唐志苗 倪一鳴

銀杏葉提取物與華法令協(xié)同抗凝影響的研究

唐志苗 倪一鳴

目的 通過觀察銀杏葉提取物注射液（Egb761）對抗凝家兔PLT、PT、APTT、血小板凝血功能的作用，探討Egb761對華法令抗凝的影響。方法 48只家兔隨機分成兩大組，第1大組服華法令抗凝，使PT達到正常值的1.5～2.5倍（國際標準化比值為1.8～3.7），第2大組服華法令抗凝使PT達到正常值的2.5～3.5倍（國際標準化比值為3.7～6.0），每大組又分成對照組（耳緣靜脈注射0.9%氯化鈉注射液0.3ml/kg），小劑量組（耳緣靜脈注射銀杏葉提取物注射液0.3ml/kg），中劑量組（耳緣靜脈注射銀杏葉提取物注射液1.5ml/kg）和大劑量組（耳緣靜脈注射銀杏葉提取物注射液3.0ml/kg），每組6只（雌雄對半），連續(xù)給藥7d，于給藥的第7天靜脈注射金納多，1.5h后自耳緣動脈采血5ml,進行PLT、PT、APTT、血小板3因子有效性（PF3aT）等檢測。結(jié)果 Egb761對抗凝家兔的PT、APTT、PLT均無影響（均P＞0.05），但影響血小板3因子（PF3），使PF3aT的第3管較第4管延長（P＜0.05），且長INR實驗組的影響明顯大于短INR組。結(jié)論 Egb761通過影響血小板活化，進而影響PF3，使機體凝血功能缺陷，并與華法令產(chǎn)生協(xié)同作用,使機體凝血功能缺陷更明顯，結(jié)果使機體處于易出血狀態(tài)，從而影響華法令抗凝治療。

銀杏葉提取物注射液 家兔 華法令 抗凝治療

銀杏葉提取物（Egb761）在臨床上已廣泛應(yīng)用，但有報道Egb761本身或與華法令聯(lián)用有增加出血的危險[1]。本課題組前期研究表明：Egb761通過影響血小板第3因子（PF3），使機體凝血功能缺陷（處于易出血狀態(tài)），對凝血功能產(chǎn)生影響，從而可能影響華法令抗凝治療。筆者觀察銀杏葉與華法令合用是否會對其抗凝產(chǎn)生協(xié)同作用。

1 資料和方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔，雌雄各半，體重1.9～2.1（2.16±0.13）kg，購于金華市藥檢所，合格證號：SYCXK（浙）2006-0024。

1.2 藥品和儀器 銀杏葉提取物注射液（金納多）為5ml/支，含銀杏葉提取物17.5mg，其中含銀杏黃酮4.2mg，德國威碼舒培博士藥廠生產(chǎn)；華法令鈉片：3.0mg/片，芬蘭Orion Corporation公司提供。PT、APTT試劑（意大利IL公司生產(chǎn)）；40g/L白陶土懸液（以9g/L氯化鈉溶液作為溶劑），0.025mol/L氯化鈣溶液。XE-2100全自動血液分析儀（日本SYSMEX公司生產(chǎn)）及原裝配套試劑；廣州陽普醫(yī)療用品有限公司提供的血凝試管（109mmol/L檸檬酸鈉1∶9）；AL-9000全自動血凝分析儀（Instrumentation Laboratory）意大利IL公司生產(chǎn)；水浴恒溫箱；秒表；分析天平。

1.3 方法

1.3.1 兔的飼養(yǎng) 整個實驗過程，兔由專業(yè)飼養(yǎng)人員同一批全價營養(yǎng)顆粒飼料進行喂養(yǎng)，并保持飼養(yǎng)及實驗場所溫度17～25℃，相對濕度40%～70%?？鼓Ｐ偷慕ⅲ簩π杩鼓牡?、2組兔子，根據(jù)人類換瓣術(shù)后抗凝的華法令劑量折算后按體重灌服，并每日監(jiān)測國際標準化比值（INR），使INR相對穩(wěn)定，并達到正常值的1.8～3.7（第1組）或3.7～6.0（第2組）。

1.3.2 實驗分組和干預(yù)措施 新西蘭大白兔48只，實驗分兩組段進行。每組24只，隨機又分為4小組，分別為對照組及大、中、小劑量組，每小組各6只，雌雄各半。第1組喂服華法令抗凝，使INR達到正常值的1.8～3.7，第2組服華法令抗凝使INR達到正常值的3.7～6.0。分別為各組動物先耳緣靜脈注射給藥。Egb761小、中、大劑量組分別注射銀杏葉提取物注射液（0.3、1.5、3.0ml/ kg，約相當于人的劑量的1、5、10倍）[2]；對照組注射0.9%氯化鈉注射液（0.3ml/kg），連續(xù)給藥7d，于給藥第7天靜脈注射銀杏葉提取物注射液后1.5h自耳緣動脈采血5ml，進行PLT、PT、APTT、血小板第3因子有效性試驗（PF3aT）等檢測。

1.3.3 標本處理和檢測 用真空采集法從兔耳緣動脈直接采血至專用血凝試管和血常規(guī)試管各1份。PT、APTT按操作規(guī)程在AL-9000全自動血凝分析儀上檢測。PLT按操作規(guī)程在XE-2100全自動血液分析儀上檢測。PF3aT測定嚴格按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行[3]。（1）富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP）的制備。自清醒新西蘭大白兔耳緣動脈真空取血，以109mmol/L檸檬酸鈉1∶9抗凝收集于血凝試管中的血，于室溫經(jīng)1 800r/min離心10min，所得血漿即為PRP；剩余血液再以4 000r/min離心10min，上層液即為PPP，作為測定時調(diào)零或用于調(diào)整PRP中的血小板數(shù)及實驗過程中，PRP中的血小板數(shù)調(diào)整至約500×109/L。（2）PF3aT測定注意事項。真空采血順利并立即分離血漿；PRP中血小板調(diào)至（540±20）×109/L，PPP中血小板調(diào)至（10～20）×109/L，避免紅細胞混入；標本測定前所用的器材均為凝血專用器材，測定時的試管用潔凈玻璃試管；40g/L白陶土懸液使用前充分混勻，白陶土加入標本后，標本在孵育期也混勻數(shù)次；每1組測定2次，取平均值。（3）PF3aT測定步驟。取4支小試管分4組，按表1每管加入PRP和PPP各0.1ml。將上述4支試管置37℃水浴預(yù)溫2min后從第1管起依次每隔2min加0.2ml白陶土懸液。記錄加入白陶土的時間，20min后一次加入0.2ml濃度為0.025mmol/L的氯化鈣溶液，同時啟動秒表測定凝固時間。（4）PF3aT測定結(jié)果判斷。第3管、第4管分別為待測者和正常對照管,第1管較第2管凝固時間延長5s以上為異常，見于PF3a減低；PF3a有缺陷或內(nèi)源凝血因子有缺陷時第3管凝固時間比第4管長。

表1 PF3aT測定（ml）

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 抗凝家兔（INR為1.8）靜脈注射Egb761后PT、APTT、PLT變化比較 見表2。

表2 抗凝家兔（INR為1.8）靜脈注射Egb761后PT、APTT、PLT變化比較

由表2可見，抗凝家兔（INR為1.8）靜脈注射Egb761后各組間PT、APTT、PLT變化比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 抗凝家兔（INR為1.8）靜脈注射Egb761后PF3aT值變化比較 見表3。

由表3可見小、中、大劑量組靜脈注射Egb761后PF3aT值第1管凝固時間均大于第2管（均P＜0.05），第4管凝固時間均少于第3管（均P＜0.01）。但不同劑量間組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 抗凝家兔（INR為1.8）靜脈注射Egb761后PF3aT值不同管間差值比較 見表4。

表3 抗凝家兔（INR為1.8）靜脈注射Egb761后PF3aT值變化比較

表4 抗凝家兔（INR為1.8）靜脈注射Egb761后PF3aT值不同管間差值比較

由表4可見，兩組間第3管與第4管差值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），第1管與第2管差值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 抗凝家兔（INR為3.7）靜脈注射Egb761后PT、APTT、PLT變化比較 見表5。

表5 抗凝家兔（INR為3.7）靜脈注射Egb761后PT、APTT、PLT變化比較

由表5可見，抗凝家兔（INR為3.7）靜脈注射Egb761后PT、APTT、PLT變化組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.5 抗凝家兔（INR為3.7）靜脈注射Egb761后PF3aT值變化比較 見表6。

表6 抗凝家兔（INR為3.7）靜脈注射Egb761后PF3aT值變化比較

由表6可見，小、中、大劑量組第3管凝固時間均比第4管延長（均P＜0.05）；第1管凝固時間均比第2管延長（均P＜0.01）。但不同劑量組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.6 抗凝家兔（INR為3.7）靜脈注射Egb761后PF3aT的值不同管間差值比較 見表7。

表7 抗凝家兔（INR為3.7）靜脈注射Egb761后PF3aT的值不同管間差值比較

由表7可見，兩組間第3管與第4管差值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；組第1管與第2管差值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

銀杏葉提取物，即Egb761已廣泛應(yīng)用于臨床。而今華法令作為抗凝藥也是廣泛應(yīng)用于心血管病患者。人工瓣膜置換術(shù)、血管移植術(shù)后患者為防治血栓形成常規(guī)應(yīng)用華法令，此外也經(jīng)常應(yīng)用于心房顫動患者，因華法令對心房顫動患者缺血性中風(fēng)有預(yù)防作用，它可使心房顫動患者每年發(fā)生缺血性中風(fēng)的危險性下降60%[4]。但近年來不斷有銀杏葉提取物引起出血的報道[5]，并建議患有心臟病、腦梗死、各種血栓癥并且在服用華法令等抗血小板藥的時候，應(yīng)盡量避免同時使用銀杏葉提取物[6]。本課題組前期研究已表明[7]：大、中、小劑量組Egb761對PLT、PT、APTT均無影響。但Egb761對PF3aT有影響（第3管值大于第4管，即正常值），但不同劑量Egb761對PF3aT影響無差異，提示Egb761能使機體處于凝血功能缺陷狀態(tài)，有增加出血傾向的危險，從而影響華法令的抗凝治療，但Egb761與華法令聯(lián)用是否會對其抗凝產(chǎn)生協(xié)同作用，有待進一步研究。因此，筆者采用動物實驗的方法觀察Egb761與華法令協(xié)同對抗凝的影響。

本研究結(jié)果表明Egb761對華法令抗凝治療的家兔PF3aT有影響（增強華法令的抗凝作用）：INR為1.8及3.7時，大、中、小劑量組Egb761均對喂服華法令抗凝家兔的PLT、PT、APTT無影響,但Egb761對PF3aT有影響（第3管值大于第4管，即正常值），且隨INR值增大，對PF3aT影響更明顯（第3管值與正常值的差值更大），提示機體凝血功能缺陷更明顯。

華法令作用機制為在肝細胞上與維生素K競爭結(jié)合部位，抑制維生素K依賴因子羥基化，使這些凝血因子（Ⅱ、Ⅹ等）不能與磷脂表面結(jié)合，參與凝血過程的作用，結(jié)果使INR值增大。Egb761與華法令共同應(yīng)用時，一方面Egb761可通過影響血小板功能活化而使PF3減少，進而使為凝血提供催化所需磷脂表面的有效面積減少，吸附并激活的凝血因子（Ⅱ、Ⅹ等）的能力相應(yīng)減??；另一方面華法令通過抑制維生素K依賴因子羥基化，使能夠與磷脂表面結(jié)合的凝血因子Ⅱ、Ⅹ等數(shù)量減少，從而使兩者發(fā)生相互協(xié)同作用，結(jié)果使機體血液凝固進一步減慢，導(dǎo)致凝血功能缺陷更明顯，機體處于更易出血狀態(tài)。而且INR值增大，能與磷脂表面結(jié)合的凝血因子Ⅱ、Ⅹ等數(shù)量越少，故對PF3aT影響更明顯（第3管值與正常值的差值更大），提示機體凝血功能缺陷更明顯。

另外，Egb761與華法令均有抗血小板凝聚功能[8]，這也使比兩者單獨使用可能更容易出血。

以上實驗表明：Egb761通過影響PF3（使機體凝血功能缺陷）和血小板聚集功能，與華法令產(chǎn)生協(xié)同作用，使機體處于易出血狀態(tài)，從而影響華法令抗凝治療。

本組實驗中未發(fā)現(xiàn)所實驗家兔明顯出血，可能是實驗過程還不夠長，或者銀杏葉引起的出血概率相對不大，不能從這組動物中體現(xiàn)出來。但出血并發(fā)癥對抗凝患者是嚴重的安全問題，故華法令抗凝患者應(yīng)注意這個問題，以免出現(xiàn)出血并發(fā)癥。

[1]王玉慧,羅朝莉,白楊.銀杏葉提取物不良反應(yīng)[J].藥物不良反應(yīng)雜志, 2001,3(3):184-186

[2]章元沛.藥理學(xué)實驗[M].2版,北京:人民衛(wèi)生出版社.1996:238.

[3]陸永綏,張偉民.臨床檢驗管理與技術(shù)規(guī)程[M].杭州:浙江大學(xué)出版社. 2004:125.

[4]Abdelhafiz AH.Areview ofanticoagulation with warfarin in pations with nonvalvular atrialfibrillation[J].Clin Ther,2001,23(10):1628-1636.

[5]Benjamin J,Muir T,Brigus K,et al.A case of cerebral haemorrhage-can Ginkgo biloba be implicated[J]?Postgrad Med J, 2001,77:112-113.

[6]日本專家指出抗血小板藥不宜與銀杏葉萃取物并用[J].中成藥,2005, 27(6):718.

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[8]蔡巍,沈軍蘭.金納多對2型糖尿病患者血液流變性和可溶性黏附分子的影響[J].中國微循環(huán),2003,7(2):106-107.

Effect of ginkgo bibola leaves extract on coagulation status in rabbits with anticoagulant

TANG Zhimiao,NI Yiming.Department of Thoracic Surgery,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the effect ofextract ofginkgo bibola leaves(Egb)on coagulation status in rabbits with anticoagulant. Methods Forty eight rabbits were divided randomly into two groups(n=24 in each group).Warfarin was given in group 1 to achieve 1.8～3.7 times INR of normal rabbits;and given in group 2 to achieve3.7～6.0 times INR.Each group was further divided into 4 subgroups with 6 animals in each,including three Egb groups and one control group.Intravenous infusion of 0.3ml/kg NS was given to the rabbits in control group,and 0.3ml/kg,1.5ml/kg,3ml/kg Egb761 were given to the rabbits in three Egb groups for 7 days,respectively.After 1.5 h of injection on d7,the blood samples were collected,and PLT,PT,APTT,PF3aT were examined.Results Egb761 had no effect on PLT,PT,APTTofanticoagulant rabbits(P＞0.05);while it affected PF3aT levels (P＜0.05),the effect was more marked in group 1 than that in group 2.Conclusion Injection of ginkgo bibola leaves extracts may affect anticoagulation therapy ofwarfarin in rabbits.

Injection ofginkgo bibola leaves extractRabbitWarfarin Anticoagulation therapy

2015-12-21）

（本文編輯：田云鵬）

321000 金華市中心醫(yī)院心胸外科（唐志苗）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心胸外科（倪一鳴）

唐志苗，E-mail：tangzhimiao@163.com