林 嵐 楊 淑 沈云松 蓋雪松 梅 茸 唐 浩
(云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,云南 昆明 650032)
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膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇組織高遷移率族蛋白B1的表達(dá)
林 嵐 楊 淑 沈云松1蓋雪松2梅 茸 唐 浩
(云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,云南 昆明 650032)
目的 探討膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇致癇組織中蛋白B1的表達(dá)。方法 選取72例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤并癲癇組,同期行手術(shù)治療的70例未伴發(fā)癲癇的膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤無癲癇組,同期70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標(biāo)本作非腫瘤癲癇組,20例接受顱內(nèi)減壓術(shù)治療的患者的腦組織標(biāo)本作對(duì)照組。分析膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級(jí)別和高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平的關(guān)系、四組高遷移率族蛋白B1表達(dá)情況、膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤病理級(jí)別對(duì)癲癇的影響。結(jié)果 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別(r=0.154,P<0.05)、癲癇發(fā)作頻率(r=0.429,P<0.05)及癲癇持續(xù)時(shí)間(r=0.254,P<0.05)呈正相關(guān);膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達(dá)陽性率顯著高于膠質(zhì)瘤無癲癇組(χ2=8.990,P<0.05)、非腫瘤癲癇組(χ2=19.864,P<0.05),膠質(zhì)瘤無癲癇組顯著高于對(duì)照組(χ2=32.699,P<0.05),非腫瘤癲癇組顯著高于對(duì)照組(χ2=20.793,P<0.05);高遷移率族蛋白B1在中低級(jí)別中表達(dá)水平顯著高于高級(jí)別(χ2=11.614,P<0.05),高遷移率族蛋白B1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與是否并發(fā)癲癇有關(guān)(χ2=11.445,P<0.05)。結(jié)論 高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇致癇組織中具有較高表達(dá)水平,膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1可能是誘發(fā)相關(guān)性癲癇的重要因素。
膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇;致癇組織;高遷移率族蛋白B1
有資料表明,顱內(nèi)膠質(zhì)瘤誘發(fā)癲癇發(fā)生率高達(dá)約69.9%,治療膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的主要方法為膠質(zhì)瘤并致癇病灶切除術(shù),且取得了顯著療效〔1,2〕。高遷移率族蛋白B1是一種染色質(zhì)非組蛋白核蛋白,廣泛分布于機(jī)體內(nèi)的真核細(xì)胞中,相關(guān)實(shí)驗(yàn)〔3〕證實(shí),高遷移率族蛋白B1與其相關(guān)受體Toll樣受體4(TLR4)在癲癇大鼠模型的發(fā)病及復(fù)發(fā)中活躍度較高,且人體顳葉癲癇患者海馬中TLR4、高遷移率族蛋白B1表達(dá)的組織病理學(xué)模型與癲癇大鼠模型極其相似,因此推測高遷移率族蛋白B1與其受體糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、TLR4等可經(jīng)免疫反應(yīng)引發(fā)癲癇。此外,近些年有相關(guān)學(xué)者研究〔4〕指出,高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌等腫瘤疾病中具有較高表達(dá)水平。本研究旨在進(jìn)一步探討高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤相關(guān)癲癇組織的表達(dá)意義。
1.1 對(duì)象 選取2010年6月至2016年2月在我院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的72例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤并癲癇組,另選取同期行手術(shù)治療的70例未伴發(fā)癲癇的膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作膠質(zhì)瘤無癲癇組,70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標(biāo)本作非腫瘤癲癇組,20例接受顱內(nèi)減壓術(shù)治療的患者的腦組織標(biāo)本作對(duì)照組。四組患者性別、年齡等基本信息對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),具有研究價(jià)值,且本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核同意。
1.2 免疫組化方法 對(duì)標(biāo)本行包埋處理,以3.0 μm厚度對(duì)其進(jìn)行連續(xù)切片,隨后將其放置于載玻片上(經(jīng)防脫劑預(yù)處理)。以檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)作修復(fù)液,通過微波加熱修復(fù)法對(duì)抗原實(shí)施修復(fù)處理,完成修復(fù)后滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體;利用微波高溫對(duì)切片行加熱處理(2.0 min左右),待其溫度上升至90.0℃~95.0℃出現(xiàn)微小波動(dòng)時(shí),立即調(diào)至保溫模式(8.0 min左右),待切片溫度恢復(fù)至室溫水平時(shí),通過蒸餾水對(duì)其進(jìn)行2次沖洗,隨后將其放入3.0%H2O2液體內(nèi),9.0~10.0 min后再次蒸餾水行兩次沖洗。滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體并在4.0℃環(huán)境下過夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,滴加生物素標(biāo)記二抗后于室溫條件下20.0 min孵育處理;PBS沖洗,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,隨后于室溫條件下行15.0 min孵育處理。采用DAB顯色劑對(duì)切片行顯色操作,清洗后以蘇木精復(fù)染;通過乙醇實(shí)施常規(guī)脫水及二甲苯透明處理,以中性樹膠對(duì)其行封片處置,并通過顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。
1.3 免疫組化染色評(píng)估 高遷移率族蛋白B1免疫染色情況依據(jù)染色程度和免疫組化染色率進(jìn)行綜合評(píng)定。選取各切片中免疫反應(yīng)最強(qiáng)烈的區(qū)域,并采用高倍視鏡(×400)對(duì)切片中5個(gè)非重復(fù)視野進(jìn)行觀察,統(tǒng)計(jì)高遷移率族蛋白B1染色細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算染色率〔染色率=(染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100.0%〕。染色率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕:染色率>75.0%為4分,50.0%<染色率<74.0%為3分,25.0%<染色率<49.0%為2分,染色率≤24.0%為1分,無染色細(xì)胞為0分。免疫染色程度評(píng)分參照細(xì)胞質(zhì)染色程度進(jìn)行評(píng)定〔6〕:深黃色為2分,淺黃色為1分,無色為0分。最終得分為染色率評(píng)分與免疫染色程度評(píng)分之和,并設(shè)定:4~6分為高表達(dá),以“**”表示;1~3分為低表達(dá),以“*”表示;0分為陰性,以“-”表示。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件,兩獨(dú)立樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料組間分布采用χ2檢驗(yàn)。
2.1 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級(jí)別和高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平的關(guān)系 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別(r=0.154,P<0.05)、癲癇發(fā)作頻率(r=0.429,P<0.05)及癲癇持續(xù)時(shí)間(r=0.254,P<0.05)呈正相關(guān)。見表1。
表1 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級(jí)別與高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平的關(guān)系(n)
病理因素n低表達(dá)高表達(dá)r值P值膠質(zhì)瘤病理級(jí)別 中、低級(jí)5631250.154<0.05 高級(jí)16313癲癇發(fā)作頻率(個(gè)月) >35313400.429<0.05 ≤319172癲癇持續(xù)時(shí)間(min) >53710270.254<0.05 ≤5352411
2.2 四組高遷移率族蛋白B1表達(dá)情況對(duì)比 膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達(dá)陽性率(100%)顯著高于膠質(zhì)瘤無癲癇組(85.71%)(χ2=8.990,P<0.05)、非腫瘤癲癇組(75.71%)(χ2=19.864,P<0.05),膠質(zhì)瘤無癲癇組顯著高于對(duì)照組(20.00%)(χ2=32.699,P<0.05),非腫瘤癲癇組顯著高于對(duì)照組(χ2=20.793,P<0.05)。
2.3 膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤病理級(jí)別對(duì)癲癇的影響 膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1在中低級(jí)別中表達(dá)水平(100.00%)顯著高于高級(jí)別(20.00%)(χ2=11.614,P<0.05),高遷移率族蛋白B1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與是否并發(fā)癲癇有關(guān),并發(fā)癲癇組為20.00%,非癲癇組為92.11%(χ2=11.445,P<0.05)。
據(jù)報(bào)道,約29.4%的癲癇患者遵從醫(yī)囑堅(jiān)持長期定時(shí)定量用藥治療,但病情仍難以得到完全控制,此類癲癇在臨床醫(yī)學(xué)中被稱為難治性癲癇〔7〕。外科手術(shù)是治療難治性癲癇的主要措施之一,但少數(shù)難治性癲癇患者難以明確其發(fā)病原因,如顱內(nèi)血管畸形、外傷、顱內(nèi)腫瘤等,其中膠質(zhì)瘤是發(fā)病率較高的腫瘤之一〔8〕。有文獻(xiàn)〔9〕指出,神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)及腫瘤細(xì)胞成分的組成對(duì)癲癇發(fā)作具有決定性作用。膠質(zhì)瘤瘤周組織微環(huán)境和形態(tài)學(xué)的變化均可誘發(fā)癲癇,如腫瘤灶的局部刺激、腫瘤中血流減少、血腦屏障受損、突觸囊泡改變、神經(jīng)元異常遷移及谷氨酸濃度失衡等,這些變化均可對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的改變產(chǎn)生重要影響〔10〕。機(jī)體血腦屏障受損導(dǎo)致血清中谷氨酸等相關(guān)致癇物質(zhì)到達(dá)瘤周部位時(shí),可使瘤周組織的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)顯著增加,促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞大量聚集;同時(shí),瘤周角質(zhì)細(xì)胞被激活后缺乏功能性角質(zhì)細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST、GLT-1,從而無法對(duì)谷氨酸進(jìn)行有效清除。
相關(guān)實(shí)驗(yàn)〔11〕證實(shí),癲癇大鼠模型海馬組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)水平過高時(shí),可加劇其損傷狀態(tài),同時(shí)還可導(dǎo)致海馬組織中P-糖蛋白(P-gp)過量表達(dá),進(jìn)而提高癲癇發(fā)作的易感性。另有研究〔12〕指出,隨時(shí)間延長,高遷移率族蛋白B1在Sombati癲癇細(xì)胞中的表達(dá)量會(huì)不斷增加,在癲癇的生理病理中發(fā)揮重要作用。本研究顯示,高遷移率族蛋白B1在致癇灶組織中的表達(dá)情況可能直接相關(guān)于癲癇發(fā)病,與以往相關(guān)研究結(jié)果〔13〕一致,高遷移率族蛋白B1不僅在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)較高,同時(shí)其表達(dá)情況還與膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別存在一定相關(guān)性,由此可以推測,高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤非癲癇患者膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平顯著高于正常腦組織。本研究還顯示:高遷移率族蛋白B1對(duì)低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤患者是否會(huì)并發(fā)癲癇有重要影響。分析其原因可能是膠質(zhì)瘤組織可生成大量高遷移率族蛋白B1,而高遷移率族蛋白B1可與其RAGE、TLR4等受體共同形成異常放電通路,從而構(gòu)成癲癇發(fā)作的基礎(chǔ);低病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤病程相對(duì)較長,其生成的高遷移率族蛋白B1進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境后可加劇機(jī)體炎性反應(yīng),進(jìn)而構(gòu)成瘤周致癇灶;而腫瘤性病變中的免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)表達(dá)、膠質(zhì)細(xì)胞的酶及神經(jīng)元異常均可對(duì)腦功能造成影響,繼而引發(fā)癲癇。
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〔2016-05-11修回〕
(編輯 袁左鳴)
1 云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 2 云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科
林 嵐(1969-),女,副主任醫(yī)師,主要從事臨床神經(jīng)病學(xué)、癲癇病學(xué)方面的研究。
R742.1
A
1005-9202(2016)23-5837-03;
10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.028