張冬麗，王 偉，張紅霞

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 開(kāi)封 475000)

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研究報(bào)告

siRNA沉默Bmi-1基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

張冬麗，王 偉，張紅霞

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 開(kāi)封 475000)

目的探討siRNA沉默B細(xì)胞特異的莫洛尼白血病病毒插入位點(diǎn)1基因(Bmi-1)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響研究。方法通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA Bmi-1及陰性對(duì)照(control)到人宮頸癌Hela細(xì)胞，采用Realtime PCR及western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Bmi-1的表達(dá)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Annexin V-PI流式雙染及Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，western blot法檢測(cè)細(xì)胞中p16，p53，CyclinD1及Rb的表達(dá)。結(jié)果與Control組比較，siRNA Bmi-1組細(xì)胞中Bmi-1蛋白及mRNA表達(dá)量皆顯著降低(P<0.01)，同時(shí)細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡率提高(P<0.01)，細(xì)胞周期阻滯在G1期(P<0.01)，細(xì)胞中p16表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)，p53及CyclinD1表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)，Rb磷酸化水平降低(P<0.01)。結(jié)論Bmi-1具有抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的作用，可能與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

宮頸癌是常見(jiàn)婦科腫瘤，發(fā)病率居女性惡性腫瘤第二位，對(duì)女性身心健康造成嚴(yán)重危害，在我國(guó)，宮頸癌發(fā)病率及死亡率逐年上升，并呈現(xiàn)年輕化[1-2]。宮頸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種因素，多個(gè)階段共同作用的結(jié)果。研究表明早婚早育，人乳頭瘤病毒感染，遺傳，環(huán)境，不健康性行為是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的高危因素，除此之外，癌基因的激活與抑癌基因的失活也是宮頸癌發(fā)生的主要原因之一[3]。B細(xì)胞特異的莫洛尼白血病病毒插入位點(diǎn)1基因(B-cell specific moloney murine leukemiavirus integration site，Bmi-1)是一種新近發(fā)現(xiàn)的被認(rèn)為具有癌基因特性的基因，對(duì)于細(xì)胞衰老，永生化及細(xì)胞周期的調(diào)控具有重要作用[4-6]。研究顯示Bmi-1在多種腫瘤中皆呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌，結(jié)腸癌，胃癌及肺癌等[5, 7]。不無(wú)例外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也在宮頸癌患者宮頸組織或者血漿中發(fā)現(xiàn)Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)皆高于正常宮頸組織，而且高表達(dá)的Bmi-1與臨床分期，分化程度，腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，且證實(shí)Bmi-1是宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因子[8-11]。從而說(shuō)明Bmi-1在宮頸癌中發(fā)揮著癌基因的作用，通過(guò)靶向Bmi-1可能可以作為宮頸癌治療新的治療方法。另外有研究證實(shí)下調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞中Bmi-1表達(dá)，能顯著的抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成及小鼠體內(nèi)成瘤[12]，但具體作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，所以本研究將在此基礎(chǔ)上，利用siRNA干擾Hela細(xì)胞中Bmi-1表達(dá)，進(jìn)而探討B(tài)mi-1下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞的增殖狀況及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

宮頸癌細(xì)胞Hela購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)：TCHu187。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗Bmi-1多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；兔抗p16，p53，CyclinD1，Rb，p-Rb，GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；Annexin V-PI流式雙染檢測(cè)試劑盒，Hoechst 33258染色試劑盒，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；siRNA Bmi-1及Control訂購(gòu)于上海吉瑪生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清，DMEM養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；Trizol試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，AF6000熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，F(xiàn)ACSCanto流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 siRNA Bmi-1的轉(zhuǎn)染

將宮頸癌細(xì)胞Hela接種于96、24或6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將siRNA Bmi-1及Control轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后，棄去轉(zhuǎn)染液，并通過(guò)Realtime PCR，western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.4 Realtime PCR檢測(cè)Bmi-1 mRNA表達(dá)

采用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，接著一步法RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄，最后Realtime PCR檢測(cè)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，如下：Bmi-1上游引物：5’-GAGGGTACTTCATTGATGCCACAA-3’，下游引物：5’-GCTGGTCTCCAGGTAACGAACAATA-3’，長(zhǎng)度357 bp；GAPDH上游引物：5’-GCACCGTC AAGGCTGAGAAC-3’， 下游引物：5’-TGGTGAAGA CGCCAGTGGA -3’；長(zhǎng)度402 bp。反轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA模板2 μL(1 μg)、dNTP混合物2 μL、MgCl22 μL、加EDPC補(bǔ)充蒸餾水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性 5 min， 95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)為40。采用2-△△CT計(jì)算mRNA相對(duì)值。

1.5 MTT法檢測(cè)Hela細(xì)胞活力

按“1.3”進(jìn)行操作后，分別于24、48、72、96 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)OD值，以O(shè)D值表示細(xì)胞相對(duì)活力。

1.6 Annexin V-PI流式雙染檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡

按“1.3”進(jìn)行操作后，48 h后消化收集細(xì)胞，避光染色30 min上機(jī)檢測(cè)。按照Annexin V-FITC/ PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 Hoechst染色檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡

按“1.3”進(jìn)行操作后，48 h后消化收集細(xì)胞，后按照Hoechst 33258染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

按“1.3”進(jìn)行操作后，48 h后消化收集細(xì)胞，后按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 Western blot

按“1.3”進(jìn)行操作后，48 h后消化收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，裂解細(xì)胞，吸取上清液即可獲得總蛋白。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白變性并上樣，進(jìn)行SDS凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。一抗(Bmi-1，p16，p53，CyclinD1，Rb，p-Rb，GAPDH，稀釋度為1:100)孵育，4℃過(guò)夜；二抗室溫孵育1～2 h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。并采用“Quantity one”軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 siRNA Bmi-1轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè)

注：與Control組比較，**P<0.01。

注：與Control組比較，**P<0.01。

如圖1及圖2所示，Control組及siRNABmi-1組細(xì)胞中Bmi-1蛋白及mRNA表達(dá)量分別為[(1.23±0.12)vs(0.13±0.01)]及[(1.17±0.11)vs(0.08±0.01)]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2.2 siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，在作用24、48、72、96 h時(shí)，與Control組比較，siRNA Bmi-1組細(xì)胞活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且在48、72、96 h時(shí)作用強(qiáng)度一致。

注：與Control組比較，**P<0.01。

圖4 流式雙染檢測(cè)siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of siRNA Bmi-1 on Hela cell apoptosis by flow cytometrydouble staining

2.3 siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞凋亡情況的影響

如圖4，圖5，表2所示，經(jīng)流式雙染及Hoecsht染色發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，siRNA Bmi-1組細(xì)胞凋亡率顯著提高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞凋亡情況的影響Tab.1 Effect of siRNA Bmi-1 on Hela cell apoptosis

注：→，細(xì)胞凋亡。

2.4 siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

如圖6所示，與Control組比較，siRNA Bmi-1組使細(xì)胞周期阻滯在G1期。

圖6 siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effect of siRNA Bmi-1 on Hela cell cycle

2.5 siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與Control組比較，siRNA Bmi-1組細(xì)胞中p16表達(dá)量顯著上調(diào)，CyclinD1及p53表達(dá)量顯著下調(diào)，Rb磷酸化水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與Control組比較，**P<0.01。

3 討論

宮頸癌同大多數(shù)腫瘤一樣，是一種以細(xì)胞過(guò)度增殖及無(wú)限生長(zhǎng)為特征的疾病，具體表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)度活躍，腫瘤組織生長(zhǎng)異常迅速，進(jìn)而惡性程度加劇，過(guò)程中最為主要的因素就是癌基因的激活及抑癌基因的失活。Bmi-1是1991年荷蘭癌癥中心在研究鼠淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白，屬于多梳基因家族中的一員，并具有癌基因特性，因而被認(rèn)為是一種原癌基因。Bmi-1被認(rèn)為可以通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞的自我更新，衰老及永生化，其在多種腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。近些年國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1與宮頸癌的發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移，預(yù)后等一系列病理過(guò)程密切相關(guān)。如國(guó)內(nèi)學(xué)者楊偉洪等[8]，桂影等[9]發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者宮頸組織中Bmi-1陽(yáng)性率顯著高于正常宮頸組織，且與臨床分期，組織分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。國(guó)外Tong等[10]，Zhang等[11]研究證實(shí)宮頸癌患者宮頸組織及血漿中Bmi-1蛋白及mRNA表達(dá)量皆顯著高于正常宮頸組織，且高表達(dá)的Bmi-1與臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管侵襲及人乳頭瘤感染密切相關(guān)，同時(shí)高表達(dá)的Bmi-1預(yù)示著宮頸癌患者預(yù)后差。上述研究提示了Bmi-1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在宮頸癌的形成及進(jìn)展中起著癌基因的作用。此外Zhang等[13]不僅證實(shí)了152例宮頸癌組織中Bmi-1高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)量高達(dá)63.2%，高表達(dá)的Bmi-1與腫瘤大小，臨床分期級(jí)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。且通過(guò)western blot證實(shí)了4株宮頸癌細(xì)胞(Hela，SiHa，Caski及C33A)中Bmi-1表達(dá)高于正常宮頸上皮細(xì)胞。同時(shí)Min等[12]研究表明RNA干擾介導(dǎo)的Hela細(xì)胞中Bmi-1表達(dá)量的下調(diào)，能顯著的抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，克隆形成，并抑制小鼠體內(nèi)腫瘤形成。從而說(shuō)明了Bmi-1作為宮頸癌的原癌基因，通過(guò)靶向下調(diào)其表達(dá)，能顯著的抑制腫瘤的細(xì)胞增殖及進(jìn)展。所以本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討siRNA Bmi-1對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制，首先通過(guò)MTT法，Annexin V-PI流式雙染及Hoechst染色證實(shí)siRNA Bmi-1能顯著的降低Hela細(xì)胞活力，同時(shí)提高細(xì)胞凋亡率，說(shuō)明下調(diào)Hela細(xì)胞中Bmi-1的表達(dá)，能顯著的遏制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，與Min等[12]研究結(jié)果一致。

Bmi-1 作為一種癌基因，能通過(guò)調(diào)控其下游靶基因如INK4a/ARF的表達(dá)，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。INK4a是Bmi-1的負(fù)性調(diào)節(jié)位點(diǎn)，其編碼p16 INK4a(p16)的表達(dá)，此蛋白是細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白抑制因子，當(dāng)Bmi-1表達(dá)下調(diào)或者缺失時(shí)，通過(guò)上調(diào)p16，能夠抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinD1與細(xì)胞周期素依賴(lài)蛋白激酶4/6(CDK4/6)的結(jié)合，進(jìn)而阻止Rb信號(hào)通路的激活，失去磷酸化形式的Rb能夠與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，進(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄，最終使得細(xì)胞周期停滯在G1期[14]。另外ARF編碼p14 ARF蛋白，此蛋白通過(guò)介導(dǎo)MDM2，進(jìn)而激活p53。p53不僅能夠直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)從而影響細(xì)胞的增殖與凋亡，也能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖狀態(tài)。崔學(xué)江等[15]研究表明siRNA Bmi-1對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞增殖的抑制作用，是通過(guò)上調(diào)p16及p14蛋白及mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。劉霞等[16]研究也表明siRNA Bmi-1能通過(guò)上調(diào)p16及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞株EC9706的增殖[16]。Zheng等[17]研究表明siRNA Bmi-1能通過(guò)p16/CyclinD1信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。但也有研究顯示siRNA Bmi-1能顯著的抑制肺腺癌細(xì)胞SPC-A1增殖，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期，但此過(guò)程并不依賴(lài)于p16所介導(dǎo)的CyclinD1來(lái)實(shí)現(xiàn)的[18]。我們的研究顯示siRNA Bmi-1不僅能下調(diào)p16表達(dá)，還能顯著的下調(diào)CyclinD1表達(dá)及Rb磷酸化水平，同時(shí)下調(diào)p53表達(dá)，最終使得細(xì)胞周期阻滯在G1期，此結(jié)論與大多數(shù)研究一致[15-17, 19]，從而說(shuō)明siRNA Bmi-1能通過(guò)p16/CyclinD1/Rb及p53信號(hào)通路，從而遏制Hela細(xì)胞的增殖。

綜上所述，siRNA Bmi-1能顯著的降低宮頸癌Hela細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能與調(diào)節(jié)其下游信號(hào)通路p16/CyclinD1/Rb及p53有關(guān)。同時(shí)有文獻(xiàn)也報(bào)道Bmi-1也可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路影響胰腺癌細(xì)胞的增殖[20]，且此信號(hào)通路是經(jīng)典的抗凋亡通路，本課題組可以進(jìn)一步探討B(tài)mi-1是否也可以通過(guò)此信號(hào)通路影響宮頸癌細(xì)胞的增殖，凋亡等生物學(xué)行為。

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Effect of siRNA silencing Bmi-1 gene on cell proliferation of cervical cancer cells

ZHANG Dong-li, WANG Wei, ZHANG Hong-xia

(Department of Obstetrics and Gynecology of the Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng, 475000, China)

Objective To explore effect of siRNA silencing B-cell specific Moloney murine leukemiavirus integration site (Bmi-1) gene expression on cell proliferation of cervical cancer cells. Methods Hela cells were transferred with control and siRNA Bmi-1. The expression of Bmi-1 in Hela cell was examed by Realtime PCR and western blot. The cell viability was detected by MTT. The cell apoptosis was examed by Annexin V-PI flow cytometry and Hoechst staining. Cell cycle was detected by flow cytometry. The expression of p16, p53, CyclinD1 and Rb was detected by western blot. Results Compared with control group, the expression of Bmi-1 protein and mRNA was down-regulated, the cell viability was decreased, cell apoptotic rate was increased, Cell cycle was arrested in the G1 phase, the expression of p16 was up-regulated, the expresson of p53 and CyclinD1 down-regulated, the phosphorylation of Rb was inhibited in siRNA Bmi-1 group. The difference was statistically significant (P<0.01). Conclusion Bmi-1 inhibited Hela cell proliferation via regulation of expression of cell cycle related protein.

B-cell specific Moloney murine leukemiavirus integration site (Bmi-1); Human cervical cancer Hela cells; Proliferation

張冬麗(1983-)，女，碩士生，主治醫(yī)師，E-mail： yjk20060701@163.com。

張紅霞。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0049-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.009

2016-06-28