于曉明，王霞

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

組織培養(yǎng)誘發(fā)玉米自交系H99、A188和黃早四的變異研究

于曉明，王霞

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

本實(shí)驗(yàn)利用AFLP技術(shù)對(duì)這三個(gè)玉米自交系的愈傷組織和再生苗進(jìn)行遺傳變異分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H99的再生率最低，并且具有最多的遺傳變異；而A188和黃早四的愈傷組織再生率都很高，而且愈傷組織和再生苗的變異較少。說(shuō)明玉米愈傷組織在組織培養(yǎng)過(guò)程中的基因組穩(wěn)定性是與愈傷組織分化再生過(guò)程密切相關(guān)。

玉米；組織培養(yǎng)；遺傳變異；AFLP

組織培養(yǎng)誘發(fā)的植物體細(xì)胞變異（也稱植物體細(xì)胞克隆變異），一般是指在植物細(xì)胞、組織或器官的離體培養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)生的遺傳變異或表觀遺傳變異[1]，這些變異可以通過(guò)細(xì)胞分裂和植物再生而傳遞給后代。植物體細(xì)胞克隆變異的產(chǎn)生沒(méi)有種屬特異性，出現(xiàn)的頻率一般比較高，一個(gè)組織培養(yǎng)周期內(nèi)可產(chǎn)生1%～3%的無(wú)性系變異，有時(shí)甚至能高達(dá) 90%以上[2]。植物通過(guò)體細(xì)胞克隆變異，可產(chǎn)生一系列有益的新性狀，對(duì)植物品種改良和新品種選育具有重要的意義[3]。然而體細(xì)胞胚或通過(guò)不定芽繁殖的植株經(jīng)常出現(xiàn)高頻率的體細(xì)胞克隆變異現(xiàn)象[4,5]，又使其成為微繁和遺傳轉(zhuǎn)化工作中需要克服的重大難題。本試驗(yàn)通過(guò)AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米玉米自交系H99、A188和黃早四在組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的 DNA序列變異的頻率和狀態(tài)進(jìn)行分析，探討分析玉米體細(xì)胞克隆遺傳變異的發(fā)生規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米自交系黃早四H99、A188和黃早四的種子苗、愈傷組織和再生苗。

1.2 組織培養(yǎng)和再生

各玉米自交系在授粉后12天，取幼胚，誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：N6基本培養(yǎng)基+2.8克/升脯氨酸 +1毫克 /升2，4-D+100毫克/升 水解酪蛋白+10毫克/升 硝酸銀 +2%蔗糖+0.7%瓊脂（pH5.8），于25±1℃條件下，暗培養(yǎng)4周。繼代培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2毫克/升 2，4-D，暗培養(yǎng)4周。分化培養(yǎng)基：N6基本培養(yǎng)基+1毫克/升 NAA+6%蔗糖+0.7%瓊脂（pH5.8），25±1℃、80umol·m-2·s-1光照強(qiáng)度、光照時(shí)間為14小時(shí)/天的條件下誘導(dǎo)再生苗。待再生苗長(zhǎng)至 2～3厘米高時(shí)取材。

1.3 DNA提取

分別采集種子苗、愈傷組織和再生苗的葉片，用改良的CTAB法[6]提取上述植物材料的基因組DNA。

1.4 AFLP分子標(biāo)記分析

AFLP分子標(biāo)記技術(shù)主要包括以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：酶切連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測(cè)[7]。使用的限制性內(nèi)切酶為MseI和EcoRI。

圖1 三個(gè)玉米自交系組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的遺傳變異頻率

2 結(jié)果

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生

玉米幼胚接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以后，2天后幼胚開(kāi)始膨脹，6天后就可見(jiàn)到開(kāi)始生成愈傷組織，以后半個(gè)月內(nèi)都可陸續(xù)見(jiàn)到愈傷組織的產(chǎn)生，黃早四的出愈率最低（42%），A188的最高（80%）（見(jiàn)表1）。雖然H99表現(xiàn)出了較好出愈率但是再生率很低，僅為 22.9%。

2.2 AFLP分子標(biāo)記檢測(cè)的遺傳變異

本實(shí)驗(yàn)以20對(duì)引物分別對(duì)各基因型玉米的種子苗、愈傷組織（愈傷）和隨機(jī)選取的4株再生苗（R1-R4）DNA樣品進(jìn)行了 AFLP分析。結(jié)果表明 A188、H99、黃早四分別產(chǎn)生826，790，904條帶，呈多態(tài)性的帶的條數(shù)分別為 30，62，38（表2）。

以種子苗作為對(duì)照，供體來(lái)源相同的愈傷組織或再生植株，表現(xiàn)變異的遺傳位點(diǎn)在各個(gè)材料中表現(xiàn)并不一致（圖 1）：其中A188在愈傷組織和再生苗中變異的頻率比較接近（1.5%～2.7%）；而 H99的愈傷組織檢測(cè)到了較多的變異（6.2%），4株再生苗的變異相對(duì)下降（4.0%～4.5%）；黃早四來(lái)源的愈傷組織發(fā)生變異比較少（2.5%）,而在其再生苗中的檢測(cè)到的變異更少（0.8%～1.5%）。另外，在 A188的愈傷組織和再生苗中檢測(cè)到的變異中，以條帶新增的變異為主，而 H99和黃早四的愈傷組織和再生苗的變異條帶沒(méi)有表現(xiàn)出這樣的傾向。

3 討論

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，為排除由于激素濃度或外部條件的不同或是離體培養(yǎng)時(shí)間不同而造成的遺傳變異頻率的不同，本實(shí)驗(yàn)對(duì)各個(gè)材料均采用一致的誘導(dǎo)、繼代、分化培養(yǎng)基和一致的培養(yǎng)條件，并且選擇相同培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織和再生苗。結(jié)果表明，玉米愈傷組織在組織培養(yǎng)過(guò)程中的基因組穩(wěn)定性是與愈傷組織分化再生過(guò)程密切相關(guān)的，而且不同基因型玉米由組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的遺傳變異頻率有較大差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于理解不同基因型玉米在組織培養(yǎng)并誘導(dǎo)再生過(guò)程中表現(xiàn)出來(lái)的巨大差異有很大幫助。

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表1 三個(gè)玉米自交系組織培養(yǎng)效率的分析

表2 各基因型玉米組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的AFLP多態(tài)性統(tǒng)計(jì)

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字〔2012〕第475號(hào)）

S513.03；S336

A

10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.051

于曉明，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，講師，研究方向：遺傳學(xué)與基因工程。