張 瑩， 孫立方,2， 冉 洪， 馮 云， 張 韞， 郭起榮*

( 1. 國(guó)際竹藤中心， 國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室， 北京 100102； 2. 南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)院， 天津 300071 )

?

毛竹花粉的形態(tài)及雙受精過(guò)程研究

張 瑩1， 孫立方1,2， 冉 洪1， 馮 云1， 張 韞1， 郭起榮1*

( 1. 國(guó)際竹藤中心， 國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室， 北京 100102； 2. 南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)院， 天津 300071 )

由于實(shí)驗(yàn)的材料、條件和技術(shù)的限制，關(guān)于竹類花粉形態(tài)、花粉管生長(zhǎng)過(guò)程的研究十分少見(jiàn)。毛竹(Phyllostachysedulis)屬于禾本科(Poaceae/Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物，在我國(guó)廣泛分布，具有重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和文化價(jià)值。由于其獨(dú)特的生殖生物學(xué)特性，即開(kāi)花周期長(zhǎng)、結(jié)籽率低，所以對(duì)其開(kāi)花材料的獲取十分困難。該研究在其獨(dú)特的開(kāi)花特性基礎(chǔ)上，結(jié)合野外實(shí)地觀察，利用顯微鏡、環(huán)境掃描電鏡、熒光顯微鏡等，對(duì)毛竹的花粉形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及花粉管的萌發(fā)與生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行了首次報(bào)道。結(jié)果表明：(1)毛竹花粉近球形，平均直徑為61.00 μm，屬于大型孢子。(2)毛竹成熟花粉落到雌蕊柱頭上后，經(jīng)過(guò)花粉與柱頭的成功識(shí)別，開(kāi)始萌發(fā)，并形成花粉管；隨著花粉管的逐漸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，依次經(jīng)過(guò)柱頭和花柱，到達(dá)子房；約120 min后到達(dá)珠孔處，進(jìn)入胚珠和胚囊，完成雙受精作用。通過(guò)對(duì)毛竹花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)和花粉管生長(zhǎng)至受精過(guò)程的動(dòng)態(tài)觀察，為毛竹花粉可授性、花粉生理、生化研究提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)準(zhǔn)備。該研究結(jié)果完善和豐富了毛竹乃至整個(gè)禾本科植物在生殖生物學(xué)方面的研究?jī)?nèi)容。

毛竹， 花粉形態(tài)， 花粉萌發(fā)， 雙受精作用， 熒光顯微技術(shù)

竹類植物是禾本科(Poaceae/Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物的總稱，全世界約88屬，1 400多種，是全球森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和文化價(jià)值，被公認(rèn)為 2l 世紀(jì)世界上最重要的植物資源之一(Isagi et al，2004)。毛竹在我國(guó)廣泛分布，具有重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和文化價(jià)值(江澤慧，2002；周芳純，1998)。根據(jù)最新數(shù)據(jù)(第八次全國(guó)森林資源清查報(bào)告)，我國(guó)竹林面積為601 萬(wàn)hm2，其中毛竹林面積為443 萬(wàn)hm2，占整個(gè)竹林面積的74%(國(guó)家林業(yè)局，2014)。然而，由于毛竹開(kāi)花周期長(zhǎng)達(dá)60 a，對(duì)于獲取生殖生物學(xué)方面的材料比較困難，所以對(duì)其開(kāi)花方面的研究也比較少見(jiàn)。絕大多數(shù)竹類植物以無(wú)性繁殖為主、一生只開(kāi)花一次，開(kāi)完花后植株即死亡，開(kāi)花周期在六七十年以上，造成竹類花粉的采集十分困難(王曙光等，2006；盧江杰等，2009)。早在 20 世紀(jì) 80 年代，對(duì)13種竹子(不包含毛竹)的花粉大小、形態(tài)、萌發(fā)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)竹子花粉存在大量敗育現(xiàn)象(張文燕等，1989)。

花粉的形態(tài)及其萌發(fā)雖然屬于植物發(fā)育解剖學(xué)的經(jīng)典基礎(chǔ)內(nèi)容，但是限于儀器設(shè)備、試驗(yàn)材料選取和實(shí)驗(yàn)操作條件等限制，進(jìn)展緩慢。如：關(guān)于水稻花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的研究在2007年才有了第一次報(bào)道(陳士強(qiáng)等，2007)。在中國(guó)，廣袤分布，具有絕對(duì)產(chǎn)量、產(chǎn)業(yè)地位的毛竹(Phyllostachysedulis)長(zhǎng)期不開(kāi)花，制約著其在生殖發(fā)育學(xué)方面的研究。關(guān)于其開(kāi)花解剖學(xué)方面的研究?jī)H見(jiàn)南京林業(yè)大學(xué)等機(jī)構(gòu)在20世紀(jì)70年代末對(duì)江西興國(guó)局部地區(qū)開(kāi)花的毛竹林進(jìn)行了生殖生物學(xué)方面的研究(喬士義和廖光廬，1984；喬士義，1984)。國(guó)際竹藤中心郭起榮種質(zhì)資源課題組于21世紀(jì)初調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西桂林海洋山一代的毛竹林從“解放前”到現(xiàn)在一直零星開(kāi)花，即開(kāi)始了對(duì)毛竹生殖發(fā)育方面的系統(tǒng)研究工作。已經(jīng)有毛竹花器官形態(tài)，花序結(jié)構(gòu)，花粉保存條件等方面的研究報(bào)道(王青等，2012；孫立方等，2013；周建梅等，2015)。

鑒于毛竹生殖發(fā)育最基本的花粉，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程方面的研究都是空白。本研究采用先進(jìn)的熒光顯微觀察技術(shù)，首次對(duì)自然開(kāi)花毛竹的花粉形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以及花粉管的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行了觀察，旨在探明毛竹花粉的形態(tài)，及花粉管在柱頭、子房中的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)過(guò)程，為開(kāi)展花粉生理、生化研究提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)竹類植物開(kāi)花等生殖生物學(xué)方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2010-2015年逐年，分別于廣西區(qū)桂北海洋山，用硫酸紙收集處于盛花期的毛竹花粉。試驗(yàn)地氣候?qū)儆谥衼啛釒夂颍０谓? 000 m，年均溫為18.5 ℃，1月平均氣溫7～8 ℃，7月平均氣溫28～29 ℃，≥10 ℃的積溫為5 500～6 000 ℃，4-9月為雨季，年平均降水量為1 800 mm。

1.2 方法

將收集到的新鮮花藥，平鋪在未使用的硫酸紙上，于陰涼處自然風(fēng)干30～60 min。隨著花藥囊的開(kāi)裂，輕輕抖落花粉，密封保存于潔凈、干燥的離心管中，儲(chǔ)存于冰盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)研究。

用干凈的毛筆，輕輕蘸取適量花粉，輕撒在新的載玻片上，并滴加1～2滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，毛竹花粉玻片制作完成。在顯微鏡(LEICA DM LB2)20倍物鏡下，觀察毛竹花粉玻片(隨機(jī)選取5個(gè)視野)，并對(duì)花粉直徑大小進(jìn)行測(cè)量。

圖 1 毛竹花粉形態(tài)觀察 A. 顯微鏡下的花粉形態(tài) (10×)； B. 掃描電鏡下的 花粉形態(tài) (2 000×)； C. 萌發(fā)孔 (1. 萌發(fā)孔， 2. 孔環(huán)) (6 000×)。Fig. 1 Pollen shape observation of Phyllostachys edulis A. Pollen shape in the microscope (10×)； B. Pollen shape in the scanning electron microscope (2 000×)； C. Germinal aperture of pollen (1. Germinal aperture, 2. Circle) (6 000×).

圖 2 毛竹花粉萌發(fā)與受精 A. 熒光顯微鏡下的柱頭 (10×)； B. 掃描電鏡下萌發(fā)的花粉 (500×)； C. 授粉40 min后的 花粉管 (10×)； D. 授粉120 min后的花粉管 (10×)； E. 授粉120 min后的子房 (受精) (40×)。Fig. 2 Pollen germination and fertilization of Phyllostachys edulis A. Stigma under fluorescence microscope (10×)； B. Germinal pollen under scanning electron microscope (500×)； C. Pollen tube after pollination 40 min (10×)； D. Pollen tube after pollination 120 min (10×)； E. Ovary (fertilization) after 120 min (40×).

在毛竹開(kāi)花林中，選取不同竹株，每株1～2個(gè)樣枝，做好標(biāo)記。在花藥剛剛裂開(kāi)時(shí)，用干凈毛筆收集花粉，并涂抹在還未授粉的小花柱頭上，進(jìn)行雌蕊授粉。

授粉后，分別于1、2、3、5、10、20、30、40、60、120 min，用鑷子采集授粉小花5～10朵，放入盛有FAA固定液的離心管中，進(jìn)行固定；固定24 h后，將授粉小花保存于70%的酒精溶液中，并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)觀察。

在實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)進(jìn)行過(guò)固定處理且已授粉的小花子房，依次用濃度為50%、30%、10%的酒精溶液進(jìn)行梯度復(fù)水處理；用2 mol·L-1的NaOH溶液對(duì)復(fù)水后的小花子房進(jìn)行軟化12 h，并用蒸餾水清洗2次；用0.05%的苯胺藍(lán)溶液染色，放置12 h；將染色后的小花子房放在新的、干凈的載玻片上，滴1滴甘油，蓋上蓋玻片(不能有氣泡產(chǎn)生)；將制作好的小花子房玻片置于熒光顯微鏡下，進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)

在顯微鏡下，觀察、測(cè)量花粉的大小(圖1： A)。對(duì)36?；ǚ鄣闹睆酱笮∵M(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花粉平均直徑為61.00 μm(最小直徑51.20 μm，最大直徑68.25 μm)，毛竹花粉屬于大型孢子。

采用環(huán)境掃描電鏡，對(duì)毛竹的花粉進(jìn)行形態(tài)觀察(圖1： B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛竹花粉近球形，外壁紋飾為細(xì)顆粒狀；有一個(gè)圓形的萌發(fā)孔(圖1： C)，萌發(fā)孔的內(nèi)、外孔徑分別為4.52和8.69 μm。

2.2 花粉的萌發(fā)與受精

竹類植物花絲細(xì)長(zhǎng)，花粉小而無(wú)粘性，易隨風(fēng)傳播，為風(fēng)媒花植物(江澤慧，2002)。本研究在野外條件下發(fā)現(xiàn)，毛竹小花屬開(kāi)張型；在開(kāi)花時(shí)，其稃片張開(kāi)，雄蕊伸出，雌蕊露出，柱頭為羽狀三裂。

毛竹花粉成熟后，開(kāi)始進(jìn)行傳粉和受精過(guò)程(孫立方等，2012)(圖2： A，B)。成熟花粉粒落到柱頭上后，先吸水膨脹，經(jīng)過(guò)花粉與柱頭的相互識(shí)別，開(kāi)始萌發(fā)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，花粉落到柱頭上40 min后，有大量的花粉粒萌發(fā)(圖2： C)；隨后，花粉管生長(zhǎng)、伸長(zhǎng)，遠(yuǎn)大于花粉粒直徑?；ǚ酃芙?jīng)過(guò)花柱，到達(dá)子房(圖2： D)；約120 min后，花粉管伸到珠孔，從珠孔進(jìn)入胚珠和胚囊，完成雙受精過(guò)程(圖2： E)；形成胚胎，發(fā)育成種子(圖3)。

圖 3 毛竹種子Fig. 3 Seeds of Phyllostachys edulis

3 討論

本研究采用掃描電鏡、熒光顯微鏡等設(shè)備，對(duì)毛竹的花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)，花粉管的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)過(guò)程，以及毛竹的雙受精過(guò)程進(jìn)行了觀察。測(cè)得的毛竹花粉平均直徑(61.00 μm)，大于異葉苦竹(Arundinariasimoniif.albostriatus)的平均直徑(27.86 μm)和鵝毛竹(Shibataeachinensis)的平均直徑(40.22 μm)(林樹(shù)燕，2009；林樹(shù)燕等，2009)；也大于水稻(Oryzasativa)(20 μm)、玉米(Zeamays)(40 μm)、狼尾草(Pennisetumsp.)(22 μm)的花粉直徑(劉志玲等，1999)。本研究還發(fā)現(xiàn)，毛竹花粉為近球形，這與異葉苦竹、鵝毛竹的花粉形態(tài)相似(林樹(shù)燕，2009；林樹(shù)燕等，2009)，而顯著區(qū)別于禾本科的水稻(棒狀)、玉米(球形)、狼尾草(橢圓形)的花粉形態(tài)(劉志玲，1999)。毛竹花粉外壁紋飾為細(xì)顆粒狀，具有一個(gè)圓形的萌發(fā)孔，與異葉苦竹、鵝毛竹的外壁紋飾相近，而與水稻、玉米、狼尾草的外壁紋飾有顯著區(qū)別。毛竹成熟花粉落到雌蕊柱頭上后，經(jīng)過(guò)相互識(shí)別，開(kāi)始萌發(fā)，花粉管形成。隨后，花粉管逐漸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，依次經(jīng)過(guò)柱頭、花柱，到達(dá)子房，從珠孔處進(jìn)入胚珠、胚囊，完成雙受精過(guò)程。喬士義和廖光廬(1984)僅報(bào)道了毛竹的胚胎發(fā)育，本研究彌補(bǔ)了毛竹花粉形態(tài)特征的空白，并報(bào)道了花粉管的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)過(guò)程，豐富和完善了毛竹生殖生物學(xué)方面的研究。

有了前期的花粉發(fā)育解剖研究基礎(chǔ)，可為毛竹花粉的可授性、可授期觀察奠定基礎(chǔ)，為毛竹的種子生產(chǎn)提高人工授粉成功率；同時(shí)，為毛竹花粉的生理、特別是生化研究積累經(jīng)驗(yàn)。近期可見(jiàn)麻核桃、普通核桃的花粉生理特性比較研究(陳夢(mèng)華等，2015)，文章中測(cè)定了其花粉的可溶性蛋白質(zhì)含量，保護(hù)酶(超氧化物歧化酶SOD，過(guò)氧化物酶POD及過(guò)氧化氫酶CAT)的活性、丙二醛(MDA)的含量。同樣，花粉、柱頭的相互識(shí)別是受精成功的必要前提。在受精過(guò)程中，要經(jīng)過(guò)3個(gè)層次的識(shí)別，即花粉、柱頭的相互識(shí)別；花粉管、花柱的相互識(shí)別；雌雄配子之間的相互識(shí)別。任何一個(gè)部位不能成功識(shí)別，都會(huì)導(dǎo)致受精失敗，從而產(chǎn)生敗育現(xiàn)象(袁坤，2004)。Dong et al(2013)在對(duì)毛竹花粉與柱頭間識(shí)別的初步研究中也同樣發(fā)現(xiàn)，花粉壁在受精過(guò)程中起著重要的作用，其不僅與柱頭的識(shí)別過(guò)程有關(guān)，而且在花粉發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用。關(guān)于花粉壁等相關(guān)方面的進(jìn)一步研究，還有待于對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)的完善，需要進(jìn)行更深入的分析，積累大量數(shù)據(jù)。

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Pollen morphology and double fertilization ofPhyllostachysedulis

ZHANG Ying1, SUN Li-Fang1,2, RAN Hong1, FENG Yun1,ZHANG Yun1, GUO Qi-Rong1*

( 1.InternationalCenterforBambooandRattan,SFAKeyLaboratoryofBambooandRattanScienceandTechnology,Beijing 100102, China; 2.CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity, Tianjin 300071, China )

Due to the limitations of experimental materials, conditions and techniques, the research on bamboo pollen morphology and the process of pollen tube growth are very rare.Phyllostachysedulis(moso bamboo) (Bambusoideae, Poaceae) is the most important bamboo species, which has large cultivation area and is widely cultivated in China. It has important economic value for its versatile culms and delicious shoots. Besides, moso bamboo also has important ecological and cultural values. It it well known that moso bamboo has a prolonged vegetative phase lasting decades or even longer. The flowering cycle is very long and has low seed setting rate, which leads to the hardness of researching on the flower ofP.edulis. Thus, the vegetative (asexual) propagation is the main way of moso bamboo reproduction. In order to investigate the mechanism of blooming of moso bamboo, the pollen’s morphology, structure and the growth dynamic of pollen tube ofP.eduliswere observed by using scanning electron microscope and microscope based on the special blossoming characteristics of moso bamboo, which was the first report about moso bamboo pollen. The results showed that the pollen belonged to large spores. It was subglobose in the scanning electron microscope. The average diameter of pollen was 61.00 μm. The ornamentation of its outer wall was fine granular and has a round germinal aperture. There was a porous circle around the germination aperture. The outer diameter of the germinal aperture was 8.69 μm and the inner diameter was 4.52 μm. The mature pollen ofP.edulisfell onto the stigma and began to germinate and formed the pollen tube. After 40 m, a large number of pollen on the stigma began to germinate. The pollen tube grew gradually, through the stigma tissue and stylet, which finally reached to the ovary. After 120 m, the tube reached to the micropyle, and then entered into the ovule and completed fertilization in sac. Finally, the embryo developed into seeds. Through the observation of pollen morphology, germination and double fertilization ofP.edulis, this study provides theories and methods for further research on the stigma receptivity, physiological and biochemical of moso bamboo’s pollen, improving and enriching the research content of bamboo plant reproductive biology at the same time.

Phyllostachysedulis， pollen shape， pollen germination， double fertilization， fluorescence microscopic observation

10.11931/guihaia.gxzw201511010

2015-12-15

2016-04-23

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2013BAD01B06-3) [Supported by the National Key Technology R & D Program of China (2013BAD01B06-3)]。

張瑩(1989-)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事竹子種質(zhì)資源研究，(E-mail)yingzhang28@126.com。

*通訊作者： 郭起榮，博士，教授，博士生導(dǎo)師，一直從事竹子種質(zhì)資源的研究，(E-mail)QRGUO@icbr.ac.cn。

Q943

A

1000-3142(2016)11-1325-05

張瑩， 孫立方， 冉洪， 等. 毛竹花粉的形態(tài)及雙受精過(guò)程研究 [J]. 廣西植物， 2016， 36(11):1325-1329

ZHANG Y, SUN LF, RAN H， et al. Pollen morphology and double fertilization ofPhyllostachysedulis[J]. Guihaia， 2016， 36(11):1325-1329