靳亮許翠萍王金昌關(guān)麗梅張穩(wěn)超黃朝高學(xué)梅王洪秀

（1. 江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌 330029；2. 江西省科學(xué)院鄱陽(yáng)湖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330029；3. 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264025；4. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，南昌 330200）

馬尾松毛蟲(chóng)質(zhì)型多角體病毒NSP1蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)及定位

靳亮1，2許翠萍3王金昌1關(guān)麗梅1張穩(wěn)超1黃朝1高學(xué)梅1王洪秀4

（1. 江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌 330029；2. 江西省科學(xué)院鄱陽(yáng)湖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330029；3. 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264025；4. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，南昌 330200）

馬尾松毛蟲(chóng)質(zhì)型多角體病毒（Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus，DpCPV）基因組S5片段編碼一個(gè)由881個(gè)氨基酸組成、分子量為101 kD的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1）。為探尋DpCPV NSP1蛋白的功能，將DpCPV 1基因組S5-1片段的抗原區(qū)（1-600 bp）進(jìn)行了原核表達(dá)，并將純化蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體。將稀釋后的病毒液感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中腸樣品，通過(guò)Western blot檢測(cè)NSP1蛋白的合成時(shí)間曲線(xiàn)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，S5片段表達(dá)的蛋白在病毒感染第1天就有合成，并且除了檢測(cè)到全長(zhǎng)的蛋白（101 kD）外，也檢測(cè)到了80 kD和20 kD的蛋白條帶，說(shuō)明NSP1蛋白為早期表達(dá)蛋白，并且蛋白發(fā)生了切割。另外，首次對(duì)DpCPV 1 S5片段進(jìn)行了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)和昆蟲(chóng)亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，昆蟲(chóng)細(xì)胞定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

馬尾松毛蟲(chóng)質(zhì)型多角體病毒；NSP1；抗體制備；真核表達(dá)；細(xì)胞定位

質(zhì)型多角體病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus）屬于呼腸孤病毒科質(zhì)型多角體病毒屬。根據(jù)第九次國(guó)際病毒分類(lèi)會(huì)議制定質(zhì)型多角體病毒的分類(lèi)［1］，馬尾松毛蟲(chóng)質(zhì)型多角體病毒（Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus，DpCPV）歸為CPV-Ⅰ型，基因組由10條分段的dsRNA組成。松毛蟲(chóng)是我國(guó)森林蟲(chóng)害的主要害蟲(chóng)，DpCPV為我國(guó)重大森林害蟲(chóng)——松毛蟲(chóng)的致病原，對(duì)松毛蟲(chóng)具有良好的控制效果，在我國(guó)已經(jīng)登記為商品殺蟲(chóng)劑［2］。DpCPV主要感染昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞，感染周期較長(zhǎng)，但宿主范圍一般較寬，可以使10科36種鱗翅目昆蟲(chóng)感染發(fā)?。?］。采用冰凍電鏡和計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)技術(shù)研究表明，CPV的蛋白質(zhì)外殼為單層衣殼，主要有3段序列編碼的結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別是由S1片段編碼的衣殼蛋白CSP（Capsid shell protein）、S4片段編碼的塔式突起蛋白TP（Turret protein）及S7片段編碼的大突起蛋白LPP（Large protrusion protein）［4］。Cheng等［5］通過(guò)低溫電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，CPV的五聚體塔狀蛋白TP的酶區(qū)域是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)高度保守并且有5個(gè)連接著鳥(niǎo)苷酰基轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域的獨(dú)特的通道；通過(guò)氨基酸序列推理發(fā)現(xiàn)，CPV的大突起蛋白LPP是由S7片段編碼P50蛋白修飾后得到的。Yang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CPV病毒粒子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，衣殼蛋白VP1A、VP1B和塔狀蛋白VP3構(gòu)象發(fā)生變化，衣殼空間擴(kuò)大和塔狀蛋白周?chē)ǖ赖募訉?，使得基因組RNA從緊湊的病毒粒子衣殼更加靈活的轉(zhuǎn)錄和輸出。Yang等［7］最新研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)Helicoverpa armigera cypovirus-5（HaCPV-5）結(jié)構(gòu)蛋白VP5具有RNA分子伴侶活性，能夠促進(jìn)RNA解旋并加速鏈的退火，并且促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶的起始轉(zhuǎn)錄。

相對(duì)于CPV的結(jié)構(gòu)蛋白的深入研究，CPV非結(jié)構(gòu)蛋白的研究相對(duì)較慢。文力［8］、張萬(wàn)菊［9］等對(duì)DpCPV 1基因組中的第九片段（S9）的編碼序列進(jìn)行了cDNA克隆和序列測(cè)定，并對(duì)NS5蛋白的表達(dá)和功能進(jìn)行了初步分析。Chen等［10］研究發(fā)現(xiàn)由DpCPV基因組第9片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5蛋白在感染昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)，定位在昆蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上。段兵［11］和胡建芳等［12］對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)CPV基因組第8片段進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)。凝膠遷移阻抑分析（EMSA）顯示，由CPV基因組第8片段編碼的p44蛋白具有序列非特異性的ssRNA結(jié)合活性，不與dsRNA、ssDNA、dsDNA結(jié)合；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p44氨基酸序列116-197 aa之間的區(qū)域（富含谷氨酸區(qū)域）為單一的RNA結(jié)合區(qū)域［13］。

Hagiwara等［14］通過(guò)原核表達(dá)BmCPV S5片段發(fā)現(xiàn)S5片段序列與口蹄疫2A蛋白的編碼序列同源性高達(dá)93%。Cheng等［15］通過(guò)酵母雙雜交的方法研究發(fā)現(xiàn)，DpCPV S5片段編碼的NS 1蛋白能夠與多角體蛋白（Polyhedrin）發(fā)生相互作用。

目前還未有對(duì)NSP1蛋白在中腸細(xì)胞的合成過(guò)程、真核表達(dá)和細(xì)胞定位的研究。本研究通過(guò)構(gòu)建DpCPV 1基因組S5片段的原核表達(dá)體系，表達(dá)純化蛋白后免疫家兔制備多克隆抗體。將稀釋后的病毒液感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，分時(shí)段提取中腸細(xì)胞樣品，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，判斷該蛋白合成過(guò)程。通過(guò)構(gòu)建bac-to-bac系統(tǒng)，將DpCPV 1非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1-GFP的融合表達(dá)，判斷該蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9上的定位，以期為理解該蛋白在病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲(chóng)，質(zhì)粒及菌種 甜菜夜蛾卵由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒所昆蟲(chóng)病毒基因工程學(xué)科組提供，于27℃培養(yǎng)。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21和DH10B菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pMD18-T vector系統(tǒng)、T4 DNA Ligase及其buffer購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，載體pET-28a、DpCPV 1基因序列S5片段為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑購(gòu)自Promega公司；rTaq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶以及Buffer購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DM2000 DNA Marker 購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自南京生興生物技術(shù)公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自武漢貝特生物公司；Ni-NTA His.BindTMResins購(gòu)自Novagen公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectin 購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）；熒光染料 Hoechst 33258 購(gòu)自BIOSHARP公司（美國(guó)）；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司（美國(guó)）；PCR純化試劑盒購(gòu)自PROMEGA公司（上海）；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自PROMEGA公司（上海）；其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物合成 根據(jù)DpCPV 1基因組S5-1片段的核苷酸序列的抗原區(qū)（核酸序列1-600 bp），設(shè)計(jì)引物；除通用引物M13F 和M13R（Cat. No. N530-02，Invitrogen公司，美國(guó)）外，其余引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物列表詳見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所需引物列表

1.2 方法

1.2.1 DpCPV 1 S5-1 ORF全長(zhǎng)的原核表達(dá) DpCPV基因組通過(guò)SDS熱酚法進(jìn)行抽提［16］。以DpCPV病毒基因組中回收得到的S5-1片段為模板，以S5-1為引物，利用兩步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增［17］。PCR擴(kuò)增的片段通過(guò)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)酶切，連接到原核表達(dá)載體pET28a（pET28a-S5-1）。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，1 mmol/L的IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體，經(jīng)超聲破碎后離心，獲得包涵體蛋白。經(jīng)8 mol/L的尿素溶液溶解包涵體蛋白，然后通過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂柱進(jìn)行蛋白純化并為下一步制備抗體做準(zhǔn)備。

1.2.2 抗體制備 純化的目的蛋白用常規(guī)方法（淋巴加皮下注射）免疫家兔，制備抗血清。實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)，抗原注射及最終采血均委托武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2.3 DpCPV感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng) 肖宇宙等［17］通過(guò)將DpCPV病毒液感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng)后，出現(xiàn)典型的CPV感染癥狀，成功獲得DpCPV多角體病毒，證明甜菜夜蛾幼蟲(chóng)也是DpCPV 的易感宿主。將病毒原液稀釋成5×104PIB/mL，將飼料塊分成1 mm的正方形，每個(gè)小飼料塊上滴10 μL的病毒稀釋液。取100頭2-3齡甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，放到六孔板中，每個(gè)孔中一頭幼蟲(chóng)和一塊飼料，放入27℃恒溫箱培養(yǎng)，每隔24 h取9頭活蟲(chóng)，每3頭為一組，取中腸放入1.5 mL的離心管中，連取5 d。

1.2.4 甜菜夜蛾幼蟲(chóng)中腸樣品SDS-PAGE電泳檢測(cè) 分別配制12% Tris-甘氨酸SDS-PAGE電泳分離膠和5%的Tris-甘氨酸SDS-PAGE電泳積層膠，插入1.0 mm的梳子。然后進(jìn)行樣品處理，上述1-5 d的中腸樣品分別取出20 μL，加入上樣Buffer攪勻，沸水浴5 min，冰浴3 min，離心將雜質(zhì)沉淀。將處理好的樣品每膠孔上樣15 μL，Protein Marker加10 μL，外加電壓80 V約1 h后待樣品液面相平時(shí)加壓至120 V。樣品跑到膠板底部即可停止?？捡R斯亮藍(lán)染色過(guò)夜，脫色液脫色5 h。

1.2.5 間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)抗血清的效價(jià) 抗原為各基因片段純化后的原核表達(dá)產(chǎn)物或經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化得到的病毒粒子。先用包被液稀釋抗原，加入酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。第2天用含0.05% Tween-20的PBS（pH7.4）洗滌液清洗3次，甩干。用0.5%封閉液（PBS + 0.5% BSA + 0.05% Tween-20，pH7.4）37℃封閉30 min，然后用洗滌液清洗3次。一抗血清用洗滌液稀釋1 000倍后，再依次2倍稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板中。37℃孵育30 min，用洗滌液清洗3次，甩干。二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗）按試劑盒說(shuō)明，稀釋5 000倍后，加入酶標(biāo)板中，37℃孵育30 min，用洗滌液清洗3次。顯色步驟按照試劑盒說(shuō)明，加入相應(yīng)底物，37℃避光10 min左右顯色完成后，加入終止液終止反應(yīng)。最后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光值。

1.2.6 抗血清的Western blot檢測(cè) 誘導(dǎo)表達(dá)和純化的各蛋白及昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液（TBS + 5%脫脂奶粉）4℃封閉過(guò)夜。TBS-T緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl，200 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH7.5）室溫洗膜5 min。抗血清用0.5%封閉液（TBS + 0.5%脫脂奶粉）稀釋1 000倍，將膜分浸入抗血清稀釋液中，37℃溫浴1 h。TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min。二抗分別為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG，用0.5%封閉液稀釋3 000倍。將膜浸入二抗稀釋液中，37℃溫浴1 h。TBS-T緩沖液洗膜4次，每次10 min。顯色操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7 NSP1的亞細(xì)胞定位 馬永平等［18］研究了文山松毛蟲(chóng)質(zhì)型多角體病毒（DpCPV2W）在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的離體增殖行為，并進(jìn)行了空斑試驗(yàn)，結(jié)果顯示DpCPV2W 毒株在Sf9和Sf21 細(xì)胞中均能增殖，并能產(chǎn)生形態(tài)正常的病毒多角體。用P2病毒貯液感染貼壁生長(zhǎng)24 h的Sf9細(xì)胞（覆蓋玻底培養(yǎng)皿50%），27℃培養(yǎng)24 h，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS（pH7.4）將細(xì)胞洗1遍，加入4%多聚甲醛（過(guò)濾除菌）室溫靜置固定15 min，再用PBS（pH7.4）將細(xì)胞洗1遍；加入透化液（0.25% triton×100），室溫靜置10 min；用PBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞，加熒光染料hoechst

33258染核5-10 min，然后用PBS洗3遍，再加入1 mL PBS。激光共聚焦顯微鏡（TCS SP2，Leica，德國(guó)）觀(guān)察綠色熒光分布情況。

1.2.8 序列統(tǒng)計(jì)分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 將DpCPV 1基因組S5片段，放入NCBI上進(jìn)行Blast序列比對(duì)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。利用Mega4.0分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，并采用軟件 ClustalW和PHYLIP3.67的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 DpCPV 1基因組S5片段和其編碼非結(jié)構(gòu)蛋白

NSP1的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，DpCPV 1 基因組S5片段與舞毒蛾質(zhì)型多角體病毒（LdCPV 1）基因組S5片段（AF 389466.1）和DpCPV（武大株）的S5片段（AY 185594.1）具有最高的序列同源性（99%），分別與5株家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV 1）Strain H、Strain I、Strain suzhou、BmCPV S5（KR704200.1）和BmCPV S5（AF433660.1）對(duì)應(yīng)片段的同源性為80%、80%、80%、80%和79%（圖 1）。DpCPV 1 S5片段編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示：NSP1蛋白與DpCPV（武大株）和LdCPV 1的同源性為99%，與BmCPV 1 p101（GI：16660648）同源性88%，與另外4種BmCPV同源性為87%，與冬尺蠖蛾質(zhì)型多角體病毒（Operophtera brumata cypovirus 18）的相應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列同源性為61%（圖2）。另外，我們檢測(cè)到了NSP1蛋白與手足口病毒（Foot-and-mouth disease virus-type O） 的VP1蛋白的部分序列有89%的氨基酸序列同源性。

圖1 DpCPV1基因組S5片段的核酸系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 DpCPV S5片段的分子克隆和抗體制備

以S5-1為正反向引物，以DpCPV 1基因組S5截短片段（S5-1）為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小600 bp。將S5-1連接至pET28a載體上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。用BamHⅠ和Hind III雙酶切驗(yàn)證正確后，命名為pET28a-S5-1。經(jīng)測(cè)序，將鑒定正確的克隆質(zhì)粒pET28a-S5-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，加IPTG誘導(dǎo)后離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖3所示，檢測(cè)到插入的S5-1片段的載體有相應(yīng)蛋白的表達(dá)，蛋白大小約為30 kD。因插入的S5-1片段后面攜帶了一個(gè)His純化標(biāo)簽（大小約7 kD），所以實(shí)際插入S5-1片段表達(dá)的蛋白大小為23 kD，與S5-1片段表達(dá)蛋白大小相符。通過(guò)His純化標(biāo)簽經(jīng)Ni-NTA純化樹(shù)脂純化包涵體的目的蛋白后，所得純化蛋白免疫家兔，制備N(xiāo)SP1蛋白的多克隆抗體anti-S5-1。

圖2 DPCPV 1 NS1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞中S5編碼蛋白的Western blot檢測(cè)

采用間接ELISA方法檢測(cè)S5-1抗體的效價(jià)，在450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值。結(jié)果顯示，以原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原，抗體效價(jià)在1∶3 000左右；以經(jīng)過(guò)蔗糖密度梯度離心純化得到的病毒粒子為抗原，抗體效價(jià)在1∶200左右。因此對(duì)S5-1抗體稀釋1 000倍后用于檢測(cè)。將感染病毒的中腸細(xì)胞離心取上清經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)過(guò)Western blot檢測(cè)DpCPV 1 S5片段編碼蛋白NSP1在昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。如圖4-B顯示，病毒感染的昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞（第1-5泳道）在100、80和23 kD處有明顯條帶，條帶是S5片段編碼蛋白的真核表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示，在感染病毒的第1天S5片段編碼的蛋白即已表達(dá)，屬于早期表達(dá)蛋白，而且發(fā)生了切割。

2.4 非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1蛋白的亞細(xì)胞定位

用P3代病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9后24 h，用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明，昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9被桿狀病毒感染后，細(xì)胞核明顯增大，經(jīng)熒光染料 Hoechst 33258染洗后，紫色部位為細(xì)胞核。而融合了NSP1的eGFP的蛋白則主要聚集在細(xì)胞質(zhì)中（圖5-A），而沒(méi)有融合NSP1的EGFP均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞中（圖5-C），說(shuō)明S5片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1主要定位細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 DpCPV 1的S5-1的PCR和原核表達(dá)純化SDSPAGE圖

圖4 昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞中S5編碼蛋白的動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)圖譜

圖5 融合了EGFP的NSP1在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的定位

3 討論

本研究通過(guò)克隆 DpCPV 1基因組S5-1片段插入到原核表達(dá)載體BL21內(nèi)，原核表達(dá)NSP1蛋白的抗原區(qū)部分。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)到誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白大小約32 kD，這是因?yàn)樵跇?gòu)建表達(dá)S5-1片段的后面添加了一個(gè)His純化標(biāo)簽，純化標(biāo)簽的蛋白大小約7 kD。所以DpCPV 1基因組S5-1片段原核表達(dá)蛋白的大小約25 kD，與NSP1的蛋白大小相符。將DpCPV 1 S5-1片段原核表達(dá)蛋白免疫家兔，制備了NSP1的多克隆抗體。

將DpCPV1感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，取中腸樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DpCPV 1 S5片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白從第1天就出現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了切割修飾為早期表達(dá)蛋白，表達(dá)的蛋白大小分別為101、80 和21 kD，隨時(shí)間增加并未遞減。這種蛋白切割現(xiàn)象此前也在DpCPV 1的其它片段表達(dá)的蛋白中發(fā)現(xiàn)過(guò)。如Jin等［18］將DpCPV 1感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，取中腸樣品經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DpCPV 1 S7片段編碼的蛋白p50在感染的第3天表達(dá)的蛋白大小為50 kD，在感染的第5天發(fā)現(xiàn)該蛋白發(fā)生切割修飾，修飾后的蛋白大小為31 kD，上述數(shù)據(jù)證實(shí)了DpCPV S7片段在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白發(fā)生了切割。因此，我們推測(cè)NSP1蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了降解或者被昆蟲(chóng)細(xì)胞的某些酶切割或修飾。用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察Bac-S5-eGFP的融合蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，融合NSP1的綠色熒光蛋白（eGFP）主要聚集在細(xì)胞質(zhì)中，沒(méi)有融合eGFP的分布于整個(gè)細(xì)胞，說(shuō)明 DpCPV 1的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1定位于細(xì)胞質(zhì)中。

4 結(jié)論

對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)質(zhì)型多角體病毒基因組S5片段編碼NSP1蛋白的表達(dá)時(shí)相進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白為早期表達(dá)蛋白，且在合成過(guò)程中發(fā)生了切割；對(duì)NSP1蛋白進(jìn)行昆蟲(chóng)細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白定位于Sf9細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Expression and Cellular Localization of Dendrolimus puntatus Cytoplasmic Polyhedrosis Virus NSP1 in Insects

JIN Liang1，2XU Cui-ping3WANG Jin-chang1GUAN Li-mei1ZHANG Wen-chao1HUANG Chao1GAO Xue-mei1WANG Hong-xiu4
（1. Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029；2. Key laboratory of Poyang Lake，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029；3. College of Life Science，Ludong University，Yantai 264025；4. Institute of Agricultural Applied Microbiology，Jiangxi Agricultural Academy of Sciences，Nanchang 330200）

Genome segment 5 of Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus（DpCPV）was predicted to encode a protein of 881 amino acids with a molecular mass of 101 kD non-structural protein（NSP1）. In order to study the function of the DpCPV NSP1 protein，PCR primers were designed according to the S8 segment genome sequence. The antigen of DpCPV 1 genome S5-1 piece’s area（1-600 bp）was in prokaryotic expression，and the polyclonal antibodies against the expressed proteins were raised in rabbits. The diluted virus was used to infect Autographa californica，midgut anatomical samples were taken in each day after infection，and the synthesis curve of NSP1 protein vs time was measured by Western blot. The results of Western blot indicated that the synthesized protein expressed by S5 segment was observed in the first day of infection；in addition to full length protein（101 kD），20 kD and 80 kD protein bands also were detected，indicating that the expression of NSP1 was initiated in early stage and cleaving of NSP1 protein occurred. Moreover，for the first time，the DpCPV 1 S5 fragment was expressed in insect cells and subcellular localization of insects was observed. The results revealed that the NSP1 protein was present in the cytoplasm of the cells.

Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus；NSP1；polyclonal antibody preparation；eukaryotic expression；cellular localization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.024

2016-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260031），江西省科技重大專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（2014ACF60002），中國(guó)科學(xué)院開(kāi)放基金項(xiàng)目（2014AEM003），江西省科學(xué)院鄱陽(yáng)湖中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（[2013]19號(hào)-07）

靳亮，男，博士，研究方向：昆蟲(chóng)病毒分子生物學(xué)研究及生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)推廣 ；E-mail: jinliang079@163.com