.481)聯(lián)合治療1組4098.0±245.665081)2)29.671)2)放療2組3797.6±212.754011)34.831)聯(lián)合治療2組2923.9±177.38561)2)49.821)2)放療3組2962.9±202.122321)49.151)聯(lián)合治療3組2798.9±171.118191)52.121)

與對照組比較：1)P<0.05；與同劑量放療組比較：2)P<0.05

圖1 各組移植瘤生長曲線

組別TGT3(d)TGD(d)EF對照組5.110-放療1組7.0421.932-聯(lián)合治療1組7.92092.81091.4549放療2組8.79593.6859-聯(lián)合治療2組11.458956.348951.7225放療3組12.102466.992-聯(lián)合治療3組13.231368.121361.16152

2.3 荷瘤小鼠生存期及生命延長率 各治療組均能提高生命延長率，聯(lián)合治療2組效果最明顯，見表3。

組別平均生存天數(shù)(d)生命延長率(%)對照組18.00±1.825740放療1組22.00±2.1602522.201)聯(lián)合治療1組27.00±2.449491)50.001)放療2組30.75±1.50001)70.831)聯(lián)合治療2組43.25±2.753791)2)140.281)2)放療3組39.50±2.081671)119.401)聯(lián)合治療3組37.00±2.708011)105.601)

與對照組比較：1)P<0.05；與其他各組比較：2)P<0.05

2.4 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查 處理組小鼠H22實(shí)體瘤細(xì)胞形態(tài)鏡下觀察，與對照組比較，出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞減少，壞死，染色質(zhì)固縮濃染，有的呈半月形，緊貼于核膜周邊，部分細(xì)胞裂解為碎片狀，以聯(lián)合治療2組最為明顯，腫瘤細(xì)胞壞死數(shù)量最多，壞死范圍最大。見圖2。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況 放療組、聯(lián)合治療1組、放療2組、聯(lián)合治療2組、放療3組、聯(lián)合治療3組凋亡率分別為7.72%、17.73%、26.39%、32.89%、31.84%、31.67%，較對照組凋亡率(3.37%)增加，均出現(xiàn)亞二倍體峰(凋亡峰)，且聯(lián)合治療2組凋亡峰值最高。

圖2 各組移植瘤病理觀察(HE，×400)

3 討 論

目前手術(shù)切除仍是肝癌的治療首選方案，然而，多數(shù)肝癌患者就診時已屬中晚期，手術(shù)難以完全切除。即使根治性切除，5 年存活率僅為50%～62.7%，10年存活率為6.3%〔5〕，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率在50%以上〔6〕，且仍以每年25%的速度遞增，復(fù)發(fā)高峰多在術(shù)后1～2年〔7〕。20世紀(jì)90年代中期后三維適形放療(3DCRT)和調(diào)強(qiáng)適形放療(IMRT)等現(xiàn)代放療技術(shù)逐漸成熟，為放療在肝癌治療中的應(yīng)用提供了新的機(jī)會和可能性。關(guān)于采用3DCRT和IMRT技術(shù)治療不能手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌的研究層出不窮，局限于肝內(nèi)的原發(fā)性肝癌患者行放療結(jié)合介入治療3年生存率為25%～30%〔8〕。國外文獻(xiàn)報道對同時存在肝內(nèi)和肝外病灶(肺、腎上腺、軟組織轉(zhuǎn)移)者，每位患者平均3. 5個病灶，使用螺旋斷層放療中位生存期為12. 3個月，接受放療的病灶1 年內(nèi)局部控制率為79%，且沒有Ⅳ級的不良反應(yīng)〔9〕。放射治療已成為治療肝癌的重要手段之一。

放射治療是在保存器官的情況下用來控制局部腫瘤的一種治療手段〔10〕。60%～70%以上腫瘤病人在病情的不同階段需要作放射治療。單獨(dú)的放療只對輻射敏感的部分腫瘤有比較好的療效，但是大部分腫瘤對輻射并不十分敏感〔11～13〕。放射增敏劑可提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性及放射線對腫瘤細(xì)胞的殺傷率，增強(qiáng)放療療效，成為腫瘤放射治療的一個重要研究課題。放射增敏劑一詞現(xiàn)已被輻射的化學(xué)修飾劑所取代〔14～18〕，然而目前還沒有令人滿意的放療增敏藥物應(yīng)用于臨床。

本研究的光敏劑喜泊分易溶于水，便于給藥；可被電磁波激發(fā)發(fā)揮殺傷癌細(xì)胞的作用；同時具有對腫瘤的選擇性濃集作用；且對重要臟器無明顯毒副反應(yīng)，預(yù)期對腫瘤有更好的放射增敏效果。其腫瘤放射增敏作用的研究則是本次實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。因其應(yīng)用尚未被廣泛認(rèn)可，在進(jìn)行該研究時有必要先采用動物實(shí)驗(yàn)的方法探索合適的聯(lián)合方式及安全的用藥劑量。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示喜泊分可以促使細(xì)胞從放射最不敏感的S 期進(jìn)入G2/M期，并將細(xì)胞阻滯在放射敏感性最高的G2/M期，使腫瘤細(xì)胞更易進(jìn)入X射線誘導(dǎo)的凋亡途徑，具有良好的放射增敏效果。

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〔2014-10-17修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢園)

河北省科技計劃項(xiàng)目(152777124)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項(xiàng)目(2014159)；河北中醫(yī)學(xué)院青年基金項(xiàng)目(17)

1 河北省人民醫(yī)院

許文華(1980-)，女，碩士，講師，主要從事護(hù)理學(xué)及教育學(xué)研究。

劉 偉(1980-)，女，碩士，講師，主要從事腫瘤綜合防治研究。

R73；R592

A

1005-9202(2016)23-5841-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.030