任曉慧 張中偉 徐群英 李 偉 馮建高 任清風 李煒娟 肖元梅

(南昌大學公共衛(wèi)生學院，江西 南昌 330006)

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染鉛大鼠腦組織JWA mRNA表達變化與氧化應激損傷的關系

任曉慧 張中偉 徐群英 李 偉 馮建高 任清風 李煒娟 肖元梅

(南昌大學公共衛(wèi)生學院，江西 南昌 330006)

目的 探討鉛暴露對大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、海馬組織JWA mRNA表達的影響及其與腦組織氧化應激損傷的關系。方法 40只剛斷乳雄性SD大鼠，按體重隨機區(qū)組法分為5組(對照組和4個乙酸鉛劑量組)，各組自由飲用不同濃度的乙酸鉛溶液(0、100、200、400、800 mg/L)。連續(xù)染毒60 d后取大鼠腦組織，RT-PCR技術檢測腦組織JWA mRNA的表達量，并測定腦組織鉛含量、過氧化氫(H2O2)水平、丙二醛(MDA)及8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量。結(jié)果 與對照組相比，各染鉛組大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和海馬組織JWA mRNA表達水平明顯降低，而腦組織鉛含量及H2O2、MDA及8-OHdG水平均增加(P<0.05)；腦組織JWA mRNA的表達量與其鉛含量、H2O2、MDA、8-OHdG水平呈負相關(P<0.05)。結(jié)論 飲水鉛暴露可導致大鼠腦組織JWA mRNA的表達變化，并與腦組織氧化應激損傷密切相關。

JWA；腦組織；氧化應激

鉛是一種廣泛存在于環(huán)境中對人體沒有任何生理功能、反而具有毒性的重金屬元素，可造成多系統(tǒng)多器官損傷〔1〕。神經(jīng)系統(tǒng)是鉛毒性作用的重要靶器官，越來越多的研究表明鉛毒性沒有安全閾值〔2〕，低水平鉛暴露對機體腦功能的影響已成為目前鉛神經(jīng)毒性研究關注的焦點，但鉛毒性的確切機制至今尚不十分清楚。隨著研究的進展，從自由基及其誘導的氧化應激損傷方面探討鉛毒性機制受到廣泛關注。作為一種新的活躍的環(huán)境應答基因，JWA被證實參與多種環(huán)境因素(如熱應激和氧化應激)的應答反應，在保護細胞免受氧化應激誘導的DNA損傷和細胞凋亡方面發(fā)揮關鍵作用〔3,4〕，但目前尚未見JWA在鉛毒性中作用的相關報道。本文給予大鼠飲用不同劑量乙酸鉛溶液后，通過RT-PCR技術檢測其大腦皮質(zhì)、小腦、海馬組織中JWA mRNA的表達及其與腦組織氧化應激損傷的關系，為進一步探討鉛神經(jīng)毒性機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 三水合乙酸鉛(分析純，西隴化工廠)；RNA提取試劑盒(Omega公司)；引物(Invitrogen公司合成)；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(美國Thermo公司)；過氧化氫(H2O2)及丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測定試劑盒(上海研鑫生物科技有限公司)；鉛溶液標準物質(zhì)(國家標準物質(zhì)信息平臺，標準號GBW08619)；PCR擴增儀(美國 BIO-RAD)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Synoptics 公司)；AA-6300C型石墨爐原子吸收分光光度計(日本島津公司)；722可見分光光度計(上海興茂儀器公司)。

1.2 實驗動物及處理 剛斷乳雄性、健康SPF級SD大鼠40只，體重90～100 g〔購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001〕，適應性喂養(yǎng)1 w后按體重隨機區(qū)組法分為空白對照組和4個乙酸鉛劑量組。采用自由飲水的方式進行染毒：空白對照組飲用去離子水，4個乙酸鉛劑量組分別飲用不同濃度的乙酸鉛溶液(100、200、400、800 mg/L)，連續(xù)染毒60 d。最后一次染毒后第2天，稱重并以60 mg/kg體重戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物，冰上迅速取出全腦，并用冰冷的生理鹽水沖凈血液后分離大腦皮質(zhì)、小腦和海馬，稱重后置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標及其方法

1.3.1 RT-PCR檢測JWA mRNA表達 RNA提取試劑盒提取大鼠腦組織RNA，檢測RNA純度濃度后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(RT)，PCR試劑盒進行聚合酶鏈式擴增反應(PCR)。程序：95℃預變性1～3 min，(95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min)×40個循環(huán)，72℃終延伸7 min。JWA上游引物5'TCCGTGCCTGGGATGATTTC3'，下游引物5'GGCTCAGAAACCCAACGACT3'，產(chǎn)物為165 bp；內(nèi)參基因β-actin上游引物5'CTGTGTGGATTGGTGGCTCT3'，下游引物5'GCTCAGTAACAGTCCGCCTA3'，產(chǎn)物為133 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用Bio-rad公司的Quantity One4.6.2凝膠分析軟件分析JWA基因和內(nèi)參β-actin基因條帶光密度值(OD值)，計算OD(JWA)/OD(內(nèi)參)的比值作為JWA mRNA的相對表達量。

1.3.2 腦組織鉛含量 腦組織經(jīng)消化后用石墨爐原子吸收分光光度法測定其鉛的含量，按國家標準規(guī)定的方法進行〔5〕。

1.3.3 腦組織H2O2、MDA及8-OHdG測定 在冰浴中用冰生理鹽水將腦組織制成10%的組織勻漿，4℃ 4 500 r/min離心10 min后吸取上清液置于冰浴中待用。H2O2測定采用鉬酸銨法、MDA的測定采用TBA法、8-OHdG采用ELISA法測定，各指標的測定均按照試劑盒所示方法進行。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析，指標間的關聯(lián)用Pearson直線相關分析。

2 結(jié) 果

2.1 鉛暴露對大鼠腦組織JWA mRNA表達的影響 大鼠染鉛后，其大腦皮質(zhì)、小腦、海馬的JWA mRNA表達水平較對照組明顯降低(均P<0.01)；并隨著飲水鉛含量的升高，各腦組織JWA mRNA表達水平呈逐漸下降的趨勢。見表1、圖1。

2.2 染鉛后各組大鼠腦組織鉛含量的變化 染鉛后，大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、海馬鉛的含量較對照組明顯增加(P<0.01)；隨著飲水鉛含量的升高，各腦組織鉛含量逐漸升高，各劑量組間比較均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表2。

組別大腦皮質(zhì)小腦海馬對照組1.626±0.3461.543±0.2641.203±0.079100mg/L組1.283±0.2051)1.307±0.1921)1.037±0.0881)200mg/L組1.232±0.1651)1.223±0.2301)0.931±0.1421)400mg/L組1.169±0.2811)1.161±0.1391)0.892±0.0961)2)800mg/L組0.952±0.0941)2)3)1.105±0.1031)0.834±0.1121)2)F值8.6165.89915.225P值<0.01<0.01<0.01

1)與對照組相比,2)與100 mg/L組比,3)與200 mg/L組比,4)與400 mg/L組比,均P<0.05；下表同

M：DNA marker；1～5泳道依次為對照組、100 mg/L組、200 mg/L組、400 mg/L組、800 mg/L組圖1 JWA mRNA在鉛暴露大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和海馬中的表達

組別大腦皮質(zhì)小腦海馬對照組0.927±0.1952.508±0.0512.849±1.380100mg/L組1.560±0.0701)3.226±0.5081)4.254±0.5841)200mg/L組1.917±0.1331)2)3.294±0.5041)5.515±1.2791)2)400mg/L組2.681±0.4211)2)3)3.814±0.7641)2)6.785±0.8281)2)3)800mg/L組3.478±0.4831)2)3)4)4.211±0.6991)2)3)8.457±0.9401)2)3)4)F值83.63010.50234.769P值<0.01<0.01<0.01

2.3 鉛暴露對各組大鼠腦組織H2O2水平、MDA及8-OHdG含量的影響 大腦皮質(zhì)、小腦和海馬H2O2水平、MDA及8-OHdG含量與對照組比較均增加(P<0.05)；隨著飲水鉛含量的升高，各腦組織H2O2水平、MDA及8-OHdG含量均基本呈逐漸升高趨勢，表明腦組織發(fā)生了明顯的氧化應激反應及氧化損傷。見表3～表5。

2.4 大鼠腦組織JWA mRNA表達量與鉛含量和氧化應激損傷的相關性分析 相關分析結(jié)果顯示，大鼠染鉛后，其大腦皮質(zhì)、小腦、海馬組織JWA mRNA的表達量與其組織的鉛含量呈負相關關系，并與組織的H2O2水平和MDA、8-OHdG含量呈負相關(P<0.05)。見表6。

組別大腦皮質(zhì)小腦海馬對照組16.370±3.3329.203±0.57911.931±1.311100mg/L組20.025±2.2911)14.969±1.7121)13.108±2.072200mg/L組23.171±5.3211)15.514±1.9641)14.691±2.0641)400mg/L組25.490±8.9971)2)16.438±2.1081)15.351±2.9641)2)800mg/L組26.851±1.2921)2)17.380±2.5331)2)16.021±1.3411)2)F值5.65322.8845.381P值<0.01<0.01<0.01

組別大腦皮質(zhì)小腦海馬對照組0.869±0.1690.612±0.1110.657±0.120100mg/L組1.086±0.3640.645±0.0961.059±0.2851)200mg/L組1.149±0.1400.815±0.1921)2)1.162±0.1641)400mg/L組1.315±0.4481)0.839±0.0931)2)1.189±0.3841)800mg/L組1.492±0.4611)2)0.984±0.0571)2)3)4)1.214±0.2061)F值3.73513.1326.838P值<0.05<0.01<0.01

組別大腦皮質(zhì)小腦海馬對照組21.126±3.65119.747±3.83523.564±4.093100mg/L組26.752±3.5151)24.751±5.3031)28.160±4.3811)200mg/L組27.107±6.6201)27.267±5.3611)30.117±3.4321)400mg/L組30.712±6.5141)30.263±4.9781)2)32.202±4.2891)2)800mg/L組33.055±7.5061)2)3)32.075±6.0041)2)3)34.060±4.0481)2)3)F值6.8469.07710.905P值<0.01<0.01<0.01

表6 各腦組織JWA mRNA表達量與鉛含量和氧化應激損傷的相關系數(shù)(r值)

腦組織鉛含量H2O2MDA8-OHdG大腦皮質(zhì)-0.6322)-0.4752)-0.3261)-0.5562)小腦-0.4702)-0.5042)-0.5892)-0.5572)海馬-0.6252)-0.5452)-0.6752)-0.7822)

1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生過多，超過機體的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致機體組織脂質(zhì)過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷，對機體造成損害〔6〕。H2O2是重要的活性氧之一，和體內(nèi)其他活性氧自由基一樣，攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸致脂質(zhì)過氧化〔7〕。MDA是體內(nèi)主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，是細胞和組織過氧化的終產(chǎn)物，能通過影響細胞膜上的蛋白質(zhì)、酶或者受體功能發(fā)生改變而導致細胞損傷，嚴重時甚至導致細胞死亡〔8〕。8-OHdG是DNA氧化損傷的關鍵標志物，廣泛應用于評價內(nèi)源性DNA氧化損傷，并作為包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的危險因子〔9〕。

越來越多的研究表明，氧化應激及其所致氧化損傷在鉛的毒性機制中發(fā)揮重要作用。Shakoor等〔10〕用不同濃度鉛溶液處理油菜幼苗后，其H2O2和MDA水平升高且植物生長受到抑制；流行病學研究結(jié)果顯示，慢性鉛暴露可致兒童尿8-OHdG水平升高〔11〕。本研究結(jié)果顯示，大鼠飲用含鉛溶液后，其腦組織H2O2、MDA和8-OHdG水平均顯著升高，提示鉛暴露可致大鼠腦組織處于氧化應激狀態(tài)并致腦組織發(fā)生氧化損傷。

JWA是周建偉等〔12〕從原代培養(yǎng)的人氣管和支氣管上皮細胞中分離并克隆的細胞骨架樣基因，該基因在生物進化上高度保守，廣泛存在于各組織器官并分布于細胞質(zhì)中。研究表明JWA可參與多種環(huán)境因素的應答反應，并在氧化應激誘導的DNA損傷中起關鍵作用〔3,4〕。目前對該基因在氧化應激損傷中的研究絕大部分是基于體外培養(yǎng)的細胞進行的，對整體動物的研究極少。此次研究結(jié)果顯示，大鼠飲水暴露于鉛2個月后，其腦組織JWA基因mRNA表達水平明顯降低，并與組織的鉛含量、H2O2、MDA、8-OHdG水平呈負相關關系，與上述研究結(jié)果不完全一致。眾所周知，機體受神經(jīng)、體液的調(diào)節(jié)及其他器官系統(tǒng)的影響，并處于復雜的生長和代謝內(nèi)環(huán)境中，同時大多數(shù)環(huán)境因素對機體的影響是長期的、慢性的，這些都可能影響機體對外界有害物質(zhì)的損傷效應。

綜合以上研究結(jié)果，飲水鉛暴露可致大鼠腦組織JWA 因mRNA表達降低，并與H2O2、MDA、8-OHdG水平密切相關，提示鉛可通過誘導的腦組織氧化應激及損傷而影響JWA基因的表達。

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〔2016-07-19修回〕

(編輯 曲 莉)

Effects of lead exposure on expression of JWA gene mRNA and its relationship with oxidative stress and damage in brain tissues of rats

REN Xiao-Hui, ZHANG Zhong-Wei, XU Qun-Ying,et al.

School of Public Health, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi, China

Objective To explore the effects of lead exposure on the expression of JWA mRNA in cerebral cortex, cerebellum and hippocampus of rats and the relationship with oxidative stress and damage in brain tissues.Methods 40 weaned male SD rats were divided randomly into five groups according to the weight block design, and drank unlimitedly distilled water containing 0, 100, 200, 400, 800 mg/L lead acetate for 60 days respectively. Then the expression of JWA mRNA in the brain was detected by RT-PCR, and the levels of lead, Hydrogen peroxide (H2O2), malondialdehyde (MDA)and 8- hydroxyl deoxyguanosine(8-OHdG)in brain tissue were determined by the related kits respectively.Results Compared with those of control group, the expression of JWA mRNA in cerebral cortex, cerebellum and hippocampus of lead exposure groups was decreased significantly, whereas contents of lead, H2O2, MDA and 8-OHdG in brain tissue were increased (P<0.05).Correlation analysis results revealed that the expression of JWA gene mRNA was negatively correlated with contents of lead, H2O2, MDA and 8-OHdG in brain tissue(P<0.05).Conclusions Exposure to lead through drinking water could affect the expression of JWA mRNA and its expression intimately correlates with oxidative and stress damage of brain tissues.

JWA; Brain tissues; Oxidative stress

國家自然科學基金項目(81160342);江西省自然科學基金項目(20122BAB205047);江西省教育廳科技項目(GJJ11312)

肖元梅(1972-)，女，博士，副教授，主要從事重金屬中毒機制與防治研究。

任曉慧(1991-)，女，碩士，主要從事重金屬中毒機制與防治研究。

R994.4

A

1005-9202(2016)23-5794-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.010