張 懿， 朱德生， 王 艷

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辣椒素預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的代謝組學(xué)研究

張 懿， 朱德生， 王 艷

目的 研究辣椒素預(yù)處理對大鼠局部腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 采用大腦中動(dòng)脈栓塞方法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，選用SD大鼠24只，適應(yīng)1 w后隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(Sham)，模型組(Mod)以及辣椒素預(yù)處理組(CAP，0.2 mg/kg)，每組8只，采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)方法分析各組大鼠腦組織皮質(zhì)樣本，運(yùn)用主成分分析(PCA) ，偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)，正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，進(jìn)行差異化合物篩選和鑒定。結(jié)果 OPLS-DA得分圖能夠較明顯的區(qū)分各組樣本。根據(jù)變量重要性投影值(VIP)和載荷圖，并結(jié)合t檢驗(yàn)的P值(P<0.05)來篩選差異表達(dá)代謝物。與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠的皮質(zhì)代謝譜明顯不同，興奮性氨基酸谷氨酸(P<0.05)、肌醇(P<0.01)等代謝物出現(xiàn)顯著增高；花生四烯酸(P<0.01)、異亮氨酸(P<0.001)、甲硫氨酸(P<0.001)、L-半胱氨酸(P<0.001)、天冬氨酸(P<0.05)、苯丙氨酸(P<0.05)等氨基酸、1-磷酸-葡萄糖(P<0.05)、6-磷酸-葡萄糖(P<0.01)等糖代謝物出現(xiàn)顯著降低。與模型組大鼠相比，辣椒素預(yù)處理組異亮氨酸、甲硫氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸恢復(fù)正常水平，3、5-二羥苯甘氨酸(P<0.001)等代謝物顯著增高。結(jié)論 代謝組學(xué)表明，發(fā)生腦缺血再灌注損傷時(shí)，皮質(zhì)內(nèi)能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)紊亂，辣椒素預(yù)處理可能通過改善對缺血腦組織的能量代謝障礙，緩解興奮性谷氨酸的釋放量，改善生物膜的功能對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)能較為全面地反映生物體在藥物干預(yù)作用下的代謝狀態(tài)變化，并能通過代謝物含量的差異推斷藥物的作用機(jī)制，為研究腦缺血損傷機(jī)制和治療腦缺血藥物提供了新的思路。

TRPV1； 辣椒素； 腦缺血再灌注損傷； 代謝組學(xué)

腦缺血再灌注損傷(Cerebral Ischemia Reperfusion Injury) 是指腦缺血至腦組織壞死前，閉塞的腦血管再通后缺血性腦損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1]。腦缺血再灌注損傷涉及極其復(fù)雜的病理生理過程，主要包括興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙、氧自由基增多、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡基因激活、炎癥反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)[2～5]。如何防止缺血再灌注損傷，尋找有效的治療藥物及措施，促進(jìn)腦卒中后中樞神經(jīng)功能的恢復(fù)一直是腦血管病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

瞬時(shí)感受器電位香草酸受體-1(Transient Receptor Potential Vanilloid-1，TRPV1)是配體門控非選擇性陽離子通道，能夠被各種外因性及內(nèi)因性的物理及化學(xué)刺激所激活，如：熱刺激(>43 ℃)、酸性環(huán)境(pH<5.9)、內(nèi)源性大麻素花生四烯酸乙醇胺、炎癥因子、激動(dòng)劑辣椒素(Capsaicin)等[6]。辣椒素是一種營養(yǎng)因子，是辣椒的主要成分，負(fù)責(zé)辣椒的刺激性成分。作為TRPV1高選擇性激動(dòng)劑，辣椒素激活TRPV1并且在疼痛信息的傳遞整合[6]、改善血管功能預(yù)防心血管疾病[7]、自身免疫性疾病的調(diào)制[8]、抑郁癥等精神疾病的行為調(diào)節(jié)[9]等方面發(fā)揮重要作用，揭示了辣椒素可能作為治療疾病的靶標(biāo)。

代謝組學(xué)(Metabonomics)是分析比較組織中和體液中的內(nèi)源性代謝物、代謝產(chǎn)物的代謝譜的變化，獲得生理情況或病理狀況下的整體代謝狀況，有助于揭示尋找與疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物[10]。近年來，代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用于心臟疾病[11]、糖尿病[12]、腫瘤[13]等疾病研究，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域，也進(jìn)行了涉及肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)[14]、亨廷頓綜合征等運(yùn)動(dòng)神經(jīng)退行性疾病[15]以及多發(fā)性硬化(MS)等神經(jīng)免疫性疾病的代謝組學(xué)研究[16]，通過葡萄糖、氨基酸和脂質(zhì)代謝以及神經(jīng)遞質(zhì)、核苷酸的變化，免疫反應(yīng)和抗炎反應(yīng)，獲得代謝譜用于疾病診斷、治療以及機(jī)制研究。目前已有研究表明，辣椒素預(yù)處理對缺氧新生大鼠的腦損傷具有血管保護(hù)作用，但具體作用機(jī)制尚不清楚[17]。同時(shí)藥物預(yù)處理不會(huì)造成短暫的缺血損傷，對缺血預(yù)適應(yīng)構(gòu)成一定的保護(hù)作用[18]。因此本研究擬采用大腦中動(dòng)脈栓塞建立腦缺血再灌注損傷模型，建模前3 h進(jìn)行辣椒素腹腔注射預(yù)處理，利用代謝組學(xué)的方法探討辣椒素預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)及作用機(jī)制，為研究腦缺血損傷機(jī)制和治療腦缺血藥物尋找新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試劑 TRPV1激動(dòng)劑Capsaicin(CAS#：12084-10MG-F，Sigma，美國)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC(Sigma，美國)，L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司，中國)，衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺BSTFA(REGIS Technologies，美國)，多聚甲醛、水合氯醛、氯化鈉、甲醇、氯仿等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海)。

1.2 儀器 手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器有限責(zé)任公司，中國)，顯微手術(shù)器械套裝(無錫醫(yī)用器材廠)、Milli-Q去離子水制備儀(Millipore，美國)，超低溫冰箱(海爾醫(yī)療設(shè)備，中國)，MCAO栓線(北京沙東生物技術(shù)有限公司，中國)，研磨儀(JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司，中國)，氣相色譜儀(Agilent 7890A，Agilent，美國)，高通量飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Chroma TOF Pegasus HT，LECO，美國)，Restek Rxi-5Sil MS毛細(xì)管柱(J&W Scientific，F(xiàn)olsom，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠48只，SPF級(jí)，體重180～220 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2012-0002。室溫25 ℃，自由攝水飲食，本研究的所有程序遵守實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用指南。

24只SD雄性成年大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham，n=8)，模型組(Mod，n=8)、辣椒素預(yù)處理組(CAP，n=8)。辣椒素預(yù)處理參照前人的研究，將辣椒素溶于1%DMSO中，缺血處理前3 h 以0.2 mg/kg的劑量腹腔注射[18]。缺血后24 h收集大腦組織樣本進(jìn)行TTC染色測量梗死面積和缺血組織(Mod Q 、Cap Q)及缺血對側(cè)組織(Mod D 、Cap D)做GC-MS代謝譜分析。

1.3.2 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO) 大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)方法是最廣泛使用的模擬缺血性腦卒中的理想模型。采用Longa等提出的大腦中動(dòng)脈閉塞的制作方法并在稍作改進(jìn)后制作模型[19]。2%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(2%，0.2 ml /10 g b.w.)，麻醉后大鼠仰臥位固定，常規(guī)碘消毒頸部皮膚，右側(cè)頸部皮膚切口分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和動(dòng)脈分支。采用頭端多聚賴氨酸包被處理的栓線(直徑0.18±0.02 mm)插入右頸內(nèi)動(dòng)脈(MCA)至大腦中動(dòng)脈近端以阻斷大腦中動(dòng)脈血流。90 min后輕輕拔出栓線恢復(fù)大腦中動(dòng)脈供血實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅進(jìn)行血管分離，不進(jìn)行栓線插入處理。手術(shù)過程環(huán)境溫度保持在(37±0.5)℃，直至動(dòng)物蘇醒送回動(dòng)物房飼養(yǎng)、觀察。

1.3.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 待大鼠術(shù)后完全清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[20]。神經(jīng)功能缺損評(píng)分系統(tǒng)采用5分制，0分表示無神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀；1分表示左前肢屈曲；2分表示左側(cè)肢體對抗力下降，左前肢屈曲；3分表示向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分表示不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分值越高，說明動(dòng)物神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。術(shù)后評(píng)分為1-3分示意為造模成功，納入模型組。

1.4 TTC染色 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色是測定缺血組織面積的常用方法。大鼠麻醉斷頭處死，迅速取出腦組織凍存于-20 ℃ 約20 min，由前向后每隔2.0 mm 作冠狀切片，將腦組織切成連續(xù)的2.0 mm冠狀切片，然后浸入2%的TTC的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)，37 ℃ 避光水浴30 min，染色后4%多聚甲醛固定24 h，最后將每組腦片排列整齊，數(shù)碼相機(jī)拍照，通過圖像分析軟件(Image-pro Plus 6.0)對梗死面積進(jìn)行分析。

1.5 氣相-質(zhì)譜GC-MS

1.5.1 代謝物提取 代謝物的提取過程參照前人對樣品預(yù)處理的方法[21]。取50 mg大鼠腦組織樣品于2 ml離心管中，加入0.4 ml甲醇-氯仿(3∶1，v/v)混合溶液，再加入30 μl /L2氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)，漩渦混勻，加入鋼珠，55 Hz 5 min研磨處理；然后12000 r/min 低溫離心5 min，小心取出約0.4 ml 上清于2 ml進(jìn)樣瓶中，每個(gè)樣本取約13 μl 于新的2 ml進(jìn)樣瓶中，混勻作為質(zhì)控樣本。

1.5.2 代謝物衍生化 真空濃縮器中干燥提取物約1.5 h后，加入80 μl 甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/ml)，輕輕混勻后，放入烘箱中37 ℃孵育2 h。

向每個(gè)樣品中迅速加入100 μl 衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺BSTFA(含有1% TCMS，v/v)70 ℃孵育1 h，冷卻至室溫后，混合樣品中加入10 μl 飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液FAMEs(溶于氯仿C8-C16：1 mg/ml；C18-C30：0.5 mg/ml)，混勻后以供GC-MS檢測。

1.5.3 氣相-質(zhì)譜條件 氣相色譜儀安捷倫Agilent 7890A聯(lián)用高通量飛行時(shí)間質(zhì)譜儀配Restek Rxi-5Sil MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。

色譜條件：進(jìn)樣量，1 μl，不分流模式；載氣，氦氣；前進(jìn)樣口吹掃流速，3 ml/min；柱流速：1 ml/min；柱溫，37 ℃保持1 min，以10 ℃每分鐘的速率上升至300 ℃，保持10 min；前進(jìn)樣口溫度280 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度，220 ℃；電離電壓，-70 eV；掃描方式，85～600 m/z；掃描速率，20 spectra/s；溶劑延遲，366 s。

1.6 數(shù)據(jù)處理和模式識(shí)別 將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)包括樣品名稱、峰值、歸一化的峰面積等信息導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 軟件(Umetrics，Umea，瑞典)進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，分析結(jié)果用得分圖(Score Plot)和載荷圖(Loading Plot)表示。得分圖可以給出樣本在空間上的位置，載荷圖給出兩類間的代謝物變化。

PCA用來顯示原始數(shù)據(jù)樣品的總體分布。PLS-DA用來獲得數(shù)據(jù)(X變量)和其它變量(Y變量，分組信息)之間的相關(guān)關(guān)系，使用UV格式化處理的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，對第一，二主成分進(jìn)行建模分析。對模型的質(zhì)量用7折交叉驗(yàn)證進(jìn)行檢驗(yàn)，并用交叉驗(yàn)證后得到的分類參數(shù)R2X 和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預(yù)測度)對模型有效性進(jìn)行評(píng)判。此后，通過排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次(n=200)改變分類變量Y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2值對模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。對PLS-DA模型進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異，變量遠(yuǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明差異貢獻(xiàn)越大。我們采用第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(VIP>1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)(t-test)的P值(P<0.05)來篩選差異性表達(dá)代謝物，評(píng)價(jià)辣椒素預(yù)處理的干預(yù)作用。

2 結(jié) 果

2.1 辣椒素預(yù)處理后腦梗死面積減少 TRPV1激動(dòng)劑辣椒素缺血處理前3 h以0.2 mg/kg的劑量腹腔注射，由腦片TTC染色圖可以看出(見圖1)，辣椒素預(yù)處理可以明顯降低腦梗死面積(81.88%減少至51.81%)(*P<0.05，#P<0.05)。辣椒素術(shù)后處理對梗死面積沒有明顯影響，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[17](結(jié)果未展示)。

2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 神經(jīng)功能缺損評(píng)分系統(tǒng)采用五分制。待大鼠術(shù)后完全清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分結(jié)果表明術(shù)后模型組和辣椒素處理組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，兩組的功能缺損評(píng)分均高于假手術(shù)組(*P<0.05)。無論是術(shù)后還是術(shù)后1 h，辣椒素預(yù)處理組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均有所下降，術(shù)后模型組評(píng)分為(3.31±0.48 )與辣椒素預(yù)處理組 (3.19±0.40)、術(shù)后1 h模型組(2.69±0.60) 與辣椒素預(yù)處理組(1.81±0.40)(#P<0.05)，說明辣椒素預(yù)處理對大鼠神經(jīng)功能損傷有一定的改善(見圖2)。

2.3 氣相-質(zhì)譜的穩(wěn)定性 各組大鼠腦組織樣本連續(xù)注射到氣相-質(zhì)譜儀中，通過統(tǒng)計(jì)內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間(Retention Time，RT)檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性，由表1可以看出，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)差為：0.00594，說明系統(tǒng)十分穩(wěn)定，可保證后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需要。

2.4 大鼠腦組織的代謝譜將假手術(shù)組、模型組以及辣椒素預(yù)處理組3組大鼠腦組織樣本進(jìn)行衍生化后進(jìn)樣分析，得到GC-MS總離子流圖(見圖3)，基于NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，共526個(gè)峰被鑒定為內(nèi)源性代謝物，主要為氨基酸、有機(jī)酸、糖類、脂肪酸等物質(zhì)，這些代謝物參與多種生化過程，特別是在糖代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等過程。

2.5 辣椒素預(yù)處理對大鼠腦組織的代謝譜的影響 為了對下游數(shù)據(jù)進(jìn)行更好的分析，我們對氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪過濾和間距范圍內(nèi)標(biāo)歸一化方法標(biāo)準(zhǔn)化處理，對標(biāo)準(zhǔn)化處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別多變量分析，將樣品名稱、峰值、歸一化的峰面積等信息導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，分析結(jié)果用得分圖(Score Plot)和載荷圖(Loading Plot)表示。

2.5.1 PCA結(jié)果 主成分分析PCA用來顯示原始數(shù)據(jù)樣品的總體分布，由得分圖可以看出，無論是假手術(shù)組和模型組還是模型組和辣椒素預(yù)處理組，樣本點(diǎn)基本可以明顯區(qū)分，可通過后續(xù)的判別分析進(jìn)一步研究其差異(見圖4)。

2.5.2 PLS-DA結(jié)果 為了分離更高水平的分類變量，采用PLS-DA獲得數(shù)據(jù)(X變量)和其它變量(Y變量，分組信息)之間的相關(guān)關(guān)系，使用UV格式化處理的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，對第一，二主成分進(jìn)行建模分析。對模型的質(zhì)量用7折交叉驗(yàn)證進(jìn)行檢驗(yàn)，并用交叉驗(yàn)證后得到的分類參數(shù)R2X 和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預(yù)測度)對模型有效性進(jìn)行評(píng)判。此后，通過排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次(n=200)改變分類變量Y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2值對模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。模型累積解釋率見表2。

由PLA-DA得分圖如圖5、圖6所示(橫坐標(biāo)為第1主成分得分，用t1表示；縱坐標(biāo)為第2主成分得分，用t2表示)，PLS-DA得分圖如圖3所示。R2X(即模型的可解釋變量，見圖5B、6B綠色圓點(diǎn))及R2Y(即監(jiān)督模型的解釋率，見圖5B、6B藍(lán)色矩形)接近1說明PLS-DA模型已經(jīng)可以很好地解釋假手術(shù)組與模型組、模型組與辣椒素預(yù)處理組兩組樣本之間的差異(見圖5A、圖6A)。

2.5.3 OPLS-DA結(jié)果 對PLS-DA模型進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異，變量遠(yuǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明差異貢獻(xiàn)越大。由圖7A可以看出，模型組偏離假手術(shù)組較遠(yuǎn)，表明腦缺血損傷嚴(yán)重；圖7B可以看出，辣椒素預(yù)處理組與假手術(shù)組逐漸接近，表明藥物干預(yù)后對代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)起一定的作用，表明缺血損傷開始恢復(fù)。

我們采用第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(VIP>1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)(t-test)的P值(P<0.05)來篩選差異性表達(dá)代謝物。各組大鼠腦組織樣本鑒定的內(nèi)源性代謝物(見表3)，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠的皮質(zhì)代謝譜明顯不同，興奮性氨基酸谷氨酸(P<0.05)、肌醇(P<0.01)等代謝物出現(xiàn)顯著增高；花生四烯酸(P<0.01)、異亮氨酸(P<0.001)、甲硫氨酸(P<0.001)、L-半胱氨酸(P<0.001)、天冬氨酸(P<0.05)、苯丙氨酸(P<0.05)等氨基酸、1-磷酸-葡萄糖(P<0.05)、6-磷酸-葡萄糖(P<0.01)等糖代謝物出現(xiàn)顯著降低。

與模型組大鼠相比，辣椒素預(yù)處理組大鼠的皮質(zhì)代謝譜明顯不同，異亮氨酸、蛋氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸恢復(fù)正常水平，2-丁酮酸(P<0.05)、3，5-二羥苯甘氨酸(P<0.001)、肌苷(P<0.01)等代謝物顯著增高。

表3 各組大鼠腦組織樣本鑒定的差異內(nèi)源性代謝物

圖1 辣椒素預(yù)處理對腦梗死體積的影響

圖2 辣椒素預(yù)處理對大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

圖3 各組樣品的GC-MS總離子流圖

圖4A 假手術(shù)組和模型組代謝物的主成分分析得分圖

圖4B 模型組和辣椒素預(yù)處理組代謝物的主成分分析得分圖

圖5A 假手術(shù)組與模型組的PLS-DA的得分圖

圖5B 假手術(shù)組與模型組的PLS-DA的置換檢驗(yàn)圖

圖6A 模型組與辣椒素預(yù)處理組的PLS-DA的得分圖

圖6B 模型組與辣椒素預(yù)處理組的PLS-DA的置換檢驗(yàn)圖

圖7A 假手術(shù)組與辣模型組的OPLS-DA的得分圖

圖7B 模型組與辣椒素預(yù)處理組的OPLS-DA的得分圖

3 討 論

腦缺血再灌注損傷涉及一系列復(fù)雜的病理生理過程，主要包括能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基增多、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡基因激活、炎癥反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)[2～5]，各個(gè)環(huán)節(jié)之間相互聯(lián)系、相互作用，構(gòu)成一個(gè)極為復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

3.1 能量代謝障礙 正常生理?xiàng)l件下，腦組織主要通過葡萄糖有氧氧化途徑，在細(xì)胞線粒體中產(chǎn)生ATP供能[22]。而腦缺血再灌注時(shí)ATP合成減少說明腦組織能量代謝障礙，分析原因可能是：(1)腦缺血導(dǎo)致攜帶至腦組織的氧氣和葡萄糖相應(yīng)減少，腦組織細(xì)胞缺氧，有氧代謝障礙，腦組織為了獲得能量，通過葡萄糖無氧酵解途徑生成ATP為大腦供能，導(dǎo)致合成ATP減少[23]。(2)ATP的前身物質(zhì)減少：我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見表3)，模型組與對照組相比，包括肌苷(P<0.01)、次黃嘌呤(P<0.05)等ATP的前身物質(zhì)減少，可能因?yàn)樵谠俟嘧r(shí)前身物質(zhì)被血流沖洗出去，導(dǎo)致總腺苷酸水平降低。而辣椒素預(yù)處理后，肌苷、次黃嘌呤水平恢復(fù)正常水平，有文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充外源性肌苷對缺血性腦組織起保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[24]，因此，再灌注后不僅腦組織恢復(fù)供血供氧，ATP合成逐漸恢復(fù)正常，辣椒素術(shù)前3 h預(yù)處理通過促進(jìn)肌苷、次黃嘌呤等ATP合成前體物質(zhì)表達(dá)水平恢復(fù)進(jìn)而促進(jìn)ATP的合成以保證對腦組織的供能。

3.2 谷氨酸的神經(jīng)毒性作用 谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最高、分布最廣、作用最強(qiáng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，正常情況下主要存在于神經(jīng)末梢的突觸囊泡內(nèi)，末梢去極化時(shí)釋放到突觸間隙，作用于突觸后膜的特異性受體，完成興奮性突觸傳遞及其它生理作用。腦缺血后，突觸間隙谷氨酸釋放增加或再攝取障礙導(dǎo)致其在突觸間隙堆積，從而過度興奮谷氨酸受體導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[25]。由表3可以看出，模型組與對照組相比，谷氨酸的含量顯著增加(P<0.05)，代表大腦有一定程度的損傷。辣椒素預(yù)處理后，谷氨酸恢復(fù)到正常水平(P>0.05)，表明辣椒素預(yù)處理能夠緩解從腦中釋放谷氨酸的量，對腦缺血損傷有保護(hù)作用。

腦缺血后，兩類谷氨酸受體被谷氨酸激活：離子通道受體(ionotropic，iGluRs)和代謝型受體(metabotropic，mGluRs)兩類，離子通道受體包括：N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)、α-氨基-3 羥基-5 甲基-4 異惡唑受體(AMPAR)和海人藻酸受體(KAR)，后兩者稱為非NMDA受體。興奮性谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)毒性包括兩個(gè)明顯不同的過程：一是激活NMDA受體，直接或間接啟動(dòng)電壓敏感性通道，Ca2+大量內(nèi)流，造成遲發(fā)性的神經(jīng)元變性壞死；二是作用于非NMDA受體，引起Na+、CL-內(nèi)流，造成神經(jīng)元急性水腫為特征的急性損傷。代謝型受體包括mGluR1-8共8個(gè)亞型，I組受體(mGluR1、mGluR5)激活后通過膜內(nèi)G蛋白、磷脂酶C，引起三磷酸肌醇IP3和甘油二酯DAG的產(chǎn)生，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+的釋放。II組受體(mGluR2、mGluR3)和Ⅲ組受體(mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8)通過膜內(nèi)G蛋白、腺苷酸環(huán)化酶，抑制cAMP的生成[26]。

目前針對谷氨酸神經(jīng)毒性作用的神經(jīng)保護(hù)劑多種多樣，分別從抑制谷氨酸的合成、釋放、提高清除谷氨酸的能力、谷氨酸受體抑制劑(NMDAR抑制劑、AMPAR受體抑制劑、KA受體抑制劑)、mGluR的調(diào)節(jié)、Na+/H+離子交換泵抑制劑、Ca2+內(nèi)流抑制劑等角度減少谷氨酸的釋放或提高載體對谷氨酸的再攝取能力，起到缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[27]。越來越多的研究表明，代謝型受體mGluRs的調(diào)制在興奮性谷氨酸神經(jīng)毒性作用中發(fā)揮重要作用[28～32]，尤其是I組mGluR存在多個(gè)藥物作用的位點(diǎn)發(fā)揮作用。有趣的是，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒素預(yù)處理組與模型組相比，3，5-二羥苯甘氨酸(DHPG)的含量顯著提高(P<0.05)，DHPG作為代謝型谷氨酸受體mGluR1和mGluR5的選擇性激動(dòng)劑，已有文獻(xiàn)表明低劑量3，5-二羥苯甘氨酸預(yù)處理對大腦中動(dòng)脈缺血損傷提供神經(jīng)保護(hù)作用，作用機(jī)制可能是通過激活I(lǐng)組mGluR，激活磷脂酶C，引起IP3和DAG的產(chǎn)生，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+釋放至胞漿抑制NMDA受體的內(nèi)化從而提供神經(jīng)保護(hù)作用[33]。因此我們推測辣椒素預(yù)處理對腦缺血損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能是一方面緩解從腦中釋放興奮性谷氨酸的量，另一方面促進(jìn)低劑量3，5-二羥苯甘氨酸的表達(dá)共同作用提供神經(jīng)保護(hù)作用。

3.3 氧自由基的神經(jīng)毒性作用 腦缺血后，通過花生四烯酸代謝和黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)活化等多個(gè)途徑產(chǎn)生大量自由基進(jìn)而對細(xì)胞內(nèi)的蛋白、脂質(zhì)及核苷酸等成分產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷[34]。氧自由基的神經(jīng)毒性作用可概括為：(1)作用于多價(jià)不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化；(2)誘導(dǎo)DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物質(zhì)交聯(lián)，交聯(lián)后的大分子則失去原來的活性或功能降低[35]。由表3可以看出，模型組與對照組相比，多不飽和脂肪酸花生四烯酸的含量顯著降低(P<0.01)，由于腦缺血后產(chǎn)生的大量自由基攻擊富含不飽和脂肪酸的神經(jīng)膜與血管，生成脂質(zhì)過氧化物和氫過氧化物，不飽和脂肪酸的丟失使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性破壞，膜的通透性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、膜屏障功能均受到嚴(yán)重影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

3.4 激活腦內(nèi)成體神經(jīng)干細(xì)胞NSCs自我修復(fù)機(jī)制 在腦缺血時(shí)，腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞NSCs可以增殖、遷移至損傷部位并分化進(jìn)行修復(fù)。Nochi等人發(fā)現(xiàn)，腦缺血時(shí)，代謝型谷氨酸受體mGluR5信號(hào)通路可以參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程[36，37]。因此我們推測，辣椒素預(yù)處理后，激活的代謝型谷氨酸受體mGluR5不僅參與清除興奮性谷氨酸的清除作用，還可能通過參與內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖加強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的活化，對缺血再灌注腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上，在皮質(zhì)缺血側(cè)組織中檢測到的代謝物，肌苷、次黃嘌呤、谷氨酸、3、5-二羥苯甘氨酸、花生四烯酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、1-磷酸-葡萄糖、6-磷酸-葡萄糖為腦缺血再灌注損傷后皮質(zhì)組織中潛在的標(biāo)志性代謝物。通過辣椒素預(yù)處理可不同程度回調(diào)肌苷、次黃嘌呤、花生四烯酸、異亮氨酸、蛋氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、1-磷酸-葡萄糖、6-磷酸-葡萄糖水平。辣椒素預(yù)處理可能是通過改善對缺血腦組織的能量代謝障礙，緩解興奮性谷氨酸的釋放量，增強(qiáng)皮質(zhì)組織神經(jīng)元的活性、修復(fù)和改善生物膜的功能、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖對缺血再灌注腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)能較為全面地反映生物體在藥物干預(yù)作用下的代謝狀態(tài)變化，并能通過代謝物含量的差異推斷藥物的作用機(jī)制，為研究腦缺血損傷機(jī)制和治療腦缺血藥物尋找新的靶標(biāo)。

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Neuroprotective effects of capsaicin pretreatment on ischemic stroke rats revealed by metabolomic approach

ZHANG Yi，ZHU Desheng，WANG Yan.

(Institute of Cerebrovascular Disease，Shanghai 201203，China)

Objective The purpose of this study is to elucidate the neuroprotective effects of capsaicin pretreatment on ischemic stroke rats revealed by GC-MS metabolomicapproach. Methods The establishment of middle cerebral artery occlusion is a ideal method to mimic cerebral ischemia reperfusion injury. Twenty-four adult SD rats were randomly divided into three groups：sham group (Sham)，model group (Mod) and capsaicin pretreatment group (CAP，0.2 mg/Kg). The cerebral cortex tissues were collected using GC-MS metabolomic approach and the screening of differential expressed metabolites were adopted by multivariate statistical analyses including PCA analysis，partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA). Results OPLS-DA score plot can obviously distinguish each group and the screening methods of differentially expressed metabolites were according to the VIP value and the loading scatter plot combined with t-test (P<0.05). The analytical results showed that the metabolism spectrum in model group was different from sham group，excitatory amino acid glutamic acid (P<0.05) metabolites were significantly increased while arachidonic acid(P<0.01)and some amino acid such as isoleucine(P<0.001)，methionine(P<0.001)，L-cysteine(P<0.001)，aspartic acid(P<0.05)，phenylalanine(P<0.05) and energy metabolites such as 1-phosphate-glucose(P<0.05)、6-phosphate-glucose(P<0.01)significantly decreased. Compared with model group，the metabolism spectrum of capsaicin pretreatment group represents a distinct metabolism spectrum，inosine，isoleucine，methionine，L-cysteine，aspartic acid，phenylalanine and other amino acids were approaching to normal levels，3，5-dihydroxy phenyl glycine (P<0.001) and other metabolites significantly increased. Conclusion These differentially expressed metabolites are related to the disturbance in energy metabolism，glycometabolism. Capsaicin pretreatment may improve energy metabolism，alleviate the release of excitatory glutamate，improve the biological function of membrane to provide the neuroprotective effects. In summery，GC-MS metabolomic approach can comprehensively reflect the general metabolic changes under the drug intervention and explore the underlying mechanism，which is helpful to further understanding the therapeutical mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury.

TRPV1； Capsaicin； Cerebral ischemia reperfusion injury； Metabonomics

1003-2754(2016)11-0987-08

2016-03-15；

2016-09-15

上海市自然科學(xué)基金(No. 14ZR1436700)；上海市衛(wèi)計(jì)委科研課題(No. 20144Y0225，No. 201440347)

(上海市腦血管病防治研究所，上海 201203)

王 艷，E-mail：wangyan1997@aliyun.com

R743

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