游雪嬌, 趙智穎, 馬連營(yíng), 彭斐元, 李良秋

廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070

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阪崎克羅諾桿菌生物膜結(jié)構(gòu)的定量分析

游雪嬌, 趙智穎, 馬連營(yíng), 彭斐元, 李良秋*

廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070

為了建立阪崎克羅諾桿菌的孔板置片成膜模型，將不同培養(yǎng)時(shí)間(6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h)的生物膜經(jīng)熒光染料標(biāo)記后，運(yùn)用激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)聯(lián)合COMSTAT定量分析生物膜形成過(guò)程的結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)用結(jié)晶紫(crystal violet, CV)染色法分析生物量。結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，A570先升后降，在60 h有最大值；總生物量、平均厚度及平均擴(kuò)散距離也先升后降，在60 h有最高值，活死比例、粗糙系數(shù)及表面積與生物量比值先降后升，最低值分別在60 h、48 h與60 h；胞外多糖先增后減。阪崎克羅諾桿菌生物膜形成包括：粘附階段(0～12 h)、發(fā)展階段(12～48 h)、成熟階段(48～60 h)及解聚再定植階段(>60 h)。CLSM-COMSTAT法在定性觀察生物膜結(jié)構(gòu)的同時(shí)，還可定量分析結(jié)構(gòu)參數(shù)，且該法得到的總生物量變化趨勢(shì)與CV染色法一致，說(shuō)明CLSM-COMSTAT法可作為分析阪崎克羅諾桿菌生物膜的常規(guī)方法。

阪崎克羅諾桿菌；生物膜；激光共聚焦掃描顯微鏡；COMSTAT；定量分析

生物膜(biofilm)是微生物菌體黏附在物體表面，分泌多糖、蛋白及核酸等胞外聚合物將菌體包裹于其中而形成的三維立體結(jié)構(gòu)的膜狀復(fù)合物。自然環(huán)境中，90%以上微生物以生物膜的形式存在。生物膜與微生物的致病性、耐藥性等密切相關(guān)。阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)是一種兼性厭氧的食源性條件致病菌，在水、土壤、天然及加工食品中均可檢測(cè)到[1,2]。其可引起新生兒腦膜炎、敗血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，有較高的死亡率。阪崎克羅諾桿菌能在食品及其處理加工相關(guān)環(huán)境中形成生物膜，以抵抗干燥、抗生素及消毒劑等不利條件，給食品安全帶來(lái)極大威脅[2～4]。

目前，已報(bào)道的阪崎克羅諾桿菌生物膜的相關(guān)研究中，對(duì)生物膜的考察集中在有無(wú)的鑒定以及生物量的多少，而生物膜內(nèi)部組分及立體結(jié)構(gòu)的研究極少，結(jié)構(gòu)定量分析數(shù)據(jù)更是缺乏。另外，生物膜形成規(guī)律研究是探討生物膜致病性及防治技術(shù)研究的重要基礎(chǔ)，而有關(guān)阪崎克羅諾桿菌生物膜形成過(guò)程中結(jié)構(gòu)變化的研究也未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了適用于阪崎克羅諾桿菌生物膜定量分析的CLSM-COMSTAT聯(lián)用分析技術(shù)，運(yùn)用該方法首次研究了該生物膜生長(zhǎng)過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化，有效評(píng)價(jià)了該生物膜的發(fā)生、發(fā)展、成熟及崩解，旨在為阪崎克羅諾桿菌生物膜形成機(jī)理與防治技術(shù)研究提供可靠的方法保障。

1 材料與方法

1.1 菌種

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)ATCC29544購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，活化后采用胰蛋白胨大豆瓊脂(typeone soy agar, TSA, OXOID)斜面培養(yǎng)基保藏，每月轉(zhuǎn)接1次，并保存于4℃冰箱中。挑取1個(gè)單菌落接種于含有50 mL胰蛋白胨大豆(typeone soy broth, TSB, OXOID)的150 mL三角瓶中，于37℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中活化10 h后，得種子培養(yǎng)液。

1.2 生物膜培養(yǎng)

接種0.1 mL種子液菌液于預(yù)先放置無(wú)菌蓋玻片(直徑為18 mm，Thermo Fisher)的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入0.9 mL的TSB，于37℃靜置培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，期間每24 h更換1次培養(yǎng)液。每個(gè)時(shí)間段均設(shè)對(duì)照蓋玻片，對(duì)照蓋玻片所在孔中加1.0 mL的TSB，每個(gè)時(shí)間段重復(fù)12孔。

1.3 結(jié)晶紫(crystal violet, CV)染色

具體實(shí)驗(yàn)步驟參照Lee等[2]的方法。玻片經(jīng)滅菌水清洗3次后，移至新的孔板中，加入0.5 mL 1%結(jié)晶紫染色30 min，再用滅菌水清洗3次；自然干燥1 h后加入0.5 mL乙醇洗脫15 min；最后，吸取0.2 mL洗脫液到96孔板，用酶標(biāo)儀(Multiskan GO,THERMO)測(cè)定570 nm的吸光值(A570)。各個(gè)時(shí)間段以相應(yīng)對(duì)照蓋玻片的洗脫液吸光值為空白。

1.4 激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)掃描

生物膜中的菌體選用核酸熒光探針LIVE/DEAD?BacLightTMBacterial Viability Kits(Molecular Probes)，其中的SYTO 9標(biāo)記活菌，顯示為綠色，PI標(biāo)記死菌，顯示為紅色。操作步驟：玻片經(jīng)0.85% NaCl溶液清洗3次，移至新的孔板中，添加0.5 mL稀釋的LIVE/DEAD?BacLightTMBacterial Viability Kits，其中SYTO 9與PI的濃度分別為5 μmol/L、30 μmol/L，室溫下避光染色15 min，無(wú)菌水清洗3次。處理好的玻片置于激光共聚焦掃描顯微鏡(LSM700,Zeiss)下用40倍油鏡進(jìn)行掃描，每個(gè)玻片選取5個(gè)視野，獲得的圖片堆用ZEN2010進(jìn)行三維重建，并用COMSTAT軟件對(duì)生物膜的總生物量(total biomass)、平均厚度(average thickness)、粗糙系數(shù)(roughness coefficient)、平均擴(kuò)散距離(average diffusion distance)及表面積與生物量比值(surface to volume ratio)進(jìn)行定量分析，總生物量代表單位面積微生物數(shù)量；活死比例為生物膜中活死菌體生物量的比值，反映生物膜的活性；平均厚度表示生物膜的空間維度；粗糙系數(shù)衡量生物膜厚度變化的程度、反映生物膜的異質(zhì)性;平均擴(kuò)散距離代表生物膜中營(yíng)養(yǎng)源和微生物之間的擴(kuò)散距離;表面積與生物量比值表示接觸營(yíng)養(yǎng)源的生物膜大小，反映生物膜適應(yīng)環(huán)境的能力[5]?；钏辣壤怯肅OMSTAT軟件分別計(jì)算得到的活菌總生物量與死菌總生物量的比值。生物膜的胞外多糖選用tetramethylrhodamine conjugates of concanavalin A(TRTIC-ConA, molecular probes)染色。具體步驟：玻片經(jīng)0.85%NaCl溶液清洗3次，添加0.5 mL 100 μg/mL TRTIC-ConA，室溫下避光染色30 min，無(wú)菌水清洗3次，處理好的玻片置于激光共聚焦掃描顯微鏡用40倍油鏡進(jìn)行掃描。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)晶紫染色法

在培養(yǎng)時(shí)間小于36 h時(shí)，A570隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢上升，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48 h時(shí)，A570值增加至0.10±0.02，約為36 h時(shí)的5.5倍，60 h時(shí)的A570值與48 h時(shí)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至72 h，A570值顯著下降(圖1)。

2.2 激光共聚焦掃描顯微鏡

2.2.1 菌體 不同培養(yǎng)時(shí)間的阪崎克羅諾桿菌

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間生物膜的A570值Fig.1 A570 values of biofilms of different incubation times.注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

生物膜經(jīng)SYTO 9/PI染色、CLSM掃描的結(jié)果見(jiàn)圖2(彩圖見(jiàn)圖版四)。6 h時(shí)，已有少量細(xì)菌粘附在玻片上，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，基質(zhì)上粘附的菌體增多，同時(shí)粘附的菌體分裂形成小菌落，60 h時(shí)粘附的小菌落成為了具三維結(jié)構(gòu)的成熟生物膜，72 h時(shí)部分細(xì)菌又從生物膜上脫落(圖2)。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間生物膜的CLSM圖Fig.2 CLSM images of biofilms at different incubation times.注：每張圖中，左圖和中圖為生物膜經(jīng)熒光染料SYTO9和PI染色的CLSM圖，右圖則是左圖和中圖的疊加圖；上面為俯視圖，標(biāo)尺為100 μm；下面為側(cè)視圖，邊長(zhǎng)為319.77 μm。A：6 h；B：12 h；C：24 h；D：36 h；E：48 h；F：60 h；G：72 h。(彩圖見(jiàn)圖版四)

CLSM圖片經(jīng)COMSTAT軟件定量分析生物膜結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3。定量分析中選用了總生物量、活死比例、平均厚度、平均擴(kuò)散距離、粗糙系數(shù)及表面積與生物量比值等參數(shù)來(lái)表征生物膜形成過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化。如圖3所示：總生物量先隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢升高，48 h時(shí)升為36 h時(shí)的5.5倍，在60 h時(shí)出現(xiàn)最大值(1.31±0.26 μm3/μm2)，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，降至0.14±0.04 μm3/μm2；在前24 h，生物膜中的菌體活死比例隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而下降，24～72 h活死比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，60 h時(shí)下降至1.00±0.49，72 h時(shí)又上升至2.08±0.63；生物膜的平均厚度與平均擴(kuò)散距離也隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先增大后減小，在60 h時(shí)有最大值，分別為1.93±0.53 μm、0.13±0.02 μm；生物膜的粗糙系數(shù)則隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，其中48 h與60 h時(shí)的粗糙系數(shù)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；表面積與生物量比值隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先降后升，在60 h時(shí)達(dá)到最低值。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間生物膜的COMSTAT定量分析結(jié)果Fig.3 COMSTAT analysis of biofilms of different incubation times.注：A：總生物量；B：活死比例；C：平均厚度；D：平均擴(kuò)散距離；E：粗糙系數(shù)；F：表面積與生物量比值。各圖中，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 胞外多糖 細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程一般分為4個(gè)階段[6]：① 黏附階段：菌體利用鞭毛、纖毛和菌絲等胞外細(xì)胞器和外層膜蛋白黏附于載體表面，并進(jìn)一步通過(guò)分泌的多糖、DNA、蛋白等胞外多聚物增強(qiáng)細(xì)胞和載體之間的黏附；②發(fā)展階段：黏附菌體分裂、增殖，胞外多聚物量增多并粘結(jié)菌體形成微菌落，大量微菌落使生物膜結(jié)構(gòu)加厚；③成熟階段：微菌落形成具有不均質(zhì)性的三維結(jié)構(gòu)，微菌落之間分布有可供運(yùn)送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排出廢物的通道；④ 解聚再定殖階段：部分菌體從生物膜上的脫落，可于新的生境中重新吸附于載體表面，形成新的生物膜。在培養(yǎng)時(shí)間為6～12 h時(shí)，胞外多糖量極少；繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，胞外多糖量逐漸增多，并在60 h時(shí)最多，而到72 h時(shí)又減少(圖4，彩圖見(jiàn)圖版四)。再進(jìn)一步結(jié)合圖1、圖2和圖3的結(jié)果，分析可知：阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成過(guò)程中，0～12 h為粘附階段，12～48 h為發(fā)展階段，48～60 h為成熟階段，72 h時(shí)進(jìn)入解聚再定殖階段。

3 討論

生物膜分析方法是生物膜形成機(jī)理與防治技術(shù)研究的基礎(chǔ)。目前，已報(bào)道的阪崎克羅諾桿菌生物膜定量分析方法有：CV染色法[2,7]、平板計(jì)數(shù)法[8,9]。CV染色法簡(jiǎn)便快捷，適用于試管及96孔板法造膜，但所得結(jié)果僅為生物量總量，無(wú)法反映膜內(nèi)細(xì)菌活力等情況。平板計(jì)數(shù)法操作費(fèi)時(shí)、繁瑣，且存在分離不全、菌體受損等問(wèn)題。CLSM在對(duì)生物膜各層面及整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性觀察的同時(shí)，結(jié)合圖像分析軟件還可定量分析結(jié)構(gòu)參數(shù)。本文建立了適用于阪崎克羅諾桿菌生物膜定量分析的CLSM-COMSTAT聯(lián)用分析技術(shù)，運(yùn)用此方法分析得到的總生物量變化趨勢(shì)與傳統(tǒng)CV染色法一致，說(shuō)明CLSM-COMSTAT法可作為分析阪崎克羅諾桿菌生物膜的常規(guī)方法。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間生物膜胞外多糖的CLSM圖Fig.4 CLSM images of biofilms EPS of different incubation times.注：生物膜經(jīng)熒光染料TRITC-ConA染色，標(biāo)尺為50 μm。A：6 h；B：12 h；C：24 h；D：36 h；E：48 h；F：60 h；G：72 h。(彩圖見(jiàn)圖版四)

CV染色法、CLSM定性與定量的結(jié)果均顯示：阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成過(guò)程中，0～12 h為粘附階段，12～48 h為發(fā)展階段，48～60 h為成熟階段，72 h時(shí)進(jìn)入解聚再定植階段。這與Li等[10]的SEM與CLSM觀察結(jié)果類似，但不同于景春娥等[11]的研究結(jié)果：0～5 h為粘附階段，24 h時(shí)生物膜已經(jīng)成熟。這是由于細(xì)菌在疏水性介質(zhì)表面形成生物膜的速度快于親水性介質(zhì)[12,13]，而Li等[10]的研究選用了親水性的玻璃為生長(zhǎng)介質(zhì)，景春娥等[11]則使用的是疏水性的PVC材質(zhì)。

阪崎克羅諾桿菌生物膜形成過(guò)程中，總生物量、平均厚度及平均擴(kuò)散距離隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先升后降，粗糙系數(shù)、表面積與生物量比則先降后升，此變化趨勢(shì)類似于熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[5]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及白色念珠菌(Candidaalbicans)[14,15]。而60 h時(shí)成熟生物膜的厚度顯著低于Hartmann等[16]研究中報(bào)道的40 μm，主要是由于本研究選用靜態(tài)成膜法(孔板置片)，Hartmann等選用動(dòng)態(tài)成膜的流室法(flow cell)，相比于靜態(tài)生物膜模型，動(dòng)態(tài)生物膜模型中流動(dòng)的培養(yǎng)基更有利于生物量的積累[17,18]。阪崎克羅諾桿菌生物膜形成過(guò)程中，活菌總生物量則先升后降，在48 h時(shí)達(dá)到最高值，且36～48 h間的增幅最大。而Hurrell等[19]的研究結(jié)果顯示：阪崎克羅諾桿菌在腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)管(PVC材質(zhì))管壁成膜過(guò)程中，活菌的大量增殖期在24 h之前，這可能是由于2個(gè)研究中選用的生物膜生長(zhǎng)介質(zhì)不同，而細(xì)菌在疏水性介質(zhì)表面形成生物膜的速度快于親水性生長(zhǎng)介質(zhì)。

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Quantitative Analysis ofCronobactersakazakiiBiofilm Structure

YOU Xue-jiao, ZHAO Zhi-ying, MA Lian-ying, PENG Fei-yuan, LI Liang-qiu*

StateKeyLaboratoryofAppliedMicrobiologySouthernChina;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialCultureCollectionandApplication,GuangdongInstituteofMicrobiology,Guangzhou510070,China

To quantify the sequential development ofCronobactersakazakiibiofilm structure in biofilm process, with hyphened technique of the program confocal laser scanning microscopy (CLSM) and COMSTAT,C.sakazakiibiofilm model in vitro was constructed on glass slice in cell culture plate and biofilm development was monitored at different time intervals (6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h and 72 h). Meanwhile, the total biomass of biofilms was analyzed using the crystal violet (CV) staining method. The change ofA570value ascended before 60 h and then descended. With the elongation of culture time, total biomass, average thickness and average diffusion distance increased first and decreased afterwards, and reached the peak at 60 h, whereas live/dead ratio, roughness coefficient and surface to volume ratio rose after the first drop, and the minimum values occurred at 60 h, 48 h and 60 h, respectively. The biofilm extracellular polysaccharide (EPS) increased first and then decreased with the extension of culture time. The formation ofC.sakazakiibiofilm was divided into four steps: adhesion (0～12 h), development (12～48 h), maturation (48～60 h) and dispersal (>60 h). CLSM-COMSTAT method provides not only direct qualitative observation of biofilm spatial structure but also the respective quantitative structural parameters, and furthermore the change of total biomass measured by CLSM-COMSTAT method was in accordance with the CV staining method. CLSM-COMSTAT method can be used as a regular method for quantitative analysis ofC.sakazakiibiofilm structure, which is beneficial to study the formation mechanism and prevention techniques ofC.sakazakiibiofilm.

Cronobactersakazakii; biofilm; confocal laser scanning microscope; COMSTAT; quantitative analysis

2016-08-30; 接受日期：2016-09-27

廣東省科學(xué)院分析測(cè)試基金項(xiàng)目(Sf201502)資助。

游雪嬌，工程師，研究方向?yàn)樯锬z測(cè)分析。 E-mail:youxueer0922@126.com。*通信作者：李良秋，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與發(fā)酵工程。E-mail:liliangqiu1010@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.10