黃 春，羅雅莉，李 沛，劉 青

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130)

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鼠傷寒沙門菌rmlD缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析

黃 春，羅雅莉，李 沛，劉 青

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130)

為了研究rmlD缺失對(duì)鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)生物學(xué)特性及毒力的影響，利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，構(gòu)建了rmlD缺失株S100ΔrmlD,并對(duì)其生物特性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，rmlD的缺失不影響鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)特性及對(duì)多黏菌素B、膽酸鹽的敏感性，但黏附和入侵人腸黏膜細(xì)胞INT407能力顯著增加。同時(shí)，rmlD缺失株毒力比野生株降低了約2000倍。以上結(jié)果表明，rmlD的缺失不影響鼠傷寒沙門氏菌的體外生長(zhǎng)及對(duì)宿主抗菌活性物質(zhì)的敏感性，但能顯著降低菌株毒力。因此，rmlD的缺失可以作為一條有效的減毒途徑。

鼠傷寒沙門氏菌;rmlD; 缺失; 毒力

沙門菌是一種非常重要的人獸共患病原菌，能夠引起人和動(dòng)物發(fā)熱、腸炎、敗血癥等多種疾病癥狀，呈全球性分布,是世界上引起食物中毒最多的病原菌[1-3]。沙門菌除感染人外，還感染很多動(dòng)物，包括各種家畜、家禽及犬、貓等，嚴(yán)重危害著人類和畜禽的健康[4-5]。

脂多糖(LPS)是細(xì)菌重要毒力因子，也是細(xì)菌維持群集運(yùn)動(dòng)[6-7]、入侵細(xì)胞及胞內(nèi)復(fù)制[8-9]、腸腔定殖[10-11]、血清抵抗力[12-14]、抵制宿主巨噬細(xì)胞殺傷[15-16]等功能所必需的，以上功能直接關(guān)系到病原菌對(duì)機(jī)體的感染能力。研究表明，粗糙型的沙門氏菌(脂多糖LPS缺乏O抗原鏈)毒力低于光滑型的沙門氏菌(具有完整LPS)[17-18]。截?cái)嗌抽T氏菌LPS上O抗原和阻止O抗原在體內(nèi)表達(dá)都是開發(fā)沙門氏菌疫苗的重要策略[19]。L-鼠李糖(L-Rhamnose)是沙門菌O抗原鏈上的組成成分，rmlD是位于O抗原基因簇上L-Rhamnose活性前體dTDP-L-rhamnose合成途徑中的最后一個(gè)基因，編碼dTDP-6-脫氧-L-來(lái)蘇糖-4-酮糖-還原酶[20-22]。我們推測(cè)，rmlD的缺失很可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌LPS上O抗原的缺失，從而使細(xì)菌毒力減弱。本研究利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組對(duì)S.typhimurium的rmlD進(jìn)行敲除，研究rmlD對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等基本生物特性影響。同時(shí)，對(duì)rmlD突變株抵抗宿主機(jī)體活性物質(zhì)(陽(yáng)離子抗菌肽多黏菌素B和膽鹽DOC為代表)能力、黏附入侵能力及毒力影響等方面進(jìn)行了研究，為構(gòu)建理想的沙門氏菌減毒疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

鼠傷寒沙門氏菌菌株S100由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；自殺質(zhì)粒pYA4278及大腸桿菌宿主菌χ7232、χ7213由Curtiss實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[23],本實(shí)驗(yàn)室保存；同源重組所需的質(zhì)粒pQK246由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；人腸黏膜上皮細(xì)胞INT407由本實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑

PrimeSTAR?Max DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自TakaRa公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank (CP002614.1)公布的rmlD序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增同源重組序列(即同源臂)的引物，并由華大基因合成。

1.4 同源重組質(zhì)粒pQK246的構(gòu)建

以鼠傷寒沙門氏菌野生株S100基因組為模板，分別用引物DrmlD-UF/ DrmlD-UR和DrmlD-DF/ DrmlD-DR擴(kuò)增rmlD上游(458 bp)和下游(451 bp)同源臂。用DrmlD-UF/ DrmlD-DR引物進(jìn)行overlap-PCR，將上、下游同源臂融合。將同源臂融合產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pYA4278，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)χ7232中，得到陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，測(cè)序。將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pQK246。

1.5 S100ΔrmlD缺失株的構(gòu)建及鑒定

將重組自殺質(zhì)粒pQK246轉(zhuǎn)化入χ7213(缺失asd，需DAP才能成長(zhǎng))菌株。分別挑取含pQK246的χ7213菌株和親本S100菌株單克隆接種到新鮮液體LB中培養(yǎng)至D600 nm為0.8左右，按一定比例取菌液加到LB (DAP+)平板混勻后傾斜于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)行質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。將接合轉(zhuǎn)移得到的菌苔接種于LB (Cm+)平板進(jìn)行抗性篩選。挑取具有氯霉素抗性的單克隆接種到新鮮的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃，180 r/min) 3 h后，取100 μL菌液按一定比例稀釋后涂布于LB (5%蔗糖)平板，置于28 ℃溫箱培養(yǎng)。將在平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行LB (Cm+)、LB (5%蔗糖)同時(shí)劃板篩選。PCR鑒定對(duì)氯霉素敏感而對(duì)蔗糖抗性的單菌落，擴(kuò)增得到同源臂融合片段大小的條帶(899 bp)即表明缺失株構(gòu)建成功。缺失株命名為S501。

1.6 回補(bǔ)株S501(pQK247)的構(gòu)建

以野生株S100基因組為模板，用引物rmlD-F/rmlD-R通過(guò)PCR擴(kuò)增出rmlD，將rmlD片段與質(zhì)粒pYA4518進(jìn)行連接，通過(guò)氯霉素抗性篩選得到陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒后測(cè)序，將測(cè)序正確的回補(bǔ)質(zhì)粒命名為pQK247。最后將質(zhì)粒pQK247轉(zhuǎn)化到突變株S501中，得到回補(bǔ)株S501(pQK247)。

1.7 S100ΔrmlD缺失株LPS表型鑒定

銀染方式:參考文獻(xiàn)[24]的處理方法，將樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。然后，將膠通過(guò)固定、氧化、銀染、顯影等步驟后，終止顯影，凝膠成像系統(tǒng)照相。Western blot：按上述步驟處理好的樣品經(jīng)SDS-PAGE后，用半干轉(zhuǎn)印法將凝膠上的LPS分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，經(jīng)5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉，以沙門氏菌兔源一抗O4血清(寧波天潤(rùn)藥業(yè)有限公司)為一抗，山羊抗兔BIOT-IgG (SouthernBiotech)為二抗，通過(guò)堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色進(jìn)行Western blot鑒定。

1.8 S100ΔrmlD缺失株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將S100和S100ΔrmlD菌株分別挑單菌落接種到含3 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基的試管中過(guò)夜培養(yǎng)，次日取1 mL菌液，分別轉(zhuǎn)接到含150 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)，每隔1 h取菌液測(cè)定D600 nm值，紀(jì)錄并整理數(shù)據(jù)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.9 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

取37℃過(guò)夜培養(yǎng)的S100和S100ΔrmlD菌株菌液，次日轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到其D600 nm至0.8左右，分別取3 μL菌液滴于含0.3% 瓊脂的新鮮半固體LB平板中央，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，5 h后測(cè)量細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑并記錄數(shù)據(jù)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.10 抗菌肽、膽酸鹽敏感性檢測(cè)

取37℃過(guò)夜培養(yǎng)的S100和S100ΔrmlD菌株菌液，次日按1：100的比例加入3 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到其D600 nm值為0.8，取100 μL菌液稀釋100倍后，取100 μL菌懸液于新的EP管中，加入多黏菌素B (終濃度0.5 μg/mL)或脫氧膽酸鹽(終濃度10 mg/mL)于37℃條件下孵育1 h,然后將菌液進(jìn)行適當(dāng)倍比稀釋，取稀釋后的菌液100 μL涂布于LB平板上，置于37℃溫箱培養(yǎng)18 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 黏附與入侵實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的INT407細(xì)胞進(jìn)行消化和細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×105個(gè)細(xì)胞/孔的數(shù)量將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)16 h后，按感染指數(shù)(MOI) 20的比例向細(xì)胞孔中加入新鮮培養(yǎng)的野生株S100和缺失株S100ΔrmlD，繼續(xù)培養(yǎng)，1 h后用無(wú)菌PBS清洗3次，加入100 μL 1% Triton X-100裂解細(xì)胞10 min，釋放細(xì)菌。用無(wú)菌PBS稀釋細(xì)胞裂解液，選擇100倍和1000倍稀釋梯度涂布于LB平板上，置于37℃恒溫箱(5% CO2)培養(yǎng)18 h后對(duì)菌落計(jì)數(shù)。侵襲檢測(cè)試驗(yàn)，在細(xì)菌與細(xì)胞孵育1 h，用無(wú)菌PBS清洗3次以后，每孔加入含100 μg/mL慶大霉素的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基1 mL，置于37℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，余下操作與黏附試驗(yàn)相同。

1.12 半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定

取37℃過(guò)夜培養(yǎng)的S100和S100ΔrmlD菌株菌液，次日將其按1：100的比例重新接種于含100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.9左右,將全部菌液離心(4000 r/min,10 min)，倒掉上清，用500 μL BSG懸浮細(xì)菌沉淀，然后進(jìn)行倍比稀釋至相應(yīng)劑量要求。將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，進(jìn)行口服攻毒，每只小鼠口服劑量為20 μL，同時(shí)將細(xì)菌適度稀釋后涂布LB平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。連續(xù)觀察一個(gè)月，并紀(jì)錄小鼠癥狀和死亡情況。采用Bliss方法計(jì)算野生株和缺失株對(duì)雌性BALB/c小鼠的LD50。

2 結(jié)果

2.1 鼠傷寒沙門氏菌rmlD缺失株的PCR鑒定

用引物DrmlD-UF/ DrmlD-DR對(duì)篩選出的疑似突變株進(jìn)行PCR鑒定。如圖1所示，缺失株可擴(kuò)增出大小約900 bp的片段(理論大小899 bp)，而野生株則擴(kuò)增出大小約1700 bp的片段(理論大小1799 bp)，表明rmlD缺失株構(gòu)建成功。

圖1 rmlD缺失株的PCR鑒定

M：DL4500 Marker; 1: S100 (ΔrmlD); 2: The wild-type strain S100

2.2 回補(bǔ)株S501(pQK247)的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到大小約900 bp的片段(理論大小900 bp)，表明回補(bǔ)株S501(pQK247)構(gòu)建成功，如圖2。

圖2 PCR鑒定S501 (pQK247)

M：DL4500 Marker; 1: S501 (pQK247)

2.3rmlD缺失株及回補(bǔ)株的LPS表型鑒定

通過(guò)銀染(圖3 A)和Western blot (圖3 B)的方法對(duì)rmlD缺失株S501 LPS合成情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，rmlD缺失導(dǎo)致細(xì)菌O抗原合成失敗，LPS不完整。而經(jīng)過(guò)回補(bǔ)質(zhì)粒pQK247對(duì)rmlD突變株進(jìn)行回補(bǔ)后，LPS表達(dá)量恢復(fù)到與野生株S100相當(dāng)?shù)乃健＝Y(jié)果表明，rmlD突變株的構(gòu)建并未影響到細(xì)菌基因組上、下游基因的表達(dá)。

圖3 野生株S100、缺失株S501和回補(bǔ)株S501(pQK247)的 LPS表型

A：Silver staining; B：Western blot

2.4 生長(zhǎng)曲線及運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

生長(zhǎng)曲線檢測(cè)結(jié)果顯示，rmlD缺失株與野生株S100的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，沒有顯著差異(圖4)。運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)結(jié)果顯示，rmlD突變株較野生株基本失去了運(yùn)動(dòng)能力,缺失的運(yùn)動(dòng)直徑極顯著小于野生株(表2)。表明rmlD的缺失并不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，但嚴(yán)重降低了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。

2.5rmlD缺失株對(duì)膽鹽、多黏菌素B的敏感性的檢測(cè)

分別用工作濃度為0.5 μg/mL的多黏菌素B和10 mg/mL的膽酸鹽檢測(cè)缺失株S100 ΔrmlD對(duì)這兩種活性物質(zhì)的敏感性。結(jié)果顯示，缺失株S100 ΔrmlD和親本株S100的存活率相似(圖5)，這表明rmlD缺失并未改變沙門氏菌對(duì)多黏菌素B和膽酸鹽的抵抗力。

圖4 野生株S100和缺失株S501(S100ΔrmlD)的生長(zhǎng)曲線

表2 野生株S100與 rmlD缺失株S501的運(yùn)動(dòng)性及LD50檢測(cè)

圖5rmlD突變株對(duì)多粘菌素B和膽酸鹽敏感性

Fig 5 Polymyxin B and DOC sensitivity assay of wild type strain S100 andrmlDdeleted strain.

2.6rmlD缺失株的黏附與入侵

黏附試驗(yàn)的結(jié)果顯示，野生株S100的平均黏附率為1.23%，rmlD缺失株為3.5%，與野生株相比,缺失株S100 ΔrmlD黏附能力顯著升高(P<0.001，圖6)；入侵試驗(yàn)的結(jié)果顯示，野生株的入侵率為0.72%，而突變株的入侵率為1.99%，亦呈現(xiàn)顯著升高(P<0.01，圖6)。以上結(jié)果表明，rmlD缺失增加了沙門氏菌黏附、入侵INT407細(xì)胞的能力。

2.7 野生株S100及突變株S100 ΔrmlD對(duì)BALB/c小鼠的LD50測(cè)定

按推算的劑量口服攻毒小鼠，連續(xù)觀察一個(gè)月。經(jīng)Bliss法計(jì)算得到缺失株S100 ΔrmlD對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為9×108CFU，S100對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為4×105CFU(表2)，rmlD突變株的半數(shù)致死量較親本株降低了約2000倍，表明缺失株的毒力明顯降低。

圖6 rmlD缺失株黏附、入侵能力的檢測(cè)

3 討論

L-鼠李糖是沙門氏菌組成O抗原單位必需的單糖之一，而rmlD是合成鼠李糖通路中的一個(gè)必需基因[25,27]。鼠傷寒沙門氏菌S100rmlD缺失后，結(jié)果證明，rmlD的缺失確實(shí)導(dǎo)致細(xì)菌O抗原合成的失敗，LPS不完整。我們對(duì)rmlD突變株相關(guān)生物特性和毒力進(jìn)行研究。rmlD缺失株和野生株的生長(zhǎng)曲線研究結(jié)果表明，缺失株與野生株的生長(zhǎng)趨勢(shì)相當(dāng)，rmlD的缺失并不會(huì)影響野生株S100的生長(zhǎng)特性，推測(cè)rmlD的缺失并不影響細(xì)菌的代謝和能量供應(yīng)。對(duì)突變株運(yùn)動(dòng)性的研究表明，rmlD的缺失嚴(yán)重影響了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，缺失株基本喪失了其運(yùn)動(dòng)能力，可能LPS成分的不完整(O抗原的缺失)導(dǎo)致細(xì)菌鞭毛的合成發(fā)生障礙[28]。通過(guò)對(duì)rmlD突變株多黏菌素B和DOC的敏感性檢測(cè)，結(jié)果顯示，rmlD缺失株與野生株對(duì)多粘菌素B和DOC的敏感性相似，表明rmlD的缺失并未影響細(xì)菌對(duì)這兩種活性物質(zhì)的敏感性。

為了檢測(cè)rmlD的缺失對(duì)細(xì)菌黏附和入侵的影響，我們?cè)u(píng)估了突變株和野生株對(duì)人腸黏附細(xì)胞INT407的黏附和入侵能力。結(jié)果證實(shí)，與野生株S100相比，rmlD缺失株的黏附、入侵能力顯著提高，差異極顯著(P<0.01)。表明截?cái)郞抗原后促進(jìn)了鼠傷寒沙門氏菌黏附、入侵腸上皮細(xì)胞。West等[29]研究報(bào)道，在志賀桿菌中截?cái)嗟腖PS通過(guò)糖基化增強(qiáng)細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)功能，進(jìn)而促進(jìn)其進(jìn)入腸上皮細(xì)胞。

本研究中，rmlD的缺失導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌S100菌株黏附、入侵人腸上皮細(xì)胞INT407的能力增強(qiáng)，但毒力卻降低，可能由于細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞黏附、入侵能力并非與細(xì)菌的毒力一定是正相關(guān)，雖然黏附、入侵是病原菌感染機(jī)體的先決因素，但病原菌對(duì)機(jī)體的致病性是復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的黏附、入侵只是其中眾多因素之一。具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究以鼠傷寒沙門氏菌S100為背景株，構(gòu)建了rmlD缺失株，該菌株生長(zhǎng)速度并未受到影響，對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附、入侵能力增強(qiáng)，毒力顯著降低，rmlD突變可以考慮作為一條有效的減毒途徑，為研制安全有效的沙門氏菌疫苗或載體奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and biological characterization of armlDmutant ofSalmonellatyphimurium

HUANG Chun,LUO Ya-li,LI Pei,LIU Qing

(College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

To study the influence ofrmlDdeletion on phenotype and virulence ofSalmonellatyphimurium,S.typhimuriumΔrmlDmutant of S100 ΔrmlDwas constructed by suicide plasmid-mediated homologous recombination.The biological characteristics of the ΔrmlDmutant showed that no difference was observed for the growth curve,sensitivity to polymyxin B and DOC ofrmlDstrain and the wild-type strain S100.However,the ability of adhesion and invasion was significantly increased compared to that of the wild-type strain.In addition,thermlDmutant strain showed approximately 2000-fold decrease in virulence.In conclusion,deletion ofrmlDgene had no effect on the growth and the sensitivity to polymyxin B or DOC,but significantly decreased the virulence.These data indicated thatrmlDgene deletion could be an efficient way to reduce the virulence ofSalmonellatyphimuriumfor vaccine development.

S.typhimurium;rmlDgene; deletion mutant; virulence

2016-03-10；

2016-03-23

收稿日期：國(guó)家自然科學(xué)基金( No.31472179); 國(guó)家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31200697)

黃春，碩士研究生，主要從事微生物免疫學(xué)研究，E-mail: huangchuncn@163.com

劉青，副教授，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)和疫苗學(xué)，E-mail: Qing.liu.2@sicau.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.033

S852.61

A

2095-1736(2016)06-0033-05