張艷華 陸 穎 陳 霞

(南通市第一人民醫(yī)院藥劑科,江蘇 南通 226001)

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EZH2抑制劑聯(lián)合順鉑對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響

張艷華 陸 穎 陳 霞

(南通市第一人民醫(yī)院藥劑科,江蘇 南通 226001)

目的 探討EZH2抑制劑UNC1999 聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法 傳代培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞系，取生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞分為對(duì)照組、聯(lián)合用藥組、順鉑組和UNC1999 組。所有組均給予RPMI 1640培養(yǎng)液及10%的胎牛血清培養(yǎng)，對(duì)照組不加藥液，聯(lián)合用藥組分別加入10、20、40、80、160 nmol /L UNC1999 藥液及2.5、5、10、20、40 μg/ml順鉑藥液；順鉑組分別加入2.5、5、10、20、40 μg/ml順鉑藥液；UNC1999 組分別加入10、20、40、80、160 nmol/L 的UNC1999 藥液；采用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率中IC50及聯(lián)合指數(shù)(CI)。Western印跡法檢測(cè)各組相關(guān)凋亡蛋白及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)及p-ERK的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 與對(duì)照組相比，UNC1999組、順鉑組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖均受到不同程度抑制(P<0.05)。各組細(xì)胞增殖抑制作用存在劑量-時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，且UNC1999與順鉑存在協(xié)同作用。UNC1999組、順鉑組、聯(lián)合用藥組與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡差異顯著(P<0.05)。UNC1999組、順鉑組、聯(lián)合用藥組中凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)明顯升高，p-ERK蛋白表達(dá)明顯降低，聯(lián)合用藥組Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 EZH2特異性抑制劑UNC199可能通過(guò)抑制MAPK-ERK細(xì)胞通路起到抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，與順鉑單藥或聯(lián)合均具有協(xié)同效應(yīng)。

EZH2抑制劑;順鉑;ERK信號(hào)通路;非小細(xì)胞肺癌

化療在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的治療中占有重要的地位，而以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案是NSCLC的主要治療手段〔1，2〕。但目前順鉑的耐藥已經(jīng)普遍存在〔3，4〕。胞外信號(hào)調(diào)控激酶(ERK)是真核生物中廣泛存在的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(MAPK)中的一種，通過(guò)整合素進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為有關(guān)〔5〕。果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)基因?qū)儆赑eG基因家族，具有抑制基因和沉默起始基因的作用，在多種腫瘤中都有高表達(dá)，與腫瘤的侵襲增殖、轉(zhuǎn)移等具有密切的關(guān)系〔6，7〕。本研究主要觀察EZH2抑制劑聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細(xì)胞系，RPMI 1640培養(yǎng)液，鼠抗人ERK及磷酸化ERK(p-ERK)、Caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin 單克隆抗體，核糖核酸酶、甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、順鉑、EZH2抑制劑UNC1999。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 取出存有肺癌A549細(xì)胞的凍存管，放于37℃溫水中，用鑷子夾住輕輕搖動(dòng)使其迅速融化。1 000～2 000 r/min，3～5 min離心，無(wú)菌條件下打開(kāi)凍存管，移去上清液，加入1 ml預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞吹散開(kāi)，然后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中。加入4 ml的RPMI 1640培養(yǎng)液及10%的胎牛血清。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液。后加入1 ml消化液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5～8 min后把培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的胞質(zhì)回縮、胞間質(zhì)增大后，終止消化。加入5 ml預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打后，吸取一半的細(xì)胞懸液，以1∶2傳代接種到新的25 cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液至5～10 ml，加10%～20%的胎牛血清。倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103～105個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100～200 μl。同一培養(yǎng)條件，培養(yǎng)1～2 d。吸去原培養(yǎng)基，每孔加入以無(wú)血清培養(yǎng)基配制的不同濃度藥物，分為對(duì)照組、聯(lián)合用藥組、順鉑組和UNC1999 組。對(duì)照組不加藥液，聯(lián)合用藥組分別加入10、20、40、80、160 nmol /L UNC1999 藥液及2.5、5、10、20、40 μg/ml順鉑藥液；順鉑組分別加入2.5、5、10、20、40 μg/ml順鉑藥液；UNC1999 組分別加入10、20、40、80、160 nmol/L的UNC1999 藥液。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 培養(yǎng)24或48 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml，用pH7.4的PBS配制，避光保存)10～20 μl(如每孔培養(yǎng)基為100 μl，加10 μl；如每孔培養(yǎng)基為200 μl，加20 μl)。37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液(對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液)。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，各組取平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。采用Origin7.5軟件計(jì)算抑制細(xì)胞增殖50%的藥物濃度(IC50)及聯(lián)合指數(shù)(CI)。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 根據(jù)MTT計(jì)算的IC50結(jié)果，分別選取三個(gè)用藥組相應(yīng)濃度亞組，即UNC1999 40 nmol/L組，順鉑10 μg/ml組，UNC1999 40 nmol/L+順鉑10 μg/ml組(聯(lián)合用藥組)。胰酶消化，1 ml PBS清洗后移入15 ml BD管中。800 r/min離心5 min，去上清，PBS吹洗，再次離心棄上清，重復(fù)兩次，用0.1 ml冰PBS重懸，移到1.5 ml EP管中。加入濃度為20 μg/ml 的RNase A，37℃孵育30 min，加入PI(10 g/L)，避光30 min，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用CellQuest軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western印跡法檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白 分別收集各亞組細(xì)胞1×107個(gè)，制備蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。沸水中煮5 min使蛋白變性。上樣，電泳4 h，電壓為40 V，轉(zhuǎn)膜，脫色后晾干備用。上搖床5%脫脂牛奶封閉1 h，按預(yù)染Marker標(biāo)記剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入p-ERK抗體(1∶1 000)、ERK(1∶500)、Bcl-2(1∶300)、Caspase-3(1∶250)、β-actin(1∶1 000)及Bax(1∶300)孵育過(guò)夜。用TBST脫色洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶800)，室溫反應(yīng)30 min，ECL法化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件，兩個(gè)樣本間的比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率 與對(duì)照組相比，UNC1999組、順鉑組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖均受到不同程度抑制，且聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于UNC1999組與順鉑組(P<0.05)。各組細(xì)胞增殖抑制作用存在劑量-時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，見(jiàn)表1。根據(jù)結(jié)果計(jì)算IC50值：UNC1999組24、48、72 h的IC50分別為(72.48± 4.38)、(48.89± 3.86)、(23.62±2.16)nmol/L，順鉑組為(25.69±3.49)、(14.95±2.48)、(2.21±1.31)μg/ml。聯(lián)合用藥組24、48、72 h CI值分別為0.825、0.558、0.438，均<1，提示UNC1999與順鉑存在協(xié)同作用。

組別24h48h72h順鉑組(μg/ml)2.57.5±2.31)2)6.5±2.41)2)46.3±3.51)2)564.5±3.41)2)62.3±2.51)2)37.6±2.21)2)1060.3±4.21)2)55.8±5.01)2)27.6±4.31)2)2053.2±2.71)2)48.3±1.81)2)19.3±3.31)4045.6±3.71)2)37.5±3.51)2)17.3±1.81)UNC1999組(nmol/L)1073.2±2.91)2)72.7±1.41)2)64.8±2.61)2)2065.2±1.81)2)63.5±2.61)2)51.7±3.21)2)4059.6±3.31)2)54.6±1.61)2)44.1±2.51)2)8050.2±3.41)2)43.1±2.61)2)28.9±3.21)2)16040.2±4.21)2)31.5±2.41)2)17.4±4.31)聯(lián)合用藥組〔順鉑(μg/ml)/UNC1999(nmol/L)〕2.5/1062.5±4.81)62.5±4.81)38.7±2.91)5/2058.1±4.51)42.3±5.31)27.4±2.31)10/4046.9±2.81)34.1±7.31)18.2±2.51)20/8041.3±1.71)23.5±2.51)18.0±3.340/16027.3±5.21)15.1±1.91)14.7±2.8對(duì)照組101.3±4.5100.5±2.7103.8±1.9

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與聯(lián)合用藥組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況 UNC1999組、順鉑組、聯(lián)合用藥組及對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為6.5%±1.4%、7.2%±2.2%、28.3%±2.5%、1.6%±0.3%。各組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白檢測(cè) UNC1999組、順鉑組、聯(lián)合用藥組中凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)。聯(lián)合用藥組中Bax、Caspase-3表達(dá)也高于UNC1999組和順鉑組；但三組p-ERK蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，且聯(lián)合用藥組低于UNC1999組和順鉑組(P<0.05)；聯(lián)合用藥組Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別BaxCaspase-3Bcl-2p-ERKUNC1999組247.5±4.91)2)163.6±9.41)2)95.4±2.62)41.2±3.41)2)順鉑組371.5±6.61)2)190.2±5.71)2)80.7±4.12)22.4±2.11)2)聯(lián)合用藥組702.9±7.31)837.6±8.51)50.2±3.21)7.2±4.11)對(duì)照組103.2±3.7102.8±2.1103.6±2.9100.3±3.5

3 討 論

PcG基因家族是一類(lèi)與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制子基因，主要包括PRC1和PRC2，PRC1具有抑制基因的作用，PRC2具有沉默起始基因的作用〔8〕。EZH2是PRC2的催化亞基，可抑制H3K27m3和H3K9m3的轉(zhuǎn)錄，從而在染色體水平調(diào)節(jié)基因活性，并干擾細(xì)胞DNA修復(fù)〔9，10〕。UNC1999一種有效的EZH1、EZH2特異性抑制劑，對(duì)EZH2 Y641和EZH2 Y641F突變體有很強(qiáng)的抑制活性，對(duì)細(xì)胞增殖有濃度依賴(lài)性的抑制〔11〕。順鉑具有廣譜抗癌活性，是NSCLC基礎(chǔ)化療藥物之一，能夠與DNA鏈上的G共價(jià)結(jié)合，從而阻斷DNA的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄〔12，13〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，UNC1999可以通過(guò)抑制EZH2抑制細(xì)胞增殖，且具有濃度依賴(lài)性。MTT證實(shí)UNC1999與順鉑聯(lián)用可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，且兩藥有明顯的協(xié)同作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，MEK-ERK抑制劑可以不同程度抑制腫瘤細(xì)胞中EZH1和EZH2基因的表達(dá)，促進(jìn)H3K27me3去甲基化酶的表達(dá)，因此，MEK-ERK信號(hào)通路參與了EZH2基因的調(diào)控，抑制ERK通路可以抑制EZH2基因的表達(dá)〔14，15〕。為闡明機(jī)制，本研究檢測(cè)了相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC50的UNC1999組、順鉑組及聯(lián)合用藥組中Bax、Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，而p-ERK蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組。表明UNC1999及順鉑均可以抑制p-ERK蛋白表達(dá)，而且二者聯(lián)合作用更為明顯。二者可能通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路的激活來(lái)促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡。

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〔2015-12-15修回〕

(編輯 徐 杰)

張艷華 (1971-),男，副主任藥師，主要從事藥物臨床應(yīng)用研究。

R73

A

1005-9202(2016)23-5839-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.029