曲 莉 于曉風 徐華麗 睢大筼

(吉林省疾病預防控制中心，吉林 長春 130062)

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人參皂苷Rb3對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

曲 莉 于曉風1徐華麗1睢大筼1

(吉林省疾病預防控制中心，吉林 長春 130062)

目的 觀察人參皂苷Rb3(G-Rb3)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法 100只Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組及人參皂苷Rb3 7、14、28 mg/kg組。假手術組及模型組均腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 ml/kg，人參皂苷Rb3的3個劑量組分別腹腔注射G-Rb3 7、14、28 mg/kg，連續(xù)3 d。通過大鼠右側大腦中動脈阻塞2 h，再灌注24 h，建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。缺血再灌注后6 h和24 h分別進行大鼠神經功能評分，于缺血再灌注24 h處死大鼠，取腦組織經TTC染色觀察大腦梗死體積，檢測腦組織中促炎癥因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。結果 人參皂苷Rb3 14、28 mg/kg均能明顯改善大鼠神經功能評分，降低腦梗死體積(P<0.05或P<0.01)，可使血清中MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)，并降低腦組織中促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。結論 人參皂苷Rb3對大鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯保護作用，其機制可能與抗炎及抗氧化應激有關。

人參皂苷Rb3；腦缺血再灌注損傷；炎癥因子；氧化應激

人參皂苷Rb3(Ginsenoside Rb3，G-Rb3)是從西洋參莖葉二醇皂苷分離的主要單體皂苷，約占40%，化學名稱：20(s)-原人參二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-α-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其分子式C53H90O22，相對分子質量為1 078。人參Rb組皂苷系西洋參莖葉及根總皂苷提取的有效部位群，保證了人參皂苷Rb在組分(包括Rb1、Rb2和Rb3)及含量上的完整性。有文獻報道，人參Rb組皂苷對多種實驗性心肌缺血具有明顯保護作用〔1～4〕，恰好與G-Rb3的抗心肌缺血作用相一致〔5～8〕。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，人參Rb組皂苷與G-Rb3對大鼠結扎雙側頸總動脈伴低血壓所致實驗性腦缺血均具有明顯保護作用〔9,10〕。為確證G-Rb3對腦缺血的保護作用，本文建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，進一步觀察G-Rb3對腦損傷的影響，為將G-Rb3開發(fā)成治療腦缺血的中藥一類新藥提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物 清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重250～280 g，合格證號SCXK-(吉)2007-0003，吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 G-Rb3，吉林大學化學學院天然藥物化學研究室提供，批號：20151205，純度為98.5%，白色粉末，以0.9%氯化鈉注射液配成所需濃度；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供，批號：20160215；白細胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α測定試劑盒，北京康源瑞得生物技術有限公司提供，批號：20160110；TTC，美國Sigma公司，批號：20151011。

1.3 分組與給藥 100只Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組及G-Rb3 7、14、28 mg/kg組，每組20只。實驗前每組動物腹腔注射給藥，假手術組及模型組均腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 ml/kg，G-Rb3的3個劑量組分別腹腔注射G-Rb3 7、14、28 mg/kg，1次/d，連續(xù)3 d。

1.4 大鼠腦缺血再灌注損傷模型制備 末次給藥1 h后，根據(jù)Longa等〔11〕提出的大腦中動脈閉塞(MCAO)線栓法制備模型：大鼠腹腔注射水合氯醛300 mg/kg麻醉(術前1 d晚禁食不禁水)，仰位固定于手術臺上，頸正中切口，充分暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內動脈(ICA)，結扎右側CCA近心端，CCA遠心端和及ECA處掛線備用。將直徑為0.225 mm的單絲尼龍魚線線栓(魚線一端為光滑鈍球形，直徑在0.35～0.45 mm之間，距球狀端18～20 mm處涂有黑色標記)從右側CCA距ICA分叉前2 mm處切口插入，緩慢向ICA入顱方向推進(18.0±2.0)mm，使魚線頭經過大腦中動脈(MCA)到達大腦前動脈(ACA)，從而阻斷來源于同側ICA、大腦前動脈和大腦后動脈的血流供應，即完成右側大腦中動脈阻塞；分層縫合傷口，記錄時間。2 h后提拉線頭至CCA，實現(xiàn)對缺血腦組織的再灌注。再灌注后6 h和24 h分別進行大鼠神經功能評分。評分標準：無神經系統(tǒng)損傷體征為0分；不能完全伸展左前爪為1分；行走時向左側轉圈為2分；站立不穩(wěn)，向左側傾倒為3分；不能自發(fā)行走，并且意識喪失為4分。大鼠的神經評分越高，表示腦缺血損傷越嚴重〔12〕。再灌注24 h后，將每組10只大鼠斷頭，迅速取腦，置于-20℃冰箱20 min，取出并將大腦切成2 mm厚的冠狀切片，放入5 ml TTC染液中，37℃孵育染色30 min，期間每7～8 min翻轉一次切片，使其染色充分均勻〔13〕。染色成功后，將切片拍照保存，應用NIH ImageJ 軟件測定梗死面積，并計算梗死體積百分比。另取10只大鼠腹主動脈采血，分離血清，按照SOD、GSH-Px及MDA試劑盒說明書，測定血清中SOD和GSH-Px活性及MDA含量；并檢測腦組織中促炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α水平。

2 結 果

2.1 G-Rb3對大鼠神經功能評分的影響 與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分于缺血再灌注6 h和24 h均有顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，G-Rb3 7、14、28 mg/kg組均能改善大鼠的神經功能損傷，顯著降低神經功能評分(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2 G-Rb3對大鼠腦梗死體積的影響 大鼠腦組織經TTC染色后，正常組織呈深紅色，而梗死區(qū)組織呈白色。假手術組大鼠腦組織切片未見梗死區(qū)域。與假手術組比較，模型組大鼠在缺血再灌注24 h后右側大腦梗死體積顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，G-Rb3 14、28 mg/kg組大鼠腦梗死體積均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

組別劑量(mg/kg)神經功能評分6h24h梗死體積(%)假手術組02)02)02)模型組1.97±0.652.24±0.7282.20±11.23G-Rb371.51±0.521)1.72±0.611)65.76±15.61141.49±0.631)1.66±0.561)50.25±20.771)281.42±0.541)1.51±0.582)30.06±16.082)

與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.3 G-Rb3對大鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響 與假手術組比較，模型組血清MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，G-Rb3 14、28 mg/kg組大鼠血清MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px活性均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.4 G-Rb3對大鼠腦組織促炎癥因子的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，G-Rb3 14、28 mg/kg組腦組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

組別劑量(mg/kg)SOD(U/ml)GSH-Px(μmol/L)MDA(nmol/ml)假手術組309.28±36.132)102.42±17.481)12.10±3.422)模型組235.26±37.1270.54±12.6525.87±5.13G-Rb37260.18±42.5679.12±18.4019.26±5.6114295.37±31.611)91.53±13.061)14.15±4.482)28297.12±43.721)95.14±14.811)13.37±4.022)

組別劑量(mg/kg)IL-1β(ng/ml)TNF-α(ng/ml)IL-6(pg/ml)假手術組0.10±0.012)1.50±0.152)1.31±0.202)模型組0.28±0.022.59±0.312.24±0.25G-Rb370.23±0.032.13±0.301.92±0.36140.19±0.021)1.70±0.121)1.65±0.261)280.14±0.022)1.57±0.142)1.63±0.291)

3 討 論

線栓法制備MCAO動物模型具有不用開顱、效果肯定、可以準確地控制缺血及再灌注時間，對動物本身的生理功能影響小、動物術后生存率高等特點。本實驗采用MCAO線栓法成功建立了大鼠腦缺血2 h、再灌注24 h的損傷模型。神經功能評分是評價治療腦缺血藥物療效的一項指標，可從運動功能的角度評價腦缺血再灌注損傷程度〔14〕。TTC染色法常用于評估組織的梗死面積。本研究中梗死體積百分比以梗死區(qū)體積與梗死區(qū)所在右側半腦體積的比值表示，梗死體積以缺血總面積乘以腦切片厚度表示，梗死區(qū)所在右側半腦體積以右側半腦總面積乘以切片厚度表示，這就減小了因腦水腫、腦大小及腦缺血范圍的不同對評估結果的影響〔15〕。本實驗結果顯示，G-Rb3能明顯減輕大鼠腦缺血再灌注損傷引起的神經功能損傷和腦缺血。

氧化應激是指機體中活性氧(ROS)產生過多或者清除能力下降，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡一旦受到破壞，會導致機體發(fā)生潛在的病理性損傷〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)〔17,18〕，腦缺血再灌注損傷時，機體可產生大量ROS，這些ROS不能被內源性的抗氧化系統(tǒng)及時清除，導致DNA氧化，引起膜脂質過氧化反應等一系列的連鎖反應。MDA是脂質過氧化反應的最終產物，可以改變細胞膜的滲透性和流動性，是研究抗氧化能力的常用指標之一；SOD和GSH-Px都被稱為自由基的清除劑，是對抗ROS過多產生的兩種主要酶，二者活力的高低，能夠間接反應機體清除氧自由基的能力〔19,20〕。實驗結果表明，G-Rb3能明顯升高MCAO大鼠血清中SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，提示其對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用機制可能是通過抑制氧自由基的過多產生，減弱機體的氧化損傷程度，增加機體的抗氧化應激能力實現(xiàn)的。

促炎性細胞因子是中樞神經系統(tǒng)疾病中的重要炎性介質。腦缺血可刺激內皮細胞和白細胞中黏附分子的表達，產生大量的促炎性細胞因子，從而導致白細胞的黏附以及向大腦軟組織外滲〔21〕。實驗結果表明，G-Rb3能抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后促炎癥細胞因子的產生，提示G-Rb3對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與其抗炎作用有關。

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〔2016-02-10修回〕

(編輯 徐 杰)

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20085060)

1 吉林大學藥學院藥理教研室

睢大筼(1957-)，男，教授，博士生導師，主要從事心腦血管藥理學研究。

曲 莉(1963-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年病、慢性疾病防控研究。

R791

A

1005-9202(2016)23-5791-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.009