朱萬龍,蔡金紅,陳金龍,王政昆

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500; 2.昆明市海口林場，昆明 650000)

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倭蜂猴細(xì)胞色素b基因和D-loop序列多態(tài)性分析

朱萬龍1,蔡金紅1,陳金龍2,王政昆1

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500; 2.昆明市?？诹謭?，昆明 650000)

對云南大圍山保護(hù)區(qū)7例倭蜂猴線粒體DNA細(xì)胞色素b基因(Cytb)和控制區(qū)序列(D-loop)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、序列測定、核苷酸組成和多態(tài)性分析。結(jié)果表明：Cytb中，A、T、C和G 4種核苷酸的比例分別為 29.3%、28.2%、29.8%和12.7%，A+T含量為57.5%，G+C含量為42.5%。在長度為1078 bp的Cytb序列中，存在4個(gè)變異位點(diǎn)，核苷酸多樣性指數(shù)(π值)為0.00106，僅出現(xiàn)3種單倍型。7個(gè)倭蜂猴個(gè)體的遺傳距離為0.000～0.003。D-loop區(qū)序列中，A、T、C和G 4種核苷酸的比例分別為31.8%、29.1%、25.0%和14.1%，A+T含量為60.9%，G+C含量為39.1%。在381 bp長的D-loop區(qū)序列中，僅存在4個(gè)變異位點(diǎn)，核苷酸多樣性指數(shù)(π值)為0.003 00，僅出現(xiàn)4種單倍型。7個(gè)倭蜂猴個(gè)體的遺傳距離為0.000～0.008。研究表明倭蜂猴種內(nèi)個(gè)體間差異小，群體多態(tài)程度低。通過與其他物種相比，進(jìn)行遺傳多樣性分析，倭蜂猴遺傳多態(tài)性低，種群小，發(fā)生遺傳漂變強(qiáng)度大，因此，倭蜂猴在遺傳多樣性水平上是迫切需要保護(hù)的。

倭蜂猴；細(xì)胞色素b基因；D-loop控制區(qū)序列

線粒體DNA ( mitochondria DNA,mtDNA)是一類核外的遺傳物質(zhì)，可獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，相比與核DNA，它具有以下特點(diǎn)：母系遺傳、分子結(jié)構(gòu)相對簡單、進(jìn)化速度較快、堿基變異較大等等[1-2]。其通常用于動物遺傳變異的研究，在哺乳動物中已有許多報(bào)道[3-5]。mtDNA中的細(xì)胞色素b基因(cytochrome b gene,Cytb)是一種常用于研究物種內(nèi)或近緣種遺傳變異的分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于動物系統(tǒng)進(jìn)化和分類研究[6-7]。D-loop是mtDNA中一段重要的非編碼區(qū)，約占線粒體基因組的6%，由于D-loop是非編碼基因，因此其DNA序列具有進(jìn)化速度快、堿基序列和長度變異大等特點(diǎn)，適合做種內(nèi)群體遺傳變異的研究，并已得到廣泛應(yīng)用[3-5]。

倭蜂猴(Nycticebuspygmaeus)，屬原猴亞目(Strepsirrhine)，懶猴科(Lorisidae)，為亞洲熱帶特有種，主要分布于老撾和越南中北部，我國僅分布于云南東南部[8-9]，屬國家一級保護(hù)動物，急需對其進(jìn)行研究和保護(hù)。倭蜂猴因其數(shù)量稀少，再加上夜行、樹棲、隱蔽等特點(diǎn)，可以用于研究的標(biāo)本數(shù)極少，長期以來對該物種的研究很少，是目前所有原始猴中研究最少的物種之一[10]。本研究組之前對于倭蜂猴的研究集中在其產(chǎn)熱機(jī)理上，如對其體溫調(diào)節(jié)和產(chǎn)熱特征進(jìn)行了研究[11]，蒸發(fā)失水的研究[12]，細(xì)胞呼吸特征的研究[13]，能量收支的研究[14]。2014年對蜂猴屬D-loop控制區(qū)和Cytb的遺傳學(xué)進(jìn)行研究，指出蜂猴屬由蜂猴和倭蜂猴兩物種組成[15]。本研究在之前的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定了7只倭蜂猴線粒體DNA中Cytb和D-loop控制區(qū)部分序列，分析其遺傳多樣性，為倭蜂猴資源的保護(hù)和合理利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源

實(shí)驗(yàn)所采用倭蜂猴是云南大圍山國家級自然保護(hù)區(qū)屏邊管理分局通過合法手段沒收并飼養(yǎng)，并對其糞便樣品進(jìn)行采集，樣本數(shù)為7只，樣品用95%酒精保存帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-70℃冰箱內(nèi)。

1.2 總DNA提取

[15]進(jìn)行了總DNA的提取。

1.3 引物設(shè)計(jì)

Cytb和D-loop控制區(qū)的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.4 PCR擴(kuò)增

利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn) [15]。 擴(kuò)增產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR的純化測序和序列分析

PCR 產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序(測序使用試劑：ABI BigDye3.1；測序儀器：ABI 3730XL)。Cytb和D-loop的測定結(jié)果使用DNASTAR軟件包的Editseq、Seqman、Megalign軟件進(jìn)行排序分析，將正反兩向序列進(jìn)行核對，并進(jìn)行人工的檢查校正。用DNASP 4.0計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)以及統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目。用MEGA5.0進(jìn)行初始的序列比較，堿基組成分析和變異計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 倭蜂猴CytbPCR產(chǎn)物的凝膠電泳

采用Cytb引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Cytb的擴(kuò)增片段為1078 bp左右，圖1顯示其中4個(gè)個(gè)體的CytbPCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶。

圖1 Cyt b片段的擴(kuò)增結(jié)果(0.8%瓊脂糖凝膠電泳)

M：Marker DL 2000

2.2Cytb的核苷酸組成及序列多態(tài)性分析Cytb中，A、T、C和G 4種核苷酸的比例分別為 29.3%、28.2%、29.8%和12.7%，A+T含量為57.5%,G+C含量為42.5%。4種核苷酸在密碼子中的使用頻率如表1所示。在密碼子第1位，4種核苷酸的使用頻率相差不大。但是，在密碼子第2位和第3位上有較大差別。密碼子第2位，T的使用頻率為40.0%，是A的1.9倍，更是G的3.1倍。而密碼子第3位卻表現(xiàn)了對A或C的偏好，使用頻率分別達(dá)到40.1%和36.3%(表1)。

表1 Cyt b序列4種核苷酸的使用頻率

在長度為1078 bp 的Cytb序列中，7個(gè)樣本存在4個(gè)變異位點(diǎn)和3種單倍型。這4個(gè)變異位點(diǎn)分別為第262位、468位、723位、784位，前面3個(gè)位點(diǎn)為G-C轉(zhuǎn)換，最后一個(gè)為A-T轉(zhuǎn)換(圖2)。所有樣本的平均核苷酸差異(K)為1.143，核苷酸多樣性指數(shù)(π值)為0.00106，單倍型多樣性指數(shù)(Hd)為0.524。

基于Kimura雙參數(shù)模型對本實(shí)驗(yàn)所測倭蜂猴，統(tǒng)計(jì)兩兩序列間的遺傳距離(表2)。從表2中可以看出，7個(gè)倭蜂猴個(gè)體的遺傳距離為0.000～0.003。

2.3 倭蜂猴D-loop控制區(qū)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳

采用D-loop控制區(qū)基因片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，D-loop控制區(qū)的擴(kuò)增片段為400 bp左右，圖3顯示了其中4個(gè)個(gè)體的D-loop控制區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶。

圖2 Cyt b序列的核苷酸組成

WFHCytb1WFHCytb2WFHCytb3WFHCytb4WFHCytb5WFHCytb6WFHCytb20.000WFHCytb30.0030.003WFHCytb40.0000.0000.003WFHCytb50.0000.0000.0030.000WFHCytb60.0000.0000.0030.0000.000WFHCytb70.0010.0010.0040.0010.0010.001

圖3D-loop控制區(qū)基因片段的擴(kuò)增結(jié)果(0.8%的瓊脂糖凝膠電泳)

Fig 3 A gene segment amplified fromD-loopcontrol region(0.8% agarose gel)

M：Marker DL 2000

圖4 D-loop區(qū)序列的核苷酸組成

2.4D-loop區(qū)序列的核苷酸組成及多態(tài)性分析

D-loop區(qū)序列中，A、T、C和G 4種核苷酸的比例分別為31.8%、29.1%、25.0%和14.1%,A+T含量為60.9%，G+C含量為39.1%。在長度為381bp的D-loop區(qū)序列中，7個(gè)樣本存在4個(gè)變異位點(diǎn)和4種單倍型。這4個(gè)變異位點(diǎn)分別為第185位、209位、251位、340位，185位點(diǎn)為G-C轉(zhuǎn)換，209和251位點(diǎn)都為A-T轉(zhuǎn)換，最后一個(gè)為G-T顛換(圖4)。所有樣本的平均核苷酸差異(K)為1.143，核苷酸多樣性指數(shù)(π值)為0.003 00，單倍型多樣性指數(shù)(Hd)為0.714。

采用Mega4.0軟件，基于Kimura雙參數(shù)模型對本實(shí)驗(yàn)所測倭蜂猴，統(tǒng)計(jì)兩兩序列間的遺傳距離(表3)。從表中可以看出，本研究測定的7個(gè)倭蜂猴個(gè)體的遺傳距離為0.000～0.008。

表 3 D-loop區(qū)序列的Kimura雙參數(shù)模型的遺傳距離

3 討論

本研究所得的倭蜂猴Cytb和D-loop區(qū)序列中，A、T、C和G 4種核苷酸的比例分布不均，這可能與4種核苷酸在線粒體基因組中分布不均是動物線粒體基因組的共性有關(guān)[16]。倭蜂猴Cytb和D-loop區(qū)序列中的A+T含量比G+C含量高，這與其他脊椎動物線粒體核苷酸組成的特點(diǎn)相似[17-18]。Cytb中存在4個(gè)變異位點(diǎn)和3種單倍型。這4個(gè)變異位點(diǎn)分別為第262位、468位、723位、784位，前面3個(gè)位點(diǎn)為G-C轉(zhuǎn)換，最后一個(gè)為A-T轉(zhuǎn)換。D-loop區(qū)序列中僅發(fā)生一個(gè)顛換(transversion)，轉(zhuǎn)換與顛換的比值為0。哺乳動物的mtDNA堿基替換中存在轉(zhuǎn)換偏倚性(Bias)，隨著進(jìn)化時(shí)間增加，顛換的積累，轉(zhuǎn)換偏倚性會下降[19]，因此，本研究中Cytb和D-loop區(qū)序列的突變?nèi)晕催_(dá)到飽和狀態(tài)[20]。

遺傳變異是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一[21]。瀕危動物多是典型的小種群，易發(fā)生遺傳漂變，易發(fā)生多樣性丟失，從而降低對環(huán)境變化的進(jìn)化適應(yīng)能力，使得種群滅絕的概率增大，因此瀕危動物保護(hù)的關(guān)鍵是保護(hù)物種的遺傳多樣性或進(jìn)化潛力。衡量一個(gè)種群的分子遺傳變異的重要指標(biāo)是核苷酸多態(tài)性(π值)，由于π值考慮了各種單倍型在群體中所占的比例，π值越大表示群體多態(tài)性越高[22]。7個(gè)樣本的Cytb中，K為1.143，π值為0.001 06，D-loop控制區(qū)部分序列作遺傳變異分析表明，K為1.143，π值為0.003 00，遠(yuǎn)低于其他哺乳動物。如Neigel統(tǒng)計(jì)同種哺乳動物個(gè)體之間的平均核苷酸順序歧異值在0.3%到4%之間，最大時(shí)竟達(dá)10%以上[21]。滇金絲猴的線粒體DNA多樣性為1.144%[23]，野豬種群的線粒體DNA多樣性為0.865%，K為9.859 36，藏羚羊線粒體DNA多樣性為2.963%[24]等。

綜上所述，本研究表明倭蜂猴種內(nèi)個(gè)體間差異小，群體多態(tài)程度低。通過與其他物種相比，倭蜂猴遺傳多態(tài)性低，種群小，發(fā)生遺傳漂變強(qiáng)度大，因此，倭蜂猴在遺傳多樣性水平上是迫切需要保護(hù)的。

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Analysis of gene sequence polymorphism in the sequences ofCytbandD-loopinNycticebuspygmaeus

ZHU Wan-long1,CAI Jin-hong1,CHENG Jin-long2,WANG Zheng-kun1

(1.Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation on Animals-Plants in Southwest Mountain Ecosystem of Yunnan Province Higher Institutes College,School of Life Sciences,Yunnan Normal University,Kunming 650500; 2.Kunming Haikou Forest Farm,Kunming 650000,China)

CytbandD-loopof mitochondrial DNA inNycticebuspygmaeus(sample=7) in Daweishan Nature Reserve from Yunnan province were PCR amplification in the present study,and the sequences ofCytbandD-loopwere tested,nucleotide compositions and polymorphism were analyzed.The results showed that in the gene ofCytb,the proportion of four nucleotides(A,T,C and G) were 29.3%,28.2%,29.8% and 12.7%,respectively.Content of A+T was 57.5%,and content of G+C was 42.5%.InCytbgene sequences (1078 bp in length ),there were 4 variable sites,π value was 0.00106,only 3 haplotypes appeared in 7 samples.Genetic distance was 0.000-0.003 inN.pygmaeus.In the gene ofD-loop,the proportions of four nucleotides(A,T,C and G) were 31.8%,29.1%,25.0% and 14.1%,respectively.Content of A+T was 60.9%,and content of G+C was 39.1%.InD-loopgene sequences (381 bp in length),there were 4 variable sites,π value was 0.00300,only 4 haplotypes appeared.Genetic distance was 0.000-0.003 inN.pygmaeus.All of the results suggested that litter differences existed between individuals within species,and had low levels of polymorphism in groups.Compared with other species,through the analysis of genetic diversity,N.pygmaeusshowed lower hereditary and population numbers,genetic drift occured larger.Therefore,it was eager to protect theN.pygmaeuson the level of genetic diversity.

Nycticebuspygmaeus;Cytb;D-loop

2015-11-03；

2015-11-16

收稿日期：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31260097；31560126)

朱萬龍，副教授，研究方向?yàn)閯游锷砩鷳B(tài)，E-mail: zwl_8307@163.com；朱萬龍和蔡金紅為并列第一作者

王政昆，教授，研究方向?yàn)閯游锷砩鷳B(tài)，E-mail: wzk_930@126.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.020

Q953.3；Q78

A

2095-1736(2016)06-0020-04