狄婷婷 張 美 王瑞婷 丁 實(shí) 劉永平

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

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Toll樣受體-2、核因子-κB在Aβ誘導(dǎo)的阿爾茨海默病中的作用

狄婷婷1張 美 王瑞婷 丁 實(shí) 劉永平

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的 探討Toll樣受體2(TLR-2)、核因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β與β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)中的作用。方法 將雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組10只；A組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射5 μl生理鹽水，B～E組雙側(cè)海馬注射5 μl Aβ(分別含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)；ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β含量；免疫組化(IHC)檢測(cè)海馬CA1區(qū)TLR-2表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)TLR-2、NF-κB基因的mRNA表達(dá)。結(jié)果 IHC檢測(cè)TLR-2主要聚集在Aβ斑塊周圍，D組(0.036 6±0.007 3)、E組(0.044 8±0.010 8)TLR-2陽性表達(dá)明顯高于A組(0.018 7±0.005 8)、B組(0.010 0±0.003 4)、C組(0.015 1±0.006 0)(P<0.01)；ELISA檢測(cè)大鼠血清TNF-α含量D組(568.65±44.66)pg/ml、E組(685.06±29.92)pg/ml明顯高于A組(426.87±55.91)pg/ml、B組(432.99±28.09)pg/ml、C組(488.14±39.04)pg/ml(P<0.01)，IL-1β含量D(104.60±9.32)pg/ml、E組(143.38±17.09)pg/ml明顯高于A(49.13±8.46)pg/ml、B(60.89±14.71)pg/ml、C(79.81±9.94)pg/ml三組(P<0.01)；qRT-PCR檢測(cè)大鼠海馬組織內(nèi)TLR-2 mRNA表達(dá)D組(2.185 9±0.381 4)、E組(2.977 7±0.390 7)明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.178 5±0.106 6)、C組(1.463 3±0.127 3)(P<0.01)；NF-κB mRNA表達(dá)D組(1.747 0±0.125 6)、E組(2.271 9±0.533 2)明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.274 3±0.165 1)、C組(1.429 1±0.077 7)(P<0.01)。結(jié)論 隨著Aβ劑量不斷增加，TLR-2促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬和清除Aβ的能力不足使Aβ積聚體并激活NF-κB，促進(jìn)更多的TNF-α、IL-1β釋放，最終導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元損傷。

β淀粉樣蛋白；Toll樣受體2；核因子-κB；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜〔1〕。β-淀粉樣蛋白(Aβ)作為AD發(fā)病的始動(dòng)因子已得到公認(rèn)〔2〕。神經(jīng)細(xì)胞外老年斑(SP)形成是AD最具特征性的病理改變，主要由Aβ沉積而成〔3〕，在SP周圍有大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)和炎性因子存在〔4,5〕。有研究認(rèn)為，MG是AD腦內(nèi)炎性反應(yīng)中最重要的炎性細(xì)胞，介導(dǎo)AD病理發(fā)展的全過程。Toll樣受體(TLR)是MG表達(dá)的最主要受體,核因子(NF)-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，兩者在MG介導(dǎo)的Aβ攝取和清除以及MG激活的過程中都起到至關(guān)重要的作用。AD腦內(nèi)TLR-2、NF-κB的表達(dá)是否與Aβ的量有關(guān)，血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β含量是否會(huì)受到影響，成為MG在AD炎癥機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑 江灣1型C腦立體定位儀；Excelsior ES全自動(dòng)組織脫水機(jī)；Z-BJ0010包埋聚合器；RM2125型石蠟切片機(jī)；CK40-F200相差倒置顯微鏡；Olympus顯微鏡攝像裝置；DU80型紫外分光光度計(jì)；Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。Aβ25～35(A4559，Lot:112M4775V)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich有限公司，HPLC檢測(cè)純度≥97%；通用型SP工作液SP-9001免疫組化染色試劑盒(Lot:14188A)、辣根過氧化物酶DAB顯色試劑盒(ZLI-9017,Lot:K136620C)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TLR-2抗體(3268-S,Lot:YJ031901DS2)購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(RR820A,Lot:AK4505)、RNAiso Plus(9108Q,Lot:AK7602)、DEPC水(9013A,Lot:AA1801A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A,Lot:AK3701)，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；大鼠血清TNF-α(EK3822,Lot:238231215)、IL-1β(EK301B2,Lot:2301B30241)ELISA試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；其他試劑為分析純。Aβ25～351 mg干粉溶于500 μl無菌生理鹽水(2 g/L)，-20℃保存，臨用前置于37℃孵育5～7 d成凝膠態(tài)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理方法 Wistar大鼠，50只，成年雄性，10～12周齡，體重(250±20)g，SPF級(jí)，動(dòng)物證號(hào)No.11400700022071，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001〕。隨機(jī)分為5組，編號(hào)A、B、C、D、E，每組10只。A組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射5 μl生理鹽水，B～E組雙側(cè)海馬注射5 μl Aβ(分別含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)。大鼠麻醉后，將其固定在江灣1型C腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行腦立體定位海馬CA1區(qū)，即前囟后(AP-)3.50 mm，中縫左或右(ML±)2.00 mm，顱骨硬腦膜平面向下(DV)2.70 mm，用微量注射器給Aβ，留針5 min，緩慢拔針，牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚傷口，術(shù)后注射青霉素抗感染，1次/d，10萬U/次，連用3 d〔6〕。于注射Aβ 14 d后處死，取血和腦組織標(biāo)本。

1.2.2 IHC檢測(cè)TLR-2表達(dá) 每組取4只大鼠腦組織制作標(biāo)本后，每個(gè)標(biāo)本選取海馬CA1區(qū)細(xì)胞損傷段2張石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水合等步驟，滴加TLR-2Ⅰ抗(1∶500)，用PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算每組切片的光密度平均值。

1.2.3 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TLR-2、NF-κB mRNA表達(dá)水平 每組取6只大鼠，麻醉后，迅速取新鮮腦海馬組織暫存于超低溫冰箱(-80℃)。采用Trizol法提取總RNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度；根據(jù)RNA純度檢測(cè)結(jié)果計(jì)算應(yīng)加入RNA樣品的使用量，按大連寶生物工程有限公司提供的反轉(zhuǎn)試劑盒說明書于冰上將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以β-actin為內(nèi)參照，在GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)分別查找TLR-2、NF-κB的基因序列，引物由TaKaRa生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。β-actin：正義鏈：5'-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3'，反義鏈：5'-TAGAGCCACCAATCCACACA-3'，NF-κB：正義鏈：5'-ACGATGGGACGACACCTCTA-3'，反義鏈：5'-TAACTTCTGCGCCAGAGTGG-3'，TLR-2：正義鏈：5'-TGGAGTCCAGCGGAATCAAC-3'，反義鏈：5'-CAGGAAAGCAGACTCGCTCA-3'。根據(jù)大連寶生物工程有限公司提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書，配制25 μl總反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40個(gè)反應(yīng)循環(huán)數(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)各組大鼠腦組織中TLR-2、NF-κB基因mRNA表達(dá)的水平，記錄CT值，利用2-ΔΔCt的方法分析。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β含量 檢測(cè)程序嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在30 min之內(nèi)用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)值，運(yùn)用CurveExpert 1.4-Cvxpt32，繪制標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線，計(jì)算標(biāo)本待測(cè)因子含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 IHC檢測(cè)海馬CA1區(qū)MG上的TLR-2表達(dá)結(jié)果 IHC檢測(cè)，400倍視野光鏡下可見TLR-2陽性表達(dá)為棕黃色顆粒物，主要聚集在Aβ斑塊的周圍，在MG上高表達(dá)。同時(shí)可見，A、B、C組大鼠海馬CA1區(qū)均可見3～4層細(xì)胞，形態(tài)完整而清晰，有神經(jīng)元的突起；而D、E組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞層數(shù)明顯減少，多為1～2層，剩余的細(xì)胞腫脹，其細(xì)胞核呈空泡狀，并可見MG吞噬神經(jīng)元現(xiàn)象。IHC檢測(cè)結(jié)果顯示，TLR-2陽性表達(dá)D組(0.036 6±0.007 3)、E組(0.044 8±0.010 8)明顯高于A組(0.018 7±0.005 8)、B組(0.010 0±0.003 4)、C組(0.015 1±0.006 0)(P<0.01)，且A、B組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、C組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、C兩組間差異顯著(P<0.05)，D、E兩組間差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)TLR-2陽性表達(dá)(IHC，×400)

2.2 qRT-PCR法檢測(cè)各組大鼠海馬組織內(nèi)TLR-2、NF-κB mRNA表達(dá)結(jié)果 各組TLR-2 mRNA表達(dá)：D組(2.185 9±0.381 4)、E組(2.977 7±0.390 7)明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.178 5±0.106 6)、C組(1.463 3±0.127 3)(P<0.01)，且A、B組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、C組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、C組間差異顯著(P<0.05)，D、E組間差異顯著(P<0.01)。NF-κB mRNA：D組(1.747 0±0.125 6)、E組(2.271 9±0.533 2)明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.274 3±0.165 1)、C組(1.429 1±0.077 7)(P<0.01)，且A、B組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、C組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、C組間差異顯著(P<0.05)，D、E組間差異顯著(P<0.01)。

2.3 ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平 TNF-α含量：D組(568.65±44.66)pg/ml、E組(685.06±29.92)pg/ml明顯高于A組(426.87±55.91)pg/ml、B組(432.99±28.09)pg/ml、C組(488.14±39.04)(P<0.01)，且A、B組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、C組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、C組間差異顯著(P<0.05)，D、E組間差異顯著(P<0.05)。IL-1β含量：D組(104.60±9.32)pg/ml、E組(143.38±17.09)pg/ml明顯高于A組(49.13±8.46)pg/ml、B組(60.89±14.71)pg/ml、C組(79.81±9.94)pg/ml(P<0.01)，且C組與A組差異顯著(P<0.01)，D、E組間差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

TLR是MG表達(dá)的最主要受體之一,其中TLR-2在MG介導(dǎo)的Aβ攝取和清除以及MG激活的過程中都起到至關(guān)重要的作用。Jana等〔7〕發(fā)現(xiàn)敲除TLR-2或利用抗體阻斷等體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)可減少Aβ誘導(dǎo)的促炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)及MG標(biāo)志物表達(dá)，推測(cè)Aβ通過TLR-2受體激活MG，分泌促炎性因子，但Richard等〔8〕利用轉(zhuǎn)基因TLR-2缺失小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，并且Aβ水平升高，推測(cè)TLR-2激活參與了MG清除毒性Aβ，因此TLR-2可能同時(shí)介導(dǎo)對(duì)Aβ的清除和誘導(dǎo)炎癥因子釋放。本實(shí)驗(yàn)IHC及qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示，D、E組TLR-2表達(dá)明顯增高，并聚集在Aβ斑塊周圍。NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它在免疫反應(yīng)與炎癥刺激中會(huì)發(fā)揮非常重要的作用。有研究報(bào)道通過氧化應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB的激活，促進(jìn)前炎癥因子IL-1β、TNF-α等的釋放〔9〕。許多NF-κB依賴性基因，尤其是促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β在MG中均有表達(dá)，NF-κB活化是AD病變的重要機(jī)制。AD時(shí)NF-κB過度活化，介導(dǎo)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)一步造成神經(jīng)損傷〔10〕。本文結(jié)果也顯示NF-κB表達(dá)與ELISA法檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-1β含量一致。有研究報(bào)道TLR-2可激活NF-κB，誘發(fā)TNF-α、IL-1β釋放〔11～13〕，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Aβ上調(diào)TLR-2、NF-κB表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥因子釋放，損傷神經(jīng)元。

綜上，可推測(cè)Aβ被MG表面的TLR-2識(shí)別，激活MG，當(dāng)Aβ劑量較低時(shí)，TLR-2促進(jìn)MG對(duì)Aβ的吞噬和清除，并激活NF-κB，促進(jìn)炎癥因子如TNF-α、IL-1β等釋放，但釋放較少，不引起神經(jīng)元損傷，還可能具有保護(hù)作用；隨著Aβ劑量不斷增加，當(dāng)Aβ在腦內(nèi)到達(dá)一定濃度時(shí)，作為一種炎性刺激因子，可誘導(dǎo)MG增殖、活化，并刺激神經(jīng)毒性物質(zhì)的表達(dá)，TLR-2促進(jìn)MG吞噬和清除Aβ的能力不足以清除腦內(nèi)過多得Aβ，進(jìn)一步激活NF-κB，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，并通過反饋環(huán)路刺激MG分泌炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、TNF-α等釋放，導(dǎo)致炎癥過程的持續(xù)放大，形成一個(gè)惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。

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〔2015-12-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省教育廳重點(diǎn)資助課題(No.ZD20131051)；河北省高校重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(No.20130337)

1 承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院

王瑞婷(1969-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制及中藥抗癡呆作用研究。

狄婷婷(1981-)，女，副教授，碩士，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制研究。

R749

A

1005-9202(2016)23-5780-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.005