林 嵐 楊 淑 沈云松 蓋雪松 梅 茸 唐 浩

(云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650032)

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膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇組織高遷移率族蛋白B1的表達(dá)

林 嵐 楊 淑 沈云松1蓋雪松2梅 茸 唐 浩

(云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650032)

目的 探討膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇致癇組織中蛋白B1的表達(dá)。方法 選取72例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤并癲癇組，同期行手術(shù)治療的70例未伴發(fā)癲癇的膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤無癲癇組，同期70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標(biāo)本作非腫瘤癲癇組，20例接受顱內(nèi)減壓術(shù)治療的患者的腦組織標(biāo)本作對(duì)照組。分析膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級(jí)別和高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平的關(guān)系、四組高遷移率族蛋白B1表達(dá)情況、膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤病理級(jí)別對(duì)癲癇的影響。結(jié)果 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別(r=0.154，P<0.05)、癲癇發(fā)作頻率(r=0.429，P<0.05)及癲癇持續(xù)時(shí)間(r=0.254，P<0.05)呈正相關(guān)；膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達(dá)陽性率顯著高于膠質(zhì)瘤無癲癇組(χ2=8.990，P<0.05)、非腫瘤癲癇組(χ2=19.864，P<0.05)，膠質(zhì)瘤無癲癇組顯著高于對(duì)照組(χ2=32.699，P<0.05)，非腫瘤癲癇組顯著高于對(duì)照組(χ2=20.793，P<0.05)；高遷移率族蛋白B1在中低級(jí)別中表達(dá)水平顯著高于高級(jí)別(χ2=11.614，P<0.05)，高遷移率族蛋白B1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與是否并發(fā)癲癇有關(guān)(χ2=11.445，P<0.05)。結(jié)論 高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇致癇組織中具有較高表達(dá)水平，膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1可能是誘發(fā)相關(guān)性癲癇的重要因素。

膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇；致癇組織；高遷移率族蛋白B1

有資料表明，顱內(nèi)膠質(zhì)瘤誘發(fā)癲癇發(fā)生率高達(dá)約69.9%，治療膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的主要方法為膠質(zhì)瘤并致癇病灶切除術(shù)，且取得了顯著療效〔1，2〕。高遷移率族蛋白B1是一種染色質(zhì)非組蛋白核蛋白，廣泛分布于機(jī)體內(nèi)的真核細(xì)胞中，相關(guān)實(shí)驗(yàn)〔3〕證實(shí)，高遷移率族蛋白B1與其相關(guān)受體Toll樣受體4(TLR4)在癲癇大鼠模型的發(fā)病及復(fù)發(fā)中活躍度較高，且人體顳葉癲癇患者海馬中TLR4、高遷移率族蛋白B1表達(dá)的組織病理學(xué)模型與癲癇大鼠模型極其相似，因此推測高遷移率族蛋白B1與其受體糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、TLR4等可經(jīng)免疫反應(yīng)引發(fā)癲癇。此外，近些年有相關(guān)學(xué)者研究〔4〕指出，高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌等腫瘤疾病中具有較高表達(dá)水平。本研究旨在進(jìn)一步探討高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤相關(guān)癲癇組織的表達(dá)意義。

1 對(duì)象及方法

1.1 對(duì)象 選取2010年6月至2016年2月在我院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的72例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤并癲癇組，另選取同期行手術(shù)治療的70例未伴發(fā)癲癇的膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤無癲癇組，70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標(biāo)本作非腫瘤癲癇組，20例接受顱內(nèi)減壓術(shù)治療的患者的腦組織標(biāo)本作對(duì)照組。四組患者性別、年齡等基本信息對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有研究價(jià)值，且本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 免疫組化方法 對(duì)標(biāo)本行包埋處理，以3.0 μm厚度對(duì)其進(jìn)行連續(xù)切片，隨后將其放置于載玻片上(經(jīng)防脫劑預(yù)處理)。以檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)作修復(fù)液，通過微波加熱修復(fù)法對(duì)抗原實(shí)施修復(fù)處理，完成修復(fù)后滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體；利用微波高溫對(duì)切片行加熱處理(2.0 min左右)，待其溫度上升至90.0℃～95.0℃出現(xiàn)微小波動(dòng)時(shí)，立即調(diào)至保溫模式(8.0 min左右)，待切片溫度恢復(fù)至室溫水平時(shí)，通過蒸餾水對(duì)其進(jìn)行2次沖洗，隨后將其放入3.0%H2O2液體內(nèi)，9.0～10.0 min后再次蒸餾水行兩次沖洗。滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體并在4.0℃環(huán)境下過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，滴加生物素標(biāo)記二抗后于室溫條件下20.0 min孵育處理；PBS沖洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，隨后于室溫條件下行15.0 min孵育處理。采用DAB顯色劑對(duì)切片行顯色操作，清洗后以蘇木精復(fù)染；通過乙醇實(shí)施常規(guī)脫水及二甲苯透明處理，以中性樹膠對(duì)其行封片處置，并通過顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。

1.3 免疫組化染色評(píng)估 高遷移率族蛋白B1免疫染色情況依據(jù)染色程度和免疫組化染色率進(jìn)行綜合評(píng)定。選取各切片中免疫反應(yīng)最強(qiáng)烈的區(qū)域，并采用高倍視鏡(×400)對(duì)切片中5個(gè)非重復(fù)視野進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)高遷移率族蛋白B1染色細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算染色率〔染色率=(染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100.0%〕。染色率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕：染色率>75.0%為4分，50.0%<染色率<74.0%為3分，25.0%<染色率<49.0%為2分，染色率≤24.0%為1分，無染色細(xì)胞為0分。免疫染色程度評(píng)分參照細(xì)胞質(zhì)染色程度進(jìn)行評(píng)定〔6〕：深黃色為2分，淺黃色為1分，無色為0分。最終得分為染色率評(píng)分與免疫染色程度評(píng)分之和，并設(shè)定：4～6分為高表達(dá)，以“**”表示；1～3分為低表達(dá)，以“*”表示；0分為陰性，以“-”表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件，兩獨(dú)立樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間分布采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級(jí)別和高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平的關(guān)系 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別(r=0.154，P<0.05)、癲癇發(fā)作頻率(r=0.429，P<0.05)及癲癇持續(xù)時(shí)間(r=0.254，P<0.05)呈正相關(guān)。見表1。

表1 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級(jí)別與高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平的關(guān)系(n)

病理因素n低表達(dá)高表達(dá)r值P值膠質(zhì)瘤病理級(jí)別 中、低級(jí)5631250.154<0.05 高級(jí)16313癲癇發(fā)作頻率(個(gè)月) >35313400.429<0.05 ≤319172癲癇持續(xù)時(shí)間(min) >53710270.254<0.05 ≤5352411

2.2 四組高遷移率族蛋白B1表達(dá)情況對(duì)比 膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達(dá)陽性率(100%)顯著高于膠質(zhì)瘤無癲癇組(85.71%)(χ2=8.990，P<0.05)、非腫瘤癲癇組(75.71%)(χ2=19.864，P<0.05)，膠質(zhì)瘤無癲癇組顯著高于對(duì)照組(20.00%)(χ2=32.699，P<0.05)，非腫瘤癲癇組顯著高于對(duì)照組(χ2=20.793，P<0.05)。

2.3 膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤病理級(jí)別對(duì)癲癇的影響 膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1在中低級(jí)別中表達(dá)水平(100.00%)顯著高于高級(jí)別(20.00%)(χ2=11.614，P<0.05)，高遷移率族蛋白B1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與是否并發(fā)癲癇有關(guān)，并發(fā)癲癇組為20.00%，非癲癇組為92.11%(χ2=11.445，P<0.05)。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，約29.4%的癲癇患者遵從醫(yī)囑堅(jiān)持長期定時(shí)定量用藥治療，但病情仍難以得到完全控制，此類癲癇在臨床醫(yī)學(xué)中被稱為難治性癲癇〔7〕。外科手術(shù)是治療難治性癲癇的主要措施之一，但少數(shù)難治性癲癇患者難以明確其發(fā)病原因，如顱內(nèi)血管畸形、外傷、顱內(nèi)腫瘤等，其中膠質(zhì)瘤是發(fā)病率較高的腫瘤之一〔8〕。有文獻(xiàn)〔9〕指出，神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)及腫瘤細(xì)胞成分的組成對(duì)癲癇發(fā)作具有決定性作用。膠質(zhì)瘤瘤周組織微環(huán)境和形態(tài)學(xué)的變化均可誘發(fā)癲癇，如腫瘤灶的局部刺激、腫瘤中血流減少、血腦屏障受損、突觸囊泡改變、神經(jīng)元異常遷移及谷氨酸濃度失衡等，這些變化均可對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的改變產(chǎn)生重要影響〔10〕。機(jī)體血腦屏障受損導(dǎo)致血清中谷氨酸等相關(guān)致癇物質(zhì)到達(dá)瘤周部位時(shí)，可使瘤周組織的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)顯著增加，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞大量聚集；同時(shí)，瘤周角質(zhì)細(xì)胞被激活后缺乏功能性角質(zhì)細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST、GLT-1，從而無法對(duì)谷氨酸進(jìn)行有效清除。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)〔11〕證實(shí)，癲癇大鼠模型海馬組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平過高時(shí)，可加劇其損傷狀態(tài)，同時(shí)還可導(dǎo)致海馬組織中P-糖蛋白(P-gp)過量表達(dá)，進(jìn)而提高癲癇發(fā)作的易感性。另有研究〔12〕指出，隨時(shí)間延長，高遷移率族蛋白B1在Sombati癲癇細(xì)胞中的表達(dá)量會(huì)不斷增加，在癲癇的生理病理中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，高遷移率族蛋白B1在致癇灶組織中的表達(dá)情況可能直接相關(guān)于癲癇發(fā)病，與以往相關(guān)研究結(jié)果〔13〕一致，高遷移率族蛋白B1不僅在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)較高，同時(shí)其表達(dá)情況還與膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別存在一定相關(guān)性，由此可以推測，高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤非癲癇患者膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平顯著高于正常腦組織。本研究還顯示：高遷移率族蛋白B1對(duì)低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤患者是否會(huì)并發(fā)癲癇有重要影響。分析其原因可能是膠質(zhì)瘤組織可生成大量高遷移率族蛋白B1，而高遷移率族蛋白B1可與其RAGE、TLR4等受體共同形成異常放電通路，從而構(gòu)成癲癇發(fā)作的基礎(chǔ)；低病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤病程相對(duì)較長，其生成的高遷移率族蛋白B1進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境后可加劇機(jī)體炎性反應(yīng)，進(jìn)而構(gòu)成瘤周致癇灶；而腫瘤性病變中的免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)表達(dá)、膠質(zhì)細(xì)胞的酶及神經(jīng)元異常均可對(duì)腦功能造成影響，繼而引發(fā)癲癇。

1 Rosati A,Tomassini A，Pollo B，etal.Epilepsy in cerebral glioma:timing of appearance and histological correlations〔J〕.J Neurol Oncol，2009;93(3)：395-400.

2 韓 笑，吳瓊石，楊 薇，等.腦膠質(zhì)瘤中絲氨酸蛋白酶抑制劑、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)及對(duì)血管生成的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015;35(20)：5831-3.

3 Murata Y,Taniguchi G,Watanabe O,etal.A case of autoimmune epilepsy associated with anti-leucine-rich glioma inactivated subunit 1 antibodies manifesting electrical shock-like sensations and transparent sadness〔J〕.Epilepsy Behav Case Rep，2015;4(8)：91-3.

4 王引言，毛 慶，王江飛，等.低級(jí)別膠質(zhì)瘤占位效應(yīng)與術(shù)后癲癇緩解率的相關(guān)性研究〔J〕.中華神經(jīng)外科雜志，2014;30(10)：1031-4.

5 Pyken TC,Parney I,Buatti J,etal.The role of radiotherapy in the management of patients with diffuse low grade glioma:a systematic review and evidence-based clinical practice guideline〔J〕.J Neurooncol，2015;125(3)：551-83.

6 郭成永，梁朝輝，魏可欣，等.解旋酶RECQ1和細(xì)胞核相關(guān)抗原 Ki-67在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015;35(12)：3259-60.

7 Loredana M,Dinapoli L,Fabi A,etal.Cognitive rehabilitation training in patients with brain tumor-related epilepsy and cognitive deficits:a pilot study〔J〕.J Neurooncol，2015;125(2)：419-26.

8 楊如意，李培棟，吳建珩，等.人腦膠質(zhì)瘤組織HMGB1表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇關(guān)系的探討〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2015;22(15)：1180-3.

9 Huang YJ,He Y,Chen M,etal.Adenosine deaminase and adenosine kinase expression in human glioma and their correlation with glioma associated epilepsy〔J〕.Mol Med Rep，2015;12(5)：6509-16.

10 周少龍，王新軍，付旭東，等.伴有癲癇的人腦膠質(zhì)瘤中HMGB1/TLR4的表達(dá)研究〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2015;14(6)：563-6.

11 王新軍，楊如意，單 嶠，等.膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)與癇性發(fā)作〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2015;41(3)：155-9.

12 Zhong Z,Wang Z,Wang Y,etal.IDH1/2 mutation is associated with seizure as an initial symptom in low-grade glioma:A report of 311 Chinese adult glioma patients〔J〕.Epilepsy Res,2015;109(9)：100-5.

13 朱 晉，張玉琪，萬 虹，等.組蛋白去乙?；?與小兒膠質(zhì)瘤發(fā)病和預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中華神經(jīng)外科雜志，2014;30(11)：1145-8.

〔2016-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

1 云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 2 云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科

林 嵐(1969-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事臨床神經(jīng)病學(xué)、癲癇病學(xué)方面的研究。

R742.1

A

1005-9202(2016)23-5837-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.028