張海峰 呂 游 王洪莎 魏 祺 雷嫚嫚 郭蔚瑩

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院介入治療科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

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硫酸鋅對(duì)糖尿病皮膚損傷的修復(fù)作用

張海峰 呂 游1王洪莎1魏 祺1雷嫚嫚1郭蔚瑩1

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院介入治療科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 研究硫酸鋅對(duì)糖尿病伴有皮膚創(chuàng)面愈合的影響。方法 采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備糖尿病大鼠模型(48只)，成模1個(gè)月后，進(jìn)行背部9 cm2銳器皮膚損傷。爾后分2組：1組在傷愈過(guò)程中局部涂抹硫酸鋅，另1組局部涂抹生理鹽水自然愈合。以正常大鼠皮膚損傷為對(duì)照組(48只)。在創(chuàng)面愈合的不同時(shí)間點(diǎn)，采用創(chuàng)面愈合百分率計(jì)算大鼠皮膚創(chuàng)面愈合速度；通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)動(dòng)態(tài)觀察糖尿病創(chuàng)面愈合的過(guò)程及其組織學(xué)變化特征。 結(jié)果 第15天時(shí)，糖尿病硫酸鋅組較鹽水組愈合面積更大， 創(chuàng)面組織微血管密度(MVD)相比更大(均P<0.05)；增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)陽(yáng)性細(xì)胞在糖尿病硫酸鋅組較鹽水組表達(dá)增高(P<0.05)；糖尿病硫酸鋅組的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2在第5天和第10天時(shí)間點(diǎn)減少，且低于鹽水組(P<0.05)。糖尿病硫酸鋅組的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 mRNA含量在第5天和第10天時(shí)約為鹽水組的2倍，15 d時(shí)下降低于鹽水組(P<0.05)。 結(jié)論 硫酸鋅對(duì)于糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面具有良好的促進(jìn)愈合作用，其機(jī)制與創(chuàng)面MMPs表達(dá)和基質(zhì)重建有關(guān)。

糖尿??；硫酸鋅；傷口愈合；MMPs

由于代謝和微循環(huán)障礙的原因，很多糖尿病(DM)患者可同時(shí)合并多種皮膚疾病〔1〕，主要表現(xiàn)為皮膚一旦出現(xiàn)破潰后創(chuàng)面難以愈合、局部感染和糖尿病足等，而這些病變的發(fā)生與神經(jīng)病變、血管病變以及DM皮膚組織的創(chuàng)面愈合能力低下等因素有密切關(guān)系。創(chuàng)傷愈合是多因素參與的病理生理過(guò)程，主要分為止血、炎癥、增殖和塑形4個(gè)階段〔2〕。除了炎癥細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、多種細(xì)胞因子、微量元素外，細(xì)胞外基質(zhì)共同參與此過(guò)程。任何一個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控異常均可導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲〔3〕。鋅是人體內(nèi)重要的微量元素之一，是維持人體各種酶系統(tǒng)的必需成分。鋅不僅作為酶的輔助因子參與糖、蛋白質(zhì)代謝，同時(shí)還參與某些酶的激活〔4〕。當(dāng)機(jī)體鋅缺乏時(shí)，會(huì)出現(xiàn)皮膚黏膜損傷的愈合延遲，說(shuō)明鋅能夠促進(jìn)皮膚及組織損傷的生長(zhǎng)和促進(jìn)傷口愈合。此外還有數(shù)據(jù)表明，鋅能夠拮抗氧化應(yīng)激、穩(wěn)定抗氧化酶活性，在清除氧自由基的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。鋅缺乏導(dǎo)致抗氧化酶的抗氧化能力下降，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激增加〔5〕。筆者擬探討硫酸鋅對(duì)糖尿病皮膚損傷修復(fù)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)和硫酸鋅購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Trizol試劑盒及cDNA合成試劑購(gòu)于美國(guó)Life公司，增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)和CD34抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)公司，SP試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)于福州邁新公司，熒光定量qPCR試劑盒購(gòu)于北京博奧生物公司。

1.2 動(dòng)物 Wistar大鼠96只，雄性，體重180～220 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 DM大鼠模型的建立 實(shí)驗(yàn)組：以50 mg/kg STZ行腹腔一次性注射。注射72 h，尾靜脈取血，測(cè)血糖。出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象者，且血糖>16.7 mmol/L確定為DM大鼠。成模大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，每周稱量體重，隔周檢測(cè)血糖，持續(xù)監(jiān)測(cè)8 w。非DM組大鼠用等量枸櫞酸-枸櫞酸鈉液注射。

1.4 皮膚創(chuàng)傷模型的建立與分組 大鼠成模1個(gè)月之后，采用2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，脊背去毛，無(wú)菌條件下切除面積為9 cm2(直徑約3.4 cm)圓形皮膚，切口深度達(dá)皮下組織全層。為避免感染，大鼠單籠飼養(yǎng)。大鼠隨機(jī)分為鋅處理組(DM/Zn組)、鹽水對(duì)照組(DM/SA組)、非糖尿病組(NDM組)、非糖尿病鋅組(NDM/Zn組)。每組24只。

1.5 免疫組織化學(xué) 在創(chuàng)傷后5、10、15 d時(shí)間點(diǎn)，每組分別處死8只大鼠。取少許周?chē)＝M織和創(chuàng)面肉芽組織，固定，包埋。石蠟切片制成厚度為3 μm的切片，4℃條件下保存?zhèn)溆?。采用SP試劑盒并按說(shuō)明操作：切片水化后，0.01 mol/L 的PBS洗滌3 min×3；然后置于檸檬酸緩沖液中92℃～95℃保溫20 min，在室溫條件下自然冷卻至37℃；加入50 μl 3%的H2O2室溫下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶。PBS洗滌3 min×3；加50 μl 5%山羊血清，室溫下孵育10 min；切片滴加50 μl抗體PCNA 或CD34(免抗-CD34，兔抗-PCNA)；4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗3 min×3次，加50 μl生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10 min，PBS洗，3 min×3次；然后滴加50 μl 鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化酶溶液，室溫孵育10 min，PBS洗，3 min×3；加入DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。設(shè)有PBS(代替一抗)的陰性對(duì)照。結(jié)果判定采用KS400圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Kaiser公司)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析 顯微圖像采集及分析創(chuàng)面微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)：采用抗CD34抗體標(biāo)記皮膚切片組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，以孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇為1條單獨(dú)的微血管，參考Pareek等〔6〕的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。創(chuàng)面愈合面積百分比計(jì)算：采用Adobe Image Ready7.0和Osiris軟件進(jìn)行面積計(jì)算。在傷后24 h進(jìn)行創(chuàng)面面積第1次測(cè)量為初始創(chuàng)傷面積；于取材時(shí)測(cè)量各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積，愈合面積=初始創(chuàng)面面積-各時(shí)相點(diǎn)面積。創(chuàng)面愈合面積百分比=愈合面積/初始創(chuàng)面面積×100%。創(chuàng)緣局部PCNA的表達(dá)測(cè)定采取KS400圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Kaiser公司)分析：切片置于光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀察，以細(xì)胞核呈現(xiàn)明確的棕黃色顆粒狀染色為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核藍(lán)染的細(xì)胞為蘇木精復(fù)染的陰性細(xì)胞，隨機(jī)在鏡下選擇均勻視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例。

1.7 實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1在轉(zhuǎn)錄水平的變化 通過(guò)Trizol法提取皮膚組織中的總RNA，從提取得到的總RNA中取10 μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA產(chǎn)物，使用晶芯RT-Cycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：MMP-2上游引物5′-ACC ATC GCC CAT CAT CAA GT-3′，下游引物5′-CGA GCA AAA GCA TCA TCC AC-3′；MMP-9，上游引物5′-AGT TTG GTG TCG CGG AGC AC-3′，下游引物5′-TAC ATG AGC GCT TCC GGC AC-3′；TIMP-1上游引物 5′-CCA CCT TAT ACC AGC GTT ATG-3′，下游引物5′-GGC AAA GTG ATC GCT CTG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′，下游引物5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′ 。擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃、10 min；94℃、1 min，60℃、30 s，72℃、50 s， 40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)在延伸75℃時(shí)讀板，收集熒光值。得到的結(jié)果以β-actin基因作為內(nèi)參照，計(jì)算PCR產(chǎn)物相對(duì)量。mRNA的相對(duì)表達(dá)根據(jù)公式Fold change=2-ΔΔCt,ΔCt = Ct(target)- Ct(β-actin),Δ(ΔCt)=ΔCt(treated)-ΔCt(untreated)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件做單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠干預(yù)治療前后愈合能力的比較 損傷后15 d，DM組大鼠皮膚創(chuàng)面大部分尚未愈合，非DM組大鼠皮膚創(chuàng)面已基本愈合。定量分析愈合面積，在損傷后5、10、15 d，創(chuàng)面愈合面積百分比顯著減少(P<0.05)，表明DM大鼠創(chuàng)面存在難以愈合及愈合延遲的現(xiàn)象。在15 d，硫酸鋅處理組的愈合率明顯高于鹽水組(P<0.05)。正常大鼠皮膚創(chuàng)面應(yīng)用硫酸鋅處理與未處理組無(wú)明顯差別(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 免疫組化PCNA、CD34陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá) CD34和PCNA主要表達(dá)在皮膚創(chuàng)面組織的間質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，DM/Zn組CD34表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與DM/SA組比較明顯增加(見(jiàn)圖1)。DM組大鼠皮膚創(chuàng)面MVD值在傷后5、10和15 d均明顯低于非DM組(P<0.05)；第15天時(shí)，鋅處理組與鹽水組MVD值相比較更多(P<0.05)。見(jiàn)表2。在DM/Zn組中PCNA的表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，與DM/Zn組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。正常大鼠皮膚創(chuàng)面應(yīng)用硫酸鋅處理與未處理組無(wú)明顯差別(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組別5d10d15dDM/Zn組11.48±3.5138.73±6.101)2)59.05±8.601)2)DM/SA組11.31±2.6133.24±5.1748.78±8.56NDM/Zn組28.98±6.0574.34±8.5086.88±9.30NDM組27.64±5.6472.15±10.9985.45±7.53

與DM/SA組比較：1)P<0.05；與5 d比較：2)P<0.05；下表同

組別5d10d15dDM/Zn組8.00±2.0011.67±1.531)2)15.33±1.531)2)DM/SA組5.67±1.157.67±0.589.67±0.58NDM/Zn組13.86±3.2026.88±2.9620.86±1.02NDM組12.00±2.6524.00±2.0021.00±1.00

圖1 CD34和PCNA在DM大鼠皮膚損傷創(chuàng)面組織中的表達(dá)(Bar=50 μm)

2.3 DM皮膚缺損愈合過(guò)程中MMP-2、MMP-9及TIMP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 非DM組中第5天時(shí)，MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，10 d時(shí)下降，至第15天時(shí)顯著下降；TIMP-1在第5天和第10天保持恒定，第15天顯著下降。DM/Zn組的MMP-2在第5天和第10天保持恒定，第15天顯著下降；MMP-9在第5天、第10天時(shí)呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)，而至第15天時(shí)則顯著減少，低于DM/SA組(P<0.05)。DM/Zn組的TIMP-1 mRNA含量在第5天和第10天時(shí)約為DM/SA組的2倍，15 d時(shí)下降低于DM/SA組(P<0.05)。見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 MMP-2 mRNA在大鼠皮膚創(chuàng)面組織的表達(dá)變化

圖3 MMP-9 mRNA在大鼠皮膚創(chuàng)面組織的表達(dá)變化

圖4 TIMP-1 mRNA在大鼠皮膚創(chuàng)面組織的表達(dá)變化

3 討 論

創(chuàng)面愈合是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程〔7〕，對(duì)于皮膚創(chuàng)面的愈合過(guò)程影響最大的主要有三方面：血管病變、神經(jīng)病變和高血糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)不穩(wěn)定均可以導(dǎo)致創(chuàng)面愈合的延遲。

微量元素鋅不僅能夠參與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝酶的輔助因子，同時(shí)鋅也是許多葡萄糖代謝酶的構(gòu)成部分，在能量代謝過(guò)程中起重要作用。鋅在胰島素中含量很高，能夠增強(qiáng)胰島素穩(wěn)定性，鋅還能在受體水平調(diào)控胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)降血糖作用〔8〕。Miranda等〔9〕發(fā)現(xiàn)鋅通過(guò)增強(qiáng)胰島素受體的酪氨酸磷酸化過(guò)程，使葡萄糖攝取與利用明顯增加；同時(shí)，鋅具有一定的類(lèi)胰島素樣活性，在不依賴于胰島素的條件下，鋅同樣可使胰島素受體發(fā)生酪氨酸磷酸化。本研究表明，硫酸鋅可部分降低血糖濃度。

有研究表明，鋅作為清除氧自由基過(guò)程中的重要因子，能夠維持抗氧化酶穩(wěn)定性〔10〕。Soinio等〔11〕的臨床研究顯示，血清中與含鋅水平正常的DM患者相比較，含鋅水平較低的DM患者患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)要更高，而且單獨(dú)補(bǔ)鋅對(duì)于含鋅水平較低的DM患者提高血清中含鋅水平，控制血糖水平有顯著效果。金屬硫蛋白(MT)是一種重要的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)蛋白，具有清除氧自由基的作用，是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)。Tang等〔12〕將MT siRNA沉默的心肌細(xì)胞用鋅處理與對(duì)照組的抗氧化能力并無(wú)顯著差別，表明鋅的抗氧化作用是通過(guò)其誘導(dǎo)產(chǎn)生的金屬硫蛋白實(shí)現(xiàn)，而不是依靠鋅本身實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明，硫酸鋅外用可促進(jìn)局部細(xì)胞增殖和微血管增生，對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面具有良好的促進(jìn)愈合作用。

以往研究證明，MMP/TIMP的動(dòng)態(tài)平衡在創(chuàng)口愈合的過(guò)程中對(duì)控制創(chuàng)傷修復(fù)的結(jié)局至關(guān)重要。TIMPs作為MMPs的抑制因子，能有效抑制MMPs誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而調(diào)控基質(zhì)重塑和促進(jìn)新生血管生成。TIMPs的不足可導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈或慢性的傷口形成〔13〕。本研究顯示，鋅可能通過(guò)調(diào)控皮膚創(chuàng)面局部組織的MMP/TIMP的表達(dá)變化參與皮膚損傷修復(fù)。

盡管目前鋅促進(jìn)DM患者創(chuàng)面愈合的機(jī)制仍不明，但是本實(shí)驗(yàn)以及前人的結(jié)果證實(shí)，作為人體必需的微量元素，鋅對(duì)DM患者創(chuàng)傷愈合具有非常重要的意義。

1 Miracle LS,Barreda BF.Cutaneous manifestations of diabetes mellitus,a clinic manner for identify the disease〔J〕.Rev Endocrinol Nutr,2005;13(2):75-87.

2 Smith PD,Kuhn MA,Franz MG,etal.Initiating the inflammatory phase of incisional healing prior to tissue injury〔J〕.J Surg Res,2000;92(1):11-7.

3 Pastar I,Stojadinovic O,Yin NC,etal.Epithelialization in wound healing:a comprehensive review〔J〕.Adv Wound Care,2014;3(7):445-64.

4 Giacone F,Condorelli RA,Mongioi LM,etal.In vitro effects of zinc,D-aspartic acid,and coenzyme-Q10 on sperm function〔J〕.Endocrine,2016〔Epub a head of print〕.

5 D′Autreaux B,Toledano MB.ROS as signalling molecules:mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2007;8(10):813-24.

6 Pareek G,Shevchuk M,Armenakas NA,etal.The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density:a possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients〔J〕.J Urol,2003;169(1):20-3.

7 彭瑞云,王德文.創(chuàng)傷愈合中血管再生及其調(diào)控研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代康復(fù),2001;53:48.

8 孫家賢.糖尿病與微量元素鉻、銅、鋅、鎂〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1989;23(4):283.

9 Miranda ER,Dey CS.Effect of chromium and zinc on insulin signaling in skeletal muscle cells〔J〕.Biol Trace Elem Res,2004;101(1):19-36.

10 Faure P.Protective effects of antioxidant micronutrients(vitamin E,zinc and selenium)in type 2 diabetes mellitus〔J〕.Clin Chem Lab Med,2003;41:995-8.

11 Soinio M,Marniemi J,Laakso M,etal.Serum zinc level and coronary heart disease events in patients with type 2 diabetes〔J〕.Diabetes Care,2007;30(3):523-8.

12 Tang Y,Yang Q,Lu J,etal.Zinc supplementation partially prevents renal pathological changes in diabetic rats〔J〕.J Nutr Biochem,2010;21(3):237-46.

13 Fiorentino L,Cavalera M,Mavilio M,etal.Regulation of TIMP3 in diabetic nephropathy:a role for microRNAs〔J〕.Acta Diabetologica,2013;50(6):965-9.

〔2016-09-28修回〕

(編輯 曲 莉)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81300660);吉林省發(fā)改委(2013C029-3);吉林省(白求恩專項(xiàng))自然科學(xué)基金(20160101035JC)

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科

郭蔚瑩(1974-)，女，副教授，主要從事內(nèi)分泌代謝學(xué)研究。

張海峰(1975-)，男，副教授，主要從事介入治療學(xué)研究。

R587

A

1005-9202(2016)23-5777-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.004