陳四清 謝文英 尚立芝 季 書 潘曉麗 劉 坦 胡文豪

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

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二陳湯加味對慢性阻塞性肺疾病氧化應(yīng)激、沉默信息調(diào)節(jié)因子1表達(dá)的影響

陳四清 謝文英 尚立芝 季 書 潘曉麗 劉 坦 胡文豪

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

目的 探討二陳湯加味對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠氧化應(yīng)激及沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)1表達(dá)的影響。方法 50只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、二陳湯加味20、10、5 g/kg劑量組，10只/組。香煙煙熏加脂多糖制備COPD動物模型，造模30 d。第31天起，對正常組、模型組灌胃(ig)生理鹽水10 ml/kg，3個二陳湯加味組分別以20、10、5 g/kg劑量ig，連續(xù)14 d。檢測肺功能、血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)含量；酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定外周血單個核細(xì)胞中Sirt1濃度，酶聯(lián)免疫熒光法測定外周血單個核細(xì)胞中Sirt1活性，實(shí)時熒光定量PCR檢測外周血單個核細(xì)胞中Sirt1 mRNA表達(dá)，光鏡觀察炎細(xì)胞及肺組織病理形態(tài)。結(jié)果 與正常組比較，模型組肺勻漿中SOD和GSH-Px活性均顯著降低(均P<0.01)，MDA含量顯著增加(P<0.05)，支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著增高(均P<0.01)，模型組外周血單個核細(xì)胞中Sirt1 mRNA表達(dá)，Sirt1含量及其活性均顯著減低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，二陳湯加味10、20 g/kg劑量組BALF中炎細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05或P<0.01)；GSH-Px和SOD活性均顯著增高，MDA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，二陳湯加味10、20 g/kg劑量組外周血單個核細(xì)胞中Sirt1 mRNA表達(dá)，Sirt1含量及其活性均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 二陳湯加味有抗氧化損傷作用，其可能通過增加SOD和GSH-Px活性，減少M(fèi)DA生成，增強(qiáng)Sirt1基因的表達(dá)，提高Sirt1活性，發(fā)揮抗氧化損傷而保護(hù)肺的結(jié)構(gòu)與功能。

慢性阻塞性肺疾病；支氣管肺泡灌洗液；氧化應(yīng)激，沉默信息調(diào)節(jié)因子1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)生與氧化損傷、炎癥反應(yīng)等有關(guān)〔1，2〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)1是一種組蛋白去乙?；?，通過去乙?；{(diào)節(jié)多種蛋白酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性，參與多種基因的遺傳調(diào)控，在氧化損傷、炎癥、腫瘤等過程中發(fā)揮重要作用〔3～5〕。研究顯示Sirt1與COPD密切相關(guān)〔6〕，Sirt1表達(dá)與氧化損傷產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)〔7〕。二陳湯源于宋代《太平惠民和劑局方》，具有燥濕化痰、理氣和中的功效，但其作用機(jī)制有待深入研究。本研究觀察二陳湯加味對COPD肺功能、氧化應(yīng)激、Sirt1基因表達(dá)及其活性的影響，探討二陳湯加味對COPD抗氧化損傷的作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 二陳湯加味方藥物組成：炙麻黃6 g(批號1403125s)、姜半夏10 g(批號1309001H)、葶藶子10 g(批號1308001s)、茯苓15 g(批號1309001H)、陳皮10 g(批號1302001H)、黨參10 g(批號1407002w)、白術(shù)10 g(批號1403003s)、苦杏仁10 g(批號1402001w)、甘草6 g(批號1302001S)等均為三九醫(yī)藥生產(chǎn)中藥配方顆粒。

1.2 動物 SD雄性大鼠50只，6月齡，體質(zhì)量230～270 g，SPF級。河南省動物實(shí)驗中心出售，河南省動物質(zhì)量監(jiān)督監(jiān)測站(質(zhì)量合格證：No.41003100001905)，許可證號：SYXK(豫)2010-0001。

1.3 儀器 inspira小動物用呼吸機(jī)(日本，光電)，TopScan小動物肺功能測量系統(tǒng)(吉安德爾科技有限公司)，SF-3000動物用血液分析儀(EHSY)，ABL80型血?dú)夥治鰞x(丹麥，Radiometer公司)，DU640型紫外分光光度儀(美國，BECKMAN)，VCX500型超聲處理儀(美國，SONICS)，Powerwave XS全波長掃描酶標(biāo)議(美國，Bio-tek)，伯樂1575全自動酶標(biāo)洗板機(jī)(美國，伯樂公司)。ETTAN IPGPHOR3雙向電泳儀(美國，GE)，ABI9700普通PCR儀(美國，ABI公司)，PT2100勻漿機(jī)(POLYTRON)，272007028實(shí)時熒光定量PCR儀(美國，Applied biosystem)。U-CMAD3型顯微鏡(日本，Olympus)，20486型顯微攝像儀(日本，Olympus)。

1.4 試劑 紅旗渠牌香煙(烤煙型，焦油含量14 mg/支，尼古丁1.1 mg/支，河南安陽卷煙廠)。脂多糖(LPS，701c034，L8880，solarbio公司)，血?dú)夥治鰞x試劑盒(wi80521，美國)。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，比色法，A005)、丙二醛(MDA，TBA法，A003-1)、超氧化物歧化酶(SOD，WST-1法，A003-3)測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所?？筍irt1多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，Sirt1 ELISA試劑盒(Abnova產(chǎn)品)，Sirt1 活性檢測試劑盒(Sigma公司，美國)?？俁NA提取試劑盒(RNA-50)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(R211-01)、染料法qPCR試劑(Q141-02)、Oligo合成(D12540)均為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.5 方法

1.5.1 動物分組 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、二陳湯加味5 g/kg，10 g/kg，20 g/kg劑量組，每組10只。

1.5.2 模型制備 ①參照文獻(xiàn)〔8〕制備熏香煙加脂多糖誘導(dǎo)COPD大鼠模型。在造模第1、14天，所有動物均經(jīng)氣管注入溶于生理鹽水的脂多糖 200 μl(1 g/L)；除第14天外，第2～30天將大鼠置入熏箱內(nèi)，熏香煙煙霧染毒，2次/d，香煙8支/次，30 min/次。

1.5.3 給藥方案 3個二陳湯加味治療組分別予5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg二陳湯加味，灌胃(ig)，正常組、模型組生理鹽水10 ml/kg，ig，連續(xù)14 d。

1.5.4 指標(biāo)檢測

1.5.4.1 肺勻漿SOD和GSH-Px活性、MDA含量測定 按照試劑盒說明書，分光光度儀測定SOD和GSH-Px活性、MDA含量。在532 nm、412 nm、550 nm，分別比色測MDA、GSH-Px、SOD各管吸光度值。

1.5.4.2 檢測Sirt1含量 嚴(yán)格按照說明書操作，ELISA法酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠外周血單個核細(xì)胞中Sirt1含量。

1.5.4.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎細(xì)胞分類及計數(shù) BALF中的細(xì)胞總數(shù)=細(xì)胞數(shù)(個/ml)×BALF毫升數(shù)，瑞氏-姬姆薩染色進(jìn)行細(xì)胞分類，計算巨噬細(xì)胞總數(shù)及所占的百分?jǐn)?shù)。

1.5.4.4 外周血單個核細(xì)胞分離 用單個核細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞〔9〕。

1.5.4.5 Sirt1活性檢測 使用活性熒光分析試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.4.6 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測細(xì)胞內(nèi)Sirt1 mRNA表達(dá)量 第一步：提取總RNA。將分離的外周血單個核細(xì)胞放入PE管中，加入250 μl×2次 RL Solution溶液(組織、細(xì)胞裂解液)。加40 μl氯仿萃取劑，充分混勻后，離心12 000 r/min，3 min。抽取300 μl上清液，置于1.5 ml的Tube管中，再加入等體積無水乙醇。將勻液加入Spin columin 管中，離心12 000 r/min，1 min,棄濾液。配制提取洗脫液：80 ml無水乙醇+20 ml提取洗脫液=100 ml，抽取600 μl提取洗脫液加入Spin columin 管中，12 000 r/min，1 min離心，棄濾液。Spin空管，12 000 r/min，2 min離心，徹底去除廢液。將Spin管放入新的DEPC處理過的1.5 ml Tube管中。抽取40 μl DEPC水加到白色膜狀RNA上，室溫放置1～2 min后，12 000 r/min,1 min離心。收集濾液，扔掉白色膜狀物，得到總RNA提取液。第二步：反轉(zhuǎn)錄cDNA。反應(yīng)條件：Hiscript II Enzyme MIX 2 μl，2×RT Mix 10 μl，Oligo dT 1 μl，Random hexamers 1 μl，提取的總RNA 3 μl，ddH2O 3 μl共 20 μl。第三步：qPCR 反應(yīng)體系。(1)配制染料和引物的混合液：Master Mix 10 μl，上、下游引物各0.4 μl，共10.8 μl。(依照上述方法，分別配出Sirt1，GADPH)。(2)配制cDNA混合液：模板cDNA 1 μl，DECP 8.2 μl，共9.2 μl。使用實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Sirt1的上游引物5′-CAGGTTGCGGGAATCCAA-3′，下游引物5′-CAGGCAAGATGCTGTTGCA-3′，擴(kuò)增片段長度 95 bp；GAPDH 上游引物5′-AGGGCTGTTCGTGAGCACA-3′，下游引物5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′，擴(kuò)增片段長度 159 bp。采用20 μl反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40個循環(huán)。計算各組Sirt1 mRNA相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.5軟件，計量資料多組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般狀況 實(shí)驗結(jié)束時，正常組一般狀況好，體重增長，處死2只。模型組處死2只用于組織病理。低劑量組死亡2只。二陳湯加味10、20 g/kg組各死亡1只，存活大鼠體重增加。

2.2 肺勻漿中SOD、GSH-Px、MDA結(jié)果 模型組肺組織勻漿中SOD和GSH-Px活性均顯著低于正常組(均P<0.01)，MDA含量顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，二陳湯10、20 g/kg劑量組中SOD和GSH-Px活性均顯著高于模型組、MDA含量顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，或P<0.01)。見表1。

2.3 BALF中炎細(xì)胞計數(shù)和分類比較 與正常組比較，模型組BALF中炎細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著增高(均P<0.01)。與模型組比較，二陳湯加味10、20 g/kg劑量組炎細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05，或P<0.01)。見表2。

組別劑量(g/kg)SOD活性(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)正常組-175.31±0.3549.36±1.525.42±1.43模型組-64.71±1.372)7.65±0.922)23.45±1.342)二陳湯加味組559.35±0.523)13.35±0.433)15.53±0.3410156.41±1.464)35.74±0.384)8.58±1.344)20145.47±1.384)32.31±0.464)8.25±1.364)

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

組別劑量(g/kg)炎細(xì)胞計數(shù)(×109/L)炎細(xì)胞分類(%)中性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞正常組-4.31±0.2371.33±0.525.86±0.32模型組-12.45±0.431)83.78±0.231)11.39±0.361)二陳湯加味組512.23±0.373)82.31±0.2410.56±0.473)105.62±0.273)71.52±0.763)8.67±0.434)206.38±0.463)72.41±0.363)8.12±0.434)

2.4 外周血單個核細(xì)胞中Sirt1 mRNA表達(dá)、Sirt1含量及其活性 與正常組比較，模型組Sirt1 mRNA表達(dá)、Sirt1含量及Sirt1活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，二陳湯加味10、20 g/kg劑量組Sirt1 mRNA表達(dá)、Sirt1含量及Sirt1活性顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表3。

組別劑量Sirt1mRNA(相對表達(dá))Sirt1含量(OD)Sirt1活性RFU/(h·μg)正常組-0.71±0.030.78±0.011.74±0.15模型組-0.26±0.052)0.32±0.021)0.28±0.212)二陳湯加味組50.33±0.040.35±0.010.63±0.223)100.51±0.043)0.65±0.034)1.41±0.294)200.52±0.043)0.62±0.024)1.42±0.364)

3 討 論

COPD是常見的以氣道氣流受限為特征的慢性炎癥性疾病，氣流受阻呈進(jìn)行性發(fā)展。氧化/抗氧化失衡是COPD的重要病理生理機(jī)制。COPD時過多的自由基可直接降低SOD和GSH-Px活性，使肺組織防御過氧化的能力下降〔10〕。COPD的臨床表現(xiàn)屬中醫(yī)“痰飲”、“喘證”等范疇。二陳湯源于宋代《太平惠民和劑局方》，由半夏、陳皮、茯苓、甘草組成，有理氣化痰，燥濕和中之效。本方在二陳湯基礎(chǔ)上加杏仁、炙麻黃以祛痰止咳平喘；加黨參、白術(shù)、健脾和胃、活血祛瘀，加葶藶子以瀉肺降氣。諸藥合用，共奏宣肺降氣、止咳平喘、活血化瘀等功。

氧化應(yīng)激和炎癥是COPD發(fā)病的關(guān)鍵。COPD病變過程中氧化損傷增加中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞滲出，炎細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子增加。本研究結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞浸潤在COPD中起重要作用。與文獻(xiàn)報道相近〔11〕，二陳湯加味通過抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤起到抗感染作用。

氧化應(yīng)激可致組織過氧化損傷。SOD和GSH-Px都是機(jī)體內(nèi)源性清除氧自由基的酶，MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，測定SOD、GSH-Px和MDA可以反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。本研究顯示，模型組存在明顯的氧化損傷，二陳湯加味可能通過抗氧化損傷而發(fā)揮保護(hù)肺組織的作用。

Sirtuins 是近年來發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙酰化酶，Sirt1是Sirtuins家族主要成員，Sirt1通過組蛋白的賴氨酸殘基去乙?；謴?fù)組蛋白正電荷，與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)更加卷曲致密，構(gòu)型不易發(fā)生變化，阻礙DNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制而致基因沉默〔12〕。抑制炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和合成，對抗炎癥反應(yīng)〔13〕。Sirt1參與調(diào)控DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老等多種病理生理過程，在抗衰老、糖脂代謝、腫瘤和心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用〔14〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組外周血單個核細(xì)胞中Sirt1 mRNA表達(dá)、Sirt1含量及其活性均顯著減低。COPD的氧化/抗氧化失衡，過氧化物使Sirt1活性降低甚至失去活性，對炎癥因子基因的抑制作用減弱，炎癥因子釋放增多〔15〕。煙草中的成分能下調(diào)支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中Sirt1的表達(dá)及活性，影響其下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展〔16，17〕。Sirt1激活劑能誘導(dǎo)線粒體減少氧自由基生成〔18〕。Sirt1表達(dá)與氧化損傷產(chǎn)物負(fù)相關(guān)〔19〕。COPD患者存在抗氧化能力降低，提高Sirt1活性有望成為治療呼吸系統(tǒng)疾病的新的治療靶點(diǎn)〔20〕。在Sirt1轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，適度上調(diào)Sirt1，可促進(jìn)過氧化氫酶表達(dá)，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激〔21〕，提示二陳湯加味可能通過增強(qiáng)Sirt1表達(dá)，激活Sirt1活性對抗氧化應(yīng)激，保護(hù)肺組織。但其機(jī)制有待深入研究。

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〔2016-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effect of supplemental Erchen decoction on role of oxidative stress and Sirt1 in rats with chronic obstructive pulmonary disease

CHEN Si-Qing, XIE Wen-Ying, SHANG Li-Zhi,et al.

Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008, Henan, China

Objective To study the effect of supplemental Erchen decoction on Sirt1 levels in serum，the activity of Sirt1in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).Methods COPD was made by smoke combined with LPS. Rats were randomly divided into normal, model, Supplemental Erchen decoction groups (5，10，20 g/kg). Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine serum Sirt1 level in rat. The activity of Sirt1 was determined by enzyme-linked immune fluorescence. Real-time quantitative PCR method was used to detect the expression of Sirt1 mRNA.Results The levels of SOD and GSH-Px in lung tissue were significantly lower and MDA was higher in model group than those of normal group (P<0.01). The total number of neutrophils and inflammatory cells were significantly increased in model group than those of normal group in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)(P<0.01). mRNA, content and activity of Sirt1 in model group were higher than those in normal group significantly (P<0.01). Compared with model group, the inflammatory cells counts, neutrophils, macrophages were decreased(P<0.01,P<0.05), SOD, GSH-Px activity were increased, MDA content was decreased (P<0.01,P<0.05), mRNA, content and activity of Sirt1 in 10, 20 g/kg Supplemental Erchen decoction groups.Conclusions Supplemental Erchen decoction has anti-oxidative effect, which may be related with increasing SOD, GSH-Px activities, reducing MDA, increasing expression of Sirt1 gene and enhancing activity of Sirt1 so that protecting lung structure and function by anti-oxidative injury.

Chronic obstructive pulmonary disease; Bronchial alveolar lavage fluid (BALF); Oxidative stress; Sirtuins(Sirt)1

國家自然科學(xué)基金面上項目(81573881)；鄭州市科技領(lǐng)軍人才項目(121PLJRC535)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項目(15A360030)；河南省科支重點(diǎn)攻關(guān)(152102310337)；河南省教育廳資助項目(2010A360024)；河南省科技攻關(guān)項目(112102310314)；河南中醫(yī)學(xué)院研究生教育研究課題(2014YJX001)；河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)項目(2015JCJX10)；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項課題(2013ZY02070)；河南中醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習(xí)項目(CXXM〔2015〕0017，CXXM〔2015〕0063)

尚立芝(1966-)，女，教授，主要從事中醫(yī)藥作用機(jī)制研究。

陳四清(1966-)，男，副教授，主要從事中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)23-5774-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.003