陳巖，趙宇明

（大連市食品檢驗(yàn)所，遼寧大連116630）

紫外可見光譜法測(cè)定食醋中4-甲基咪唑含量

陳巖，趙宇明*

（大連市食品檢驗(yàn)所，遼寧大連116630）

建立紫外可見光譜法測(cè)定食醋4-甲基咪唑的方法。結(jié)果表明，食醋樣品經(jīng)沉淀、離心、萃取、脫色及顯色反應(yīng)后，4-甲基咪唑經(jīng)重氮偶合后在波長440 nm處具有最大吸收，據(jù)此進(jìn)行定量測(cè)定。方法的線性方程為：A=13.721C+ 0.008 9，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7，檢出限為1.2μg，方法的平均回收率為95%～105%，本方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97×10-5～9.37×10-5，變異系數(shù)為0.002～0.008。

食醋；4-甲基咪唑；重氮偶合；紫外可見光譜法

焦糖色素是迄今為止用量最大的天然色素，廣泛應(yīng)用于食醋、醬油、酒類、醬腌菜、糕點(diǎn)、巧克力、糖果、糖漿藥等行業(yè)中，我國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定除特殊要求外，其按生產(chǎn)需要適量使用[1]。4-甲基咪唑（4-methylimidazole）是以氨（銨）法生產(chǎn)焦糖色過程中產(chǎn)生的具有一定毒性的副產(chǎn)物。4-甲基咪唑具有強(qiáng)烈的驚厥作用甚至可以誘發(fā)癲癇病[2]，對(duì)雄性小鼠的致死量為307mg/kg體重，同時(shí)，可以誘發(fā)老鼠患肺癌和白血病。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.64-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑焦糖色》[3]中明確規(guī)定焦糖色（亞硫酸法、氨法、普通法）中4-甲基咪唑的含量不得超過0.02%。

在食醋中普遍使用焦糖色進(jìn)行調(diào)色，特別是在陳醋中，生產(chǎn)企業(yè)使用量更高。不合格焦糖色的使用或合格焦糖色的過量添加，都會(huì)給食醋產(chǎn)品帶來一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。焦糖色中4-甲基咪唑的測(cè)定方法有薄層色譜法[4]、紙層析法[5]、離子色譜法[6]、高效液相色譜法[7-10]、填充柱氣相色譜法[11-12]、毛細(xì)管等速電泳法[13]、分光光度法[14-15]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16]等。目前，利用紫外可見光譜法對(duì)食醋中4-甲基咪唑含量定量分析還鮮見報(bào)道，本文建立了采用紫外可見光譜法測(cè)定食醋中4-甲基咪唑含量的方法，獲得滿意的分析結(jié)果，為規(guī)范食醋生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

三氯甲烷、無水乙醇、鹽酸、硫酸、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、碳酸氫鈉、乙酸鉛等：均為分析純?cè)噭?，購于天津市科密歐試劑有限公司；4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品（98%）：美國Acros Organicss公司；實(shí)驗(yàn)室用水為二次蒸餾水。

UV2550型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；EK-600H型電子天平：廣州東華科學(xué)儀器公司；HM-120型電子天平：廣州東華科學(xué)儀器公司；PHS-3C型酸度計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取4-甲基咪唑0.100 0 g，置于100mL容量瓶中，加入10%碳酸氫鈉溶液10mL，加水定容至刻度，得濃度為1mg/mL的4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放于冰箱中備用。

重氮化試劑：0.5%對(duì)氨基苯磺酸的2%鹽酸溶液與0.5%的亞硝酸鈉溶液等量混合。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取

在聚四氟乙烯離心管中稱取5.00 g樣品，加20 g/L的乙酸鉛溶液5mL，放置10min沉淀蛋白質(zhì)。將離心管在6 000 r/min下離心5min，將清液轉(zhuǎn)移到燒杯中，用3mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至11.0。將溶液過濾到250mL分液漏斗中，用150mL三氯甲烷/乙醇溶液（體積比4∶1）分3次（70、40、40mL）提取溶液，將三氯甲烷層合并到另一潔凈的分液漏斗中。在三氯甲烷層的分液漏斗中加入35mL硫酸溶液（0.05mol/L），分兩次（20、15mL）提取目標(biāo)物，將水層合并到燒杯中，加入2 g活性炭振搖數(shù)次，將濾液過濾到容量瓶中，用水定容。

準(zhǔn)確吸取上述濾液1mL，置于10毫升比色管中，加入重氮化試劑1 mL，加入10%碳酸氫鈉溶液0.5 mL，充分混合均勻，放置1min，加水至10mL，混勻。在室溫下放置10min～15min后，以試劑空白為參比，于波長440 nm處測(cè)定溶液吸光度。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確吸取1 mg/mL的4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（分別相當(dāng)于0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg 4-甲基咪唑），置于10mL比色管中，加水至1.0mL，加重氮化試劑1mL，再加入10%碳酸氫鈉溶液0.5mL，充分混勻，反應(yīng)1min后，加水至刻度，充分搖勻。在室溫下放置10min～15min，于波長440 nm處測(cè)定溶液吸光度。以4-甲基咪唑濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 結(jié)果計(jì)算

樣品中4-甲基咪唑的含量（%）的計(jì)算公式：

式中：X為樣品中4-甲基咪唑的含量，%；c為測(cè)得樣品溶液的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)的含量，mg；m為樣品質(zhì)量，g；V為樣品最終定容的體積數(shù)，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)原理

4-甲基咪唑與重氮化試劑的重氮偶合反應(yīng)是4-甲基咪唑陰離子與親電試劑在堿性水溶液中反應(yīng)，由于負(fù)電荷從1-位離域到3-位，使得反應(yīng)發(fā)生在2-位。偶合后得到橘黃色到棕紅色偶合物，用紫外可見光譜法進(jìn)行比色定量。

2.2 測(cè)定波長的選擇與吸收光譜

按試驗(yàn)方法，在350 nm～650 nm處進(jìn)行波長掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 不同工作波長下4-甲基咪唑的吸光度值（吸收光譜）Fig.1 4-methyl im idazoleunder differentworkingwavelength absorbance value（absorption）

吸光度在410 nm～440 nm內(nèi)逐漸增加，在440 nm達(dá)到最大，之后吸光度逐漸下降，因而選擇440 nm作為工作波長。方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve

2.3 適宜的反應(yīng)條件

2.3.1 介質(zhì)的選擇

不同介質(zhì)所提供的酸堿性環(huán)境對(duì)萃取效果的影響不同，4-甲基咪唑在pH＞7的條件下溶解于有機(jī)試劑，在pH＜7的條件下溶解于水，因而提取時(shí)應(yīng)將樣品溶液的pH值調(diào)控到適宜的范圍才能確保萃取效果最佳。在pH 9.0～13.5區(qū)間范圍內(nèi)考察4-甲基咪唑的回收率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH值對(duì)萃取效果的影響Fig.3 The influenceof different pH valueon theextraction effect

圖3 表明，當(dāng)樣品溶液的pH=11.0時(shí)，4-甲基咪唑的回收率最高，即萃取的效果最好，因此選擇樣品溶液的最佳pH值為11.0，最佳介質(zhì)為NaOH溶液。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間和溫度的選擇

反應(yīng)時(shí)間和溫度的選擇試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 反應(yīng)時(shí)間和溫度的選擇Table1 Choiceof reaction tim eand tem perature

由表1可見，反應(yīng)時(shí)間過短，溶液顯橘黃色，本偶聯(lián)反應(yīng)在室溫條件下10min以上才能充分完成，試驗(yàn)選擇在室溫下放置10min～15min。在環(huán)境溫度明顯低于室溫條件下，改用恒溫水浴調(diào)節(jié)溫度在20℃～25℃之間，保溫10min～15min。

2.3.3 染料的穩(wěn)定性

本染料形成后，在適宜的介質(zhì)中5 h內(nèi)溶液顯棕紅色，吸收特征無變化。樣品溶液穩(wěn)定，適合直接測(cè)定。

2.4 方法準(zhǔn)確度的確定

取3種不同品牌的食醋進(jìn)行加標(biāo)，按試驗(yàn)方法顯色測(cè)定4-甲基咪唑的回收率，考察方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

由表2可見，3種食醋樣品中，4-甲基咪唑均不同程度檢出。本測(cè)定方法的回收率為95%～105%，準(zhǔn)確度較高。

2.5 方法精密度的確定

按試驗(yàn)方法，平行測(cè)定6個(gè)食醋樣品各10次，對(duì)測(cè)得結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差S和變異系數(shù)C.V%，考察該方法的精密度，結(jié)果見表3。

表2 測(cè)定方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table2 Theaccuracy of determ inationm ethod of the experimental results

表3 測(cè)定方法的精密度Table3 The determ ination of thep recision of themethod

由表3可見，本方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97×10-5～9.37× 10-5，變異系數(shù)為0.002～0.008，精密度較高。

3 結(jié)論

利用紫外可見光譜法測(cè)定食醋中4-甲基咪唑，方法的檢出限為1.2μg，方法的平均回收率為95%～105%，本方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97×10-5～9.37×10-5，變異系數(shù)為0.002～0.008。方法操作簡便易行，可以獲得良好的重現(xiàn)性，并且靈敏度高，為食醋中4-甲基咪唑的檢驗(yàn)提供了一種切實(shí)可行的分析方法，具有一定的推廣價(jià)值。

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Determ ination of 4-M ethyl Im idazole Content in Vinegar by Uv-vis Spectrometry

CHENYan，ZHAOYu-ming*
（Dalian Institute for Food Control，Dalian 116630，Liaoning，China）

Themethod on determination of 4-methyl imidazole in vinegar by uv-vis spectrometry was established in thisstudy.The experimental results showed that：by precipitation，centrifugal，extraction，decolorizingand chromogenic reaction，4-methyl imidazole in the vinegarsampleshas themaximum absorption inwavelength of440 nm by diazo coupling and the quantitative determination was conducted on the basis of that.The linear equation was：A=13.721C+0.008 9，the linear correlation coefficientwas0.999 7，the detection limit was 1.2μg，the average recoverywas95%-105%，the standard deviation was1.97×10-5-9.37×10-5and the variation coefficientwas0.002-0.008.

vinegar；4-methylimidazole；diazo coupling；uv-visible spectrometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.030

2016-05-27

大連市食品協(xié)會(huì)基金資助項(xiàng)目（K20150629091408）

陳巖（1982—），女（漢），工程師，碩士，主要從事食品檢驗(yàn)與方法研究。

*通信作者：趙宇明（1977—），男（漢），高級(jí)工程師，碩士，主要從事食品檢驗(yàn)與方法研究。