楊 青，李 洲，周世水*

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006；2.汕尾市青梅產業(yè)研究院，廣東陸豐 516500)

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YDL080c基因缺失的低異戊醇釀酒酵母菌構建

楊 青1，李 洲2，周世水1*

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006；2.汕尾市青梅產業(yè)研究院，廣東陸豐 516500)

[目的]構建YDL080c基因缺失的低異戊醇生成的釀酒酵母菌。[方法]利用Cre-loxP重組系統與酵母電轉化法敲除釀酒酵母中編碼類丙酮酸脫羧酶的基因YDL080c，切斷釀酒酵母代謝中的異戊醇生成，從而構建一株低異戊醇生成的釀酒酵母菌株。[結果]成功構建出YDL080c基因缺失的工程酵母菌Y1，Y1釀造酒中相對異戊醇含量為0.81 g/L，比初始菌降低28.3%。[結論]利用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能夠有效減少釀造酒中異戊醇的生成量。

基因敲除；異戊醇；釀酒酵母

蒸餾酒中除含乙醇、酯類和有機酸外，還含有異戊醇、異丁醇、正丙醇等高級醇。一般蒸餾酒中高級醇的含量偏高，在1.5 g/L[1]左右，酒中適當高級醇含量有利于酒的口感，但高級醇含量過高會使飲用者產生頭暈目眩的感覺，嚴重影響酒的品質。

蒸餾酒高級醇中異戊醇的含量約占50%，異戊醇在酵母釀造酒中主要通過Ehrlich代謝機制和Harris代謝機制[2-4]2種途徑產生。丙酮酸脫羧酶系是整個代謝過程中至關重要的酶系，敲除編碼丙酮酸脫羧酶系的基因會有效地降低酵母代謝過程中產生的異戊醇含量，從而降低酒中高級醇含量。筆者利用Gre-loxP重組系統[5]與酵母電轉化法敲除釀酒酵母中編碼類丙酮酸脫羧酶的基因YDL080c,構建低生成異戊醇的釀酒酵母用于釀造低高級醇酒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與質粒。釀酒酵母S2(華南理工大學發(fā)酵工程實驗室保存)，質粒pUG6(含抗G418 的Kanr篩選標記)購于杭州寶賽生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑。TaqHS酶購于TaKaRa公司，G418購于紐普諾博生物制品有限公司，小量酵母基因提取試劑盒、質粒制備試劑盒購于艾比根生物技術有限公司，凝膠DNA微量回收試劑盒購于基(欣研)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器。411BR8273 電轉儀、電泳儀、Gel Doc2000凝膠成像分析系統、安捷倫7890A氣相色譜儀、DB-WAX毛細管柱( 30.00 m × 0.25 m× 2.50 μm)。

1.1.4 PCR引物。根據NCBI獲得基因YDL080c與GenBank獲得pUG6的基因序列(AF298793.1)設計引物，由英濰捷基貿易有限公司合成。基因YDL080c的驗證引物A1、A2，敲除引物B1、B2，轉化敲除組件后的驗證引物C1、C2。A1：GAGTTAAATGCTGCCTACG，A2：GTTGGCGGCATACCCACTATG；B1：CGGCTCAACCAGCTGAACATACATACCATATTT-GGACTCTCCGGACAGCTGAAGCTTCGTAC，B2：CTGGTTGGA-ACCAATGGGATATTTCATTCCAGACCCATTCTTGTCGCATAG-GCCACTAGTGGATC；C1：CCAGAATACCCTCCTTGA，C2：TGTTTATGTTCGGATGTGAT。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因YDL080c的驗證。以0.4 μL 提取菌株S2的DNA 為模板，A1、A2 為引物進行PCR。反應體系為10 μL，反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，49.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物。

1.2.2 菌株S2對抗生素G418 耐受試驗?？股谿418 濃度分別為0、20、40和60 μg /mL。將菌株S2分別涂布于不同抗生素濃度的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 基因YDL080c敲除組件的PCR擴增。以pUG6 為模板，B1、B2 為引物( 5′端有45 bp與YDL080c 同源[6])，按“1.2.1”的PCR條件進行擴增和瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.4 轉化和篩選陽性酵母菌。將YDL080c基因敲除組件用電轉化法[7]轉化酵母(OD600 nm= 2)，然后涂布在含抗生素G418 濃度60 μg /mL 的YPD 平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d。

取幾株平板上的陽性菌株與初始菌株S2進行搖床培養(yǎng)12 h,分別提取其基因組，以C1、C2為引物進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.5 菌株的發(fā)酵。用13°P 麥芽汁，接種1 × 107CFU/mL，30 ℃發(fā)酵6 d，蒸餾出50%體積的酒，測定乙醇和異戊醇含量。

1.2.6 異戊醇的氣相色譜法測定。色譜分離條件：N2流速2.0 mL/min，干燥空氣流速350 mL/min，H2流速30 mL/min，N2尾吹30 mL/min；壓力18.939 psi，分流比30∶1，檢測器進樣口溫度均為250 ℃，進樣量1 μl。

升溫程序：50 ℃保溫2 min，再以15 ℃ /min 升溫至200 ℃，并保溫3 min。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母S2中基因YDL080c的PCR驗證結果 按照“1.2.1”方法進行PCR擴增，再進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。由圖1可知，泳道1與泳道2 PCR產物的DNA片段與設計的驗證引物A1、A2擴增的DNA片段(161 bp)大小一致，因此可判斷菌株S2中含有基因YDL080c。

2.2 釀酒酵母S2對抗生素G418 的耐受性 按照“1.2.2”方法進行釀酒酵母S2對抗生素G418 的耐受性試驗，結果見圖2。由圖2可知，隨著培養(yǎng)基中抗生素G418 濃度的升高，平板中的菌落逐漸減少，當G418 的濃度達到60 μg/mL，不含Kanr抗性基因的酵母菌株將無法生長。因此，G418濃度60 μg/mL為篩選轉化菌株的濃度。

注：M.DL 2000 Marker，1和2.基因YDL080c的PCR產物。Note：M was DL 2000 Marker，1 and 2 was PCR products of genetic YDL080c.圖1 基因YDL080c的PCR擴增結果Fig.1 The results of electrophoresis of gene YDL080c by PCR amplification

注：A、B、C、D中G418濃度分別為0、20、40、60 μg/mL。Note:G418 concentration was 0, 20, 40, 60 μg/mL respectively in A, B, C and D.圖2 釀酒酵母S2對抗生素G418 的耐受性Fig.2 Resistance experiment of Saccharomyces cerevisiae S2 to the antibiotic G418

2.3YDL080c基因敲除組件的PCR擴增 根據“1.2.3”方法PCR擴增YDL080c基因敲除組件，結果見圖3。由圖3可知，泳道6的PCR產物片段與設計的敲除引物B1、B2擴增的DNA片段(1 703 bp)大小一致，因此，確定泳道6的PCR成功構建出YDL080c基因的敲除組件。

注：M.DL 2000 Marker，6.基因YDL080c的PCR電泳結果。Note：M was DL 2000 Marker，6 was PCR electrophoresis results of gene YDL080c.圖3 YDL080c基因敲除組件構建的電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of YDL080c gene knockout assembly

2.4 轉化菌株的PCR篩選 根據“1.2.4”方法，用PCR方法剔除假陽性菌落，以篩選陽性工程菌，結果見圖4。由圖4可知，初始酵母菌株S2、工程菌株Y2、Y3、Y4、Y5、Y6的PCR產物在電泳中均無DNA條帶，僅工程菌株Y1驗證得到了與設計的驗證引物C1、C2大小一致的DNA片段(330 bp)，因此可判定菌株Y1已成功敲除YDL080c基因。

注：M.DL 2000 Marker，S2.初始菌株PCR驗證產物，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5.為陽性菌株的PCR驗證產物。Note：M was DL 2000 Marker，S2 was PCR validation product of the initial strain，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5 was PCR validation product of positive strains.圖4 工程菌株PCR驗證結果Fig.4 The PCR validation experiment of engineering strain

2.5 工程菌株的發(fā)酵試驗 按照“1.2.5”方法對工程菌株Y1進行發(fā)酵試驗。根據氣相色譜測定結果繪制出異戊醇測定的標準曲線，并得到線性方程：y=1.865 3x+0.002 9，其中，x為異戊醇濃度，y為異戊醇測定峰面積RF，結果見圖5。

圖5 異戊醇測定的標準曲線Fig.5 The standard curve of isopentanol measurement

將工程菌株Y1發(fā)酵蒸餾酒的異戊醇氣相測定RF值帶入方程y= 1.865 3x+0.002 9，得到Y1的相對異戊醇含量為0.81 g/L，其氣相測定圖譜見圖6。

圖6 菌株Y1釀造酒的氣相色譜Fig.6 Gas chromatogram of brewing wine of strain Y1

初始菌株S2的相對異戊醇含量為1.13 g/L，Y1釀造酒中的相對異戊醇含量比S2降低了28.3%，降低異戊醇的效果顯著。且釀造酒的酒精含量也略有升高，從原來的10.0%提高到10.5%。這表明用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能夠有效降低釀造酒中的異戊醇含量，且不影響菌株的酒精發(fā)酵性能。

2.6 菌株Y1的傳代穩(wěn)定性 對菌株Y1進行連續(xù)5代以上的傳代，按照“1.2.5”方法進行發(fā)酵試驗，并測定異戊醇含量，結果見表1。由表1可知，基因敲除的工程菌Y1經過5代的傳代，其相對異戊醇含量基本保持在0.81 g/L，說明經過Cre-loxp重組系統改造的工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 菌株Y1傳遞5代后蒸餾酒中的物質含量

Table 1 Substance content of distilled liquor is fermented by strain Y1was passed in 5 generations

傳代代數Passagegeneration相對異戊醇含量Relativeisopentanolcontent∥g/L酒精濃度(V/V)Alcoholconcentration%F10．7910．0F20．8010．3F30．8110．5F40．8010．3F50．8110．5

3 結論

該研究成功構建了一株基因YDL080c缺失的釀酒酵母工程菌Y1，能夠顯著降低釀造酒中的異戊醇含量，Y1釀造酒中的相對異戊醇含量降低至0.81 g/L，比初始菌S2降低了28.3%。對于乙醇的發(fā)酵性能，Y1不僅未降低，反而略有升高，其遺傳性狀經5代傳遞表現穩(wěn)定。參考文獻

[1] 周世水.控制啤酒中高級醇含量的研究[J].釀酒，2005，33(3)：51-53.

[2] DICKINSON J R，HARRISON S J，DICKINSON J A，et al.An investigation of the metabolism of isoleucine to active amyl alcohol in saccharomyces cerevisiae[J].Journal of biological chemistry，2000，275(15)：10937-10942.

[3] 李童，孫軍勇，吳殿輝，等.YDL080C和LEU2基因敲除對工業(yè)黃酒酵母異戊醇生成量的影響[J].食品工業(yè)科技，2015，36(15)：189-193.

[4] 張興亞，林玲，蔣予箭.黃酒中高級醇含量控制的研究進展[J].中國釀造，2011(10)：13-17.

[5] 熊志欽，周世水.基因敲除GCV2的釀酒酵母構建[J].安徽農業(yè)科學，2015(15)：63-65.

[6] GUELDENER U，HEINISCH J，KOEHLER G J，et al.A second set ofloxPmarker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast[J].Nucleic acids research，2002，30(6)：88-94.

[7] 張軒薇，葉燕銳，劉曉肖，等.畢赤酵母新啟動子GCW14在細胞表面展示CALB中的應用[J].生物技術通報，2013(4)：129-135.

Construction ofSaccharomycescerevisiaewith Low Isopentanol Production by Deleting GeneYDL080c

YANG Qing1, LI Zhou2, ZHOU Shi-shui1*

(1.College of Biological Science and Engineering, South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong 510006；2.Shanwei City Plum Industry Research Institutey,Lufeng, Guangdong 516500)

[Objective]TheSaccharomycescerevisiaewith producing low isopentanol was constructed by knocking out geneYDL080c.[Method]TheSaccharomycescerevisiaewith producing low isopentanol was constructed byusing Cre-loxP recombination system and yeast electrical transformation method to knock out the geneYDL080cencoding pyruvate decarboxylase,in order to cut off the produce of isopentanol in metabolism ofSaccharomycescerevisiae.[Result]The engineering strain Y1withoutYDL080cwas successfully constructed. The relative isopentanol content was 0.81 g/L in wine brewed by Y1, which was 28.3% lower than that of the original strain. [Conclusion]EngineeringSaccharomycescerevisiaewithout geneYDL080ccan effectively reduce the production of isopentanol in brewed wine.

Gene knock-out；Isopentanol；Saccharomycescerevisiae

楊青(1991- )，女，甘肅蘭州人，碩士研究生，研究方向：基因敲除。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事發(fā)酵工程與釀酒方面的研究。

2016-11-02

S 188+.4

A

0517-6611(2016)33-0140-03