楊艷，杜云翔，張闖，韋淑貞

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000； 2.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬解放軍八二醫(yī)院，江蘇 淮安 223001)

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·論 著·

p63、P- gp、GST- π及Topo- Ⅱ在食管鱗癌組織中的表達

楊艷1，2，杜云翔2，張闖2，韋淑貞2

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000； 2.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬解放軍八二醫(yī)院，江蘇 淮安 223001)

目的:觀察比較p63、P- 糖蛋白(P- gp)、谷甘胱肽- S- 轉(zhuǎn)移酶π(GST- π)、DNA拓撲異構(gòu)酶(Topo- Ⅱ)在食管癌中的表達情況，并探討其關(guān)系和臨床意義。方法:采用免疫組化方法對168例食管鱗癌組織中p63、P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白進行檢測，分析其與病理特征的關(guān)系及協(xié)同表達的意義。結(jié)果:p63、P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白在食管鱗癌中的陽性表達率分別為81.0%、57.1%、71.4%、78.6%。p63的表達與腫瘤的臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，P- gp和TopoⅡ的表達與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，GST- π的表達與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。p63的陽性表達與P- gp、GST- π呈正相關(guān)(r=0.193、0.197，P<0.05)，P- gp與GST- π表達呈正相關(guān)(r=0.224，P<0.05)，P- gp與TopoⅡ表達呈負相關(guān)(r=-0.218，P<0.05)。結(jié)論:p63、P- gp、GST- π及Topo- Ⅱ均與食管癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，對腫瘤化療方案的選擇和預(yù)后判斷有重要的臨床意義。

食管鱗癌； 免疫組化； p63； P- 糖蛋白； 谷甘胱肽- S- 轉(zhuǎn)移酶π； DNA拓撲異構(gòu)酶

食管癌(esophageal cancer，EC)是發(fā)生于食管上皮組織的常見惡性腫瘤，我國食管癌的發(fā)病率和死亡率均居全球首位，平均5年生存率為僅為10%左右。食管癌主要包括鱗癌和腺癌，我國則以鱗癌為主[1]。化療是治療食管癌的主要手段之一，但治療效果不理想，其中重要癥結(jié)在腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗，形成多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。MDR的形成又是多種機制共同參與的結(jié)果，主要包括P- 糖蛋白(P- gp)、谷甘胱肽- S- 轉(zhuǎn)移酶π(GST- π)過表達及DNA拓撲異構(gòu)酶(Topo- Ⅱ)低表達等。本研究檢測p63和P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白在食管鱗癌中的表達水平，評價其與臨床病理特征的關(guān)系及其在選擇化療方案時的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年2月至2015年11月蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬解放軍八二醫(yī)院心胸外科和腫瘤外科手術(shù)切除的食管鱗癌石蠟組織168例，所有標本均有明確的病理診斷。其中男110例，女58例，年齡48～82歲，中位年齡63歲。病理類型均為食管鱗狀細胞癌，患者均為首次住院，未進行放、化療等治療。食管癌患者臨床分期按照2010年AJCC公布的食管癌TNM分期標準：Ⅰ期10例，Ⅱ期126例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例。食管鱗癌分化程度：高分化鱗癌52例，中分化鱗癌92例，低分化鱗癌24例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者54例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者114例。浸潤深度：浸潤未達外膜者124例，浸潤達食管外膜者44例。

1.2 實驗試劑

鼠人抗p63、P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ單克隆抗體及ElivisionTMplus試劑盒等均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

所有食管鱗癌組織石蠟切片按常規(guī)進行脫蠟，水化后用ElivisionTMplus法進行免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明操作。用已知表達的結(jié)腸癌組織切片標本作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 判斷標準

組織切片陽性表達判定:P- gp定位于胞漿和胞膜，GST- π定位于胞質(zhì)，Topo- Ⅱ、p63定位于胞核，在上述部位出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)物為陽性反應(yīng)。隨機觀察10個高倍視野，按陽性細胞所占百分比分為：(-)，切片中無陽性細胞；(+)，陽性細胞數(shù)<25%;(++)，陽性細胞數(shù)25%～50%；(+++)，陽性細胞數(shù)>50%。便于分析，本實驗以(-)、(+)作為陰性表達，(++)、(+++)作為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，各組間陽性率的比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p63、P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白在食管鱗癌中的表達

168例食管鱗癌組織中p63、P- gp、GST- π、TopoⅡ蛋白均高表達，陽性率分別為81.0%(136/168)、57.1%(96/168)、71.4%(120/168)、78.6%(132/168)。見圖1～4。

2.2 食管鱗癌中p63、P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

p63蛋白的表達與腫瘤的TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與分化程度無關(guān)(P>0.05)；P- gp和TopoⅡ蛋白的表達僅與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與而與其他病理特征無關(guān)(P>0.05)；GST- π蛋白的表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與其他病理特征無關(guān)(P>0.05)。見表1。

圖1 p63在食管鱗癌中的陽性表達 ×200

Fig 1 p63 positive expression in esophageal squamous cell carcinoma ×200

圖2 P- gp在食管鱗癌中的陽性表達 ×200

Fig 2 P- gp positive expression in esophageal squamous cell carcinoma ×200

圖3 GST- π在食管鱗癌中的陽性表達 ×200

Fig 3 GST- π positive expression in esophageal squamous cell carcinoma ×200

圖4 Topo- Ⅱ在食管鱗癌中的陽性表達 ×200

Fig 4 Topo- Ⅱpositive expression in esophageal squamous cell carcinoma ×200

2.3 p63與P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ在食管鱗癌組織中的相關(guān)性

采用Spearman等級分析方法對食管癌組織中的p63與P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白表達相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示p63的表達與P- gp、GST- π呈正相關(guān)(r=0.193、0.197，P<0.05)，與Topo- Ⅱ不相關(guān)(P>0.05)，見表2。P- gp與GST- π表達呈正相關(guān)(r=0.224，P<0.05)，與Topo- Ⅱ表達呈負相關(guān)(r=-0.218，P<0.05)，見表3。

3 討 論

食管癌的分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度是影響患者生存預(yù)后的重要因素，臨床上發(fā)現(xiàn)對同一病理特征的患者給予相同治療方案也會出現(xiàn)不同的效果，這使得病理特征預(yù)測預(yù)后的價值受到質(zhì)疑。隨著對生物標志物的深入研究和各種新型藥物的問世，基因表型越來越受到關(guān)注，尤其是耐藥基因的表達與臨床患者化療方案的確定、治療療效密切相關(guān)。目前研究較多的MDR基因為P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ等。但在食管鱗癌組織中p63是否與MDR基因表達一致，研究較少。

P- gp是一種膜轉(zhuǎn)運蛋白，在三磷酸腺苷(ATP)的參與下可與阿霉素類、長春新堿、紫杉醇等化療藥的藥物分子結(jié)合，通過其自身的藥泵作用將細胞內(nèi)化療藥物轉(zhuǎn)運至細胞外，使細胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥[2]。本研究結(jié)果顯示，P- gp在食管癌患者中陽性表達率為57.1%，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達率(68.5%)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(51.8%)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明食管鱗癌能激活P-gp的表達，對其檢測不僅可判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，而且還能預(yù)測化療效果及預(yù)后情況。

表1 食管鱗癌p63、P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

Tab 1 The relation between the expression of p63， P- gp， GST- π， Topo- Ⅱ and clinical pathological features in esophageal squamous cell carcinoma

臨床病理特征np63陽性/例陽性率/%P值P-gp陽性/例陽性率/%P值GST-π陽性/例陽性率/%P值Topo-Ⅱ陽性/例陽性率/%P值分化程度 高、中分化14411277.8 低分化2424100>0.05a8055.61666.7>0.0510774.31354.2<0.0511378.51979.2>0.05TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期13610677.9 Ⅲ、Ⅳ期323093.8<0.057655.92062.5>0.059072.62681.2>0.0511080.92268.8>0.05浸潤深度 未達外膜1249576.6 浸潤外膜444193.2<0.056854.82863.6>0.0510774.33068.2>0.0510080.63272.7>0.05淋巴結(jié) 陽性545092.6 陰性1148675.4<0.053768.55951.8<0.054481.57666.7<0.053666.79684.2<0.05

a Fisher確切概率

表2 食管鱗癌患者p63與P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ蛋白表達的相關(guān)性 例

Tab 2 The relationship between expression of p63 and P- gp， GST- π， Topo- Ⅱ in esophageal squamous cell carcinoma cases

表3 食管鱗癌患者P- gp與GST- π、Topo- Ⅱ表達的相關(guān)性 例

Tab 3 The relationship between expression of P- gp and GST- π，Topo- Ⅱ in esophageal squamous cell carcinoma cases

GST- π具有一定的轉(zhuǎn)運和解毒生理功能，通過催化谷胱甘肽(GSH)與親電子物質(zhì)相結(jié)合，并與親脂性細胞毒藥物結(jié)合增加其水溶性，使藥物代謝速度明顯加快而產(chǎn)生耐藥[3]。GST- π的表達主要與順鉑、阿霉素類、氮芥、環(huán)磷酰胺等藥物耐藥相關(guān)。本研究中食管鱗癌組織GST- π陽性表達率為71.4%，提示多數(shù)食管癌患者為原發(fā)性耐藥；低分化鱗癌患者(54.2%)明顯低于中、高分化鱗癌患者(74.3%)，表明低分化鱗癌患者對化療較為敏感，與唐郡等[4]研究結(jié)果一致，也與臨床現(xiàn)象相符；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(81.5%)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(66.7%)，且P- gp與GST- π的表達呈正相關(guān)關(guān)系，這與其他報道[5]相一致，表明P- gp和GST- π之間對MDR有協(xié)同作用，同時也是判斷食管癌惡性程度和侵襲性較為客觀的指標。

Topo- Ⅱ是重要的核酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等生理功能及調(diào)節(jié)DNA空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)[6]。柔紅霉素、阿霉素、依托泊苷等抗癌藥物主要通過對Topo- Ⅱ活性的抑制發(fā)揮作用，Topo- Ⅱ是腫瘤化療重要的靶酶，高表達則對抗癌藥物敏感，低表達則導(dǎo)致Topo- Ⅱ抑制劑細胞毒作用降低，從而引起MDR。本研究中的Topo- Ⅱ蛋白表達陽性率為78.6%，提示臨床上食管癌較少出現(xiàn)Topo- Ⅱ介導(dǎo)的原發(fā)性耐藥，可選擇上述蒽環(huán)類、依托泊苷等抗癌藥物進行治療，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(66.7%)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(84.2%)(P<0.05)，且P- gp與Topo- Ⅱ的表達呈負相關(guān)關(guān)系，因此，可以認為食管鱗癌患者特別是有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，對化療不敏感可能與P- gp高表達和Topo- Ⅱ低表達有關(guān)。

p63是p53基因家族的一員，與p53基因具有高度同源性。Yang等[7]發(fā)現(xiàn)了p63在人類染色體第3q27- 29，包括TAp63和△Np63兩個亞型。TAp63亞型含有類似p53的N端反式轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，能反式激活或抑制p53相關(guān)靶基因，阻滯細胞周期并誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。有研究[9]表明，抑制TAp63的功能有助于化療耐藥?！鱊p63亞型因缺乏此區(qū)域不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，以顯性失活的方式抑制p53或TAp63的活性，起到抗凋亡的作用，同時發(fā)揮間接耐藥作用。由此，推測p63的表達情況能夠預(yù)測食管鱗癌對藥物敏感性和耐藥性。本實驗結(jié)果顯示，p63蛋白的表達與食管癌TNM臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ期者p63蛋白陽性表達率(93.8%)高于Ⅰ、Ⅱ期者(77.9%)，侵犯至外膜者p63陽性表達率(93.2%)高于未侵犯外膜者(76.6%)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者p63陽性表達率(92.6%)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(75.4%)。且p63蛋白與P- gp、GST- π蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.193、0.197，P<0.05)，與Topo- Ⅱ的表達無相關(guān)性(r=-0.106，P>0.05)。表明p63不僅參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，而且與P- gp、GST- π密切相關(guān)?？梢娊閷?dǎo)食管鱗癌耐藥的并非為獨立基因，而是相互聯(lián)系的，p63與MDR基因聯(lián)合作用可能是臨床上食管鱗癌患者出現(xiàn)MDR的主要原因。

綜上所述，p63、P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ4種蛋白均能反映食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，p63還能反映食管鱗癌臨床分期和浸潤深度，GST- π則與分化程度有一定關(guān)系，而且食管鱗癌的耐藥與上述4種蛋白均有一定關(guān)系，聯(lián)合檢測它們的表達情況不僅有利于判斷食管鱗癌生物學(xué)行為及預(yù)后，而且有利于判斷食管鱗癌耐藥情況及指導(dǎo)臨床化療方案的選擇。

[1] JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61(2):69- 90．

[2] 杜惠惠，任強，劉曉民，等.P- 糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥機制及其逆轉(zhuǎn)策略[J].中華肺部疾病雜志:電子版，2013，6(6):551- 553．

[3] GRASSILLI E，NARLOCH R，F(xiàn)EDERZONI E，et al.Inhibition of GSK3 B by- pass drug resistance of p53- null colonc carcinomas by enabling necroptosis in response to chemotherapy[J].Clin Cancer Res，2013，19(14):3820- 3831．

[4] 唐郡，閻曉初，彭貴勇，等.食管癌鱗狀細胞癌P- gp、GST- π、Topo- Ⅱ的表達及臨床意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，29(17):1692- 1695.

[5] 陳廣燦，洪良利，黃杰雄，等.廣東潮汕賁門癌組織中GST- π和P- gp的表達及其臨床病理意義[J].癌變·畸變·突變，2016，28(1)：36- 40．

[6] 俞鵬飛，徐琪，應(yīng)杰兒，等.ToPoⅡ、MRP、GST- π 在胃癌組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系[J].腫瘤學(xué)雜志，2011，17(4):249- 252．

[7] YANG A L，KAGHAD M，WANG Y，et al.p63，a p53 homolog at 3q27- 29，encodes multiple products with transactivating，death- inducing，and dominant- negative activities[J].Mol Cell，1998，2(3):305- 316．

[8] 張超，代紅艷，卿晉，等.p63基因的研究進展[J].皮膚病與性病，2012，34(3):142- 144．

[9] MELINO G.p63 is a suppressor of tumorigenesis and metastasis interacting with mutant P53[J].Cell Death Differ，2011，18(9):1487- 1499．

Expression of p63，P- gp，GST- π and Topo- Ⅱ in esophageal squamous cell carcinoma

YANG Yan1，2，DU Yun- xiang2，ZHANG Chuang2，WEI Shu- zhen2

(1.BengbuMedicalCollege，Bengbu233000，China; 2.No.82HospitalofPeople’sLiberationArmySubsidiaryofBengbuMedicalColllege，Huai’an223001，China)

Objective： To observe and compare the expression of p63， P- glycoprotein(P- gp)， glutathione S- transferase π(GST- π)and DNA topoisomerase Ⅱ(Topo- Ⅱ)in esophageal squamous cell carcinoma and discuss the relationships and clincal significance. Methods: The expression of p63， P- gp， GST- π and Topo- Ⅱ in 168 patients with esophageal squamous cell carcinoma were detected by immunohistochemistry， analyzing the relationship of clinicpathological characteristics and the meaning of co- expression. Results: The positive rate of p63， P- gp， GST- π and Topo- Ⅱin esophageal squamous cell carcinoma was 81.0%， 57.1%， 71.4% and 78.6%. p63 positive expression was significantly related to the patients’ esophageal clinical stage， invasion degree and lymph node metastasis(P<0.05). The expression of P- gp and Topo- Ⅱ were related to the lymph node metastasis(P<0.05). GST- π was related to the differentiation degree of esophageal cancer tissue and the lymph node metastasis(P<0.05). P- gp and GST- π separately had obviously positive correlation with p63(P<0.05). Positive correlation between the expreesion of P- gp and GST- π was observed(P<0.05)， but there was a negative correlation between the expreesion of P- gp and Topo- Ⅱ(P<0.05). Conclusion: p63， P- gp， GST- πand Topo- Ⅱmay probably involve in the tumorigenesis and progress in esophageal squamous cell carcinoma， also might be used in the selection of chemotherapy regimens and in the prognosis of esophageal cancer.

esophageal squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; p63; P- glycoprotein; Glutathione S- transferase; DNA topoisomerase Ⅱ

2016- 04- 12

2016- 07- 06

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新重點課題(12Z09)

楊艷(1990-)，女，安徽阜陽人，在讀碩士研究生。E- mail:yangyan1521212@163.com

韋淑貞 E- mail:weiwei8222@163.com

楊艷，杜云翔，張闖，等.p63、P- gp、GST- π及Topo- Ⅱ在食管鱗癌組織中的表達[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：927- 931.

R735.1

A

1671- 6264(2016)06- 0927- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.020