李晶泉徐永平，2王熙濤李媛王麗麗，2李曉宇，2

（1. 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024；2. 教育部動物性食品安全保障技術工程研究中心，大連 116620）

抗金黃色葡萄球菌單鏈抗體（scFv）的原核表達及蛋白純化

李晶泉1徐永平1，2王熙濤1李媛1王麗麗1，2李曉宇1，2

（1. 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024；2. 教育部動物性食品安全保障技術工程研究中心，大連 116620）

旨在將來源于雞的金黃色葡萄球菌單鏈抗體（scFv）進行原核誘導表達，獲得有抗體活性的目的蛋白。構建含有目的抗體基因的重組質粒，將此質粒進行原核誘導表達并鑒定所獲得蛋白的生物活性。結果顯示，（1）成功構建了含有金黃色葡萄球菌單鏈抗體（scFv）的重組質粒pCold I-scFv，質粒成功轉化到大腸桿菌表達菌株中；（2）經過誘導表達后，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中；（3）使用4 mol/L 尿素成功地將包涵體變性溶出；（4）通過柱層析法及透析法獲得了純化及復性效果較好的目的蛋白；（5）間接ELISA鑒定證實所獲蛋白具有金黃色葡糖球菌抗體活性。通過質粒構建及原核誘導表達、包涵體溶出和復性等步驟，最終獲得了有金黃色葡萄球菌抗體活性的目的蛋白。

可溶性表達；包涵體；蛋白純化；蛋白復性；有活性的蛋白

金黃色葡萄球菌是人和動物的一種主要病原菌［1］，它能引起膿腫、膿皰病和乳腺炎等感染性疾病，也能引起肺炎、敗血病和中毒性休克綜合征等致死性疾?。?］。目前為止，對金黃色葡萄球菌感染的治療主要以抗生素為主，但濫用抗生素導致耐藥菌頻現，禽畜產品中抗生素的殘留也對食品安全和人體健康造成了嚴重威脅［3，4］。因此，尋找抗生素的替代品是解決抗生素各種弊端的一種有效的途徑。

卵黃抗體（IgY）是一類具有殺滅病菌作用的抗生素替代品。這種抗體是在特異性抗原刺激下由禽類B淋巴細胞產生并轉移到卵黃中的多克隆抗體，以其性質穩(wěn)定、特異性強等優(yōu)勢而成為特別具有應用前景的抗生素替代品。本實驗室多年來一直致力于抗金黃色葡萄球菌IgY的制備和應用，在其制備方面采用免疫蛋雞的方法，純化方面一直采用的是傳統(tǒng)的水稀法［5，6］及硫酸銨和硫酸鈉鹽析結合的方法［7］。免疫蛋雞所獲得的特異性IgY僅占IgY總含量的2%-10%，且分離純化過程繁瑣，因此，如何獲得高活性、性能穩(wěn)定，甚至能通過基因工程菌大量表達的IgY，是突破IgY難以大量提純瓶頸問題的關鍵，也是研究IgY抗菌機理必須解決的問題。本實驗室通過PCR方法擴增IgY基因的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并通過噬菌體展示技術將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的連接產物表達于噬菌體的表面，運用生物淘選的方法淘選到了一條重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列完整的金黃色葡萄球菌單鏈抗體（singlechain fragment variable，scFv）基因［8］。本研究主要針對此基因的原核蛋白表達方法，通過蛋白小量誘導表達、大量誘導表達、包涵體溶解、復性及蛋白純化和濃縮等手段，以期獲得有生物活性的目的蛋白抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌（CVCC545）購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。原核表達載體pColdⅠ、宿主菌大腸桿菌 JM109、大腸桿菌 BL21、PCR擴增用酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、Premixed Protein Marker（Broad）購自寶生物工程（大連）有限公司；Precision Plus ProteinTMStandards購自 Life Technologies公司；In-Fusion HD Cloning Plus購 自Clotech公 司；Antibody BSA free Mouse monoclonal IgG購自Qiagen公司；Rabbit anti Mouse IgG HRP購自Invitrogen公司；HiTrapTMTALON crude，5 mL TALON SuperflowTM購自美國通用電氣公司；SnakeSkinTMPleated Dialysis Tubing；3500 MWCO購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌抗體scFv基因的擴增 根據金黃色葡萄球菌抗體scFv基因序列和pCold I載體序列設計了1對In-Fusion引物。其中上游引物INF：5'-GAAGGTAGGCATATGGCCGTGACGTTGG AC-3'，劃線處為scFv基因上的序列，未劃線處為pCold I載體上的序列；下游引物INR：5'-AGACTGC AGGTCGACTTATGGTTCCATGCAACAGCCG-3'，劃線處為scFv基因上的序列，未劃線處為pCold I載體上的序列。以噬菌體文庫淘選到的scFv基因為模板，進行PCR擴增。PCR體系如下：ScFVDNA片段 1 μL，INF（20 pmol/μL）0.5 μL，INR（20 pmol/μL）0.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）8 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，5×PrimeSTAR PCR Buffer 10 μL，dH2O補充至50 μL。反應程序為：94℃預變性1 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸1 min，循環(huán)擴增30次。擴增產物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，并回收目的條帶。

1.2.2 重組質粒的構建 表達載體pCold I用Xho I、Nde I進行雙酶切，雙酶切產物進行切膠回收后與上述純化的PCR產物用In-Fusion HD Enzyme 50℃連接15 min。連接產物轉化大腸桿菌 JM109感受態(tài)細胞，涂布LB/Amp（50 μg/mL）平板篩選陽性克隆，37℃培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)，然后挑取單菌落進行菌落PCR驗證，取菌落PCR呈陽性的重組子提取質粒DNA，將重組質粒pCold I -scFv送往寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.2.3 重組蛋白的小量表達 測序讀碼框架正確的重組質粒pCold I -scFv轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，涂布于LB/Amp（50 μg/mL）平板篩選陽性克隆，挑取單克隆接種至2 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基，置于37℃振蕩培養(yǎng)，次日取過夜培養(yǎng)的種培養(yǎng)液，按1/100的比例接種至3 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，當菌體生長至OD600約為0.6時，15℃培養(yǎng)15 min，之后添加適量的100 mmol/L IPTG至終濃度為1 mmol/L，15℃誘導培養(yǎng)22 h。集菌后，取2.0 OD相當的菌體加入320 μL PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/LNa2HPO4，2 mmol/L KHPO4，pH7.4），將細菌懸濁后進行冰浴超聲破碎，之后將破碎液進行離心（12 000 r/min，5 min）。取各抽提液（全蛋白、上清、沉淀）8 μL（0.05 OD相當），加入2 μL 5×SDS Loading Buffer，95℃加熱10 min，進行SDS-PAGE電泳。

1.2.4 重組蛋白的大量表達及包涵體的洗滌和溶出 將經小量表達優(yōu)化后的pCold I -scFv甘油保存菌種50 μL，接種至5 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，在16.5φ玻璃試管內，37℃搖床過夜培養(yǎng)。次日取過夜培養(yǎng)的種培養(yǎng)液，按1/100的比例接種至500 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，在2 L 搖瓶內，37℃搖床震蕩誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同小量表達。將大量誘導表達的菌體于4℃4 000 r/min 離心40 min，收集菌體，用不含尿素的PBS緩沖液洗滌菌體兩次，之后用含4 mol/L 尿素的Sonication buffer（50 mmol/L Sodium phosphate，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L Imidazole，4 mol/L Urea，pH8.0）將菌體重懸，冰浴超聲破碎，繼而4℃，12 000 r/min離心40 min，取上清。上清液即是包涵體的溶解液，使用0.45 μmol/L 過濾膜將上清進行過濾，即得到了較純的蛋白上清液，為蛋白的進一步純化和復性做好準備。

1.2.5 重組蛋白的純化 溶出的包涵體使用GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow 進行柱層析純化。首先將GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow純化柱與AKTA prime Plus機器相連接，用10倍柱體積的MilliQ水和Buffer A（50 mmol/L Sodium phosphate，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L Imidazole，pH8.0）對樹脂進行平衡。然后進行上樣及清洗，將AKTA prime Plus機器的進樣管放于1.2.4過濾后的蛋白上清液中，以0.5 mL/min的速度上樣。待樣品流穿后，用20倍柱體積的Buffer A洗3次柱，充分除去非特異結合的蛋白。在AKTA prime Plus機器的引導下，10倍柱體積的Buffer A和10倍 柱 體 積 的Buffer B（50 mmol/L Sodium phosphate，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L Imidazole，4 mol/L Urea，pH8.0）以1 mL/min的流速混合，混合液洗脫Buffer咪唑的濃度由5 mmol/L逐漸提高至300 mmol/L。目的蛋白在合適的咪唑濃度下被洗脫下來。使用AKTA prime Plus的自動收集盤對洗脫樣品進行收集，每1.1 mL收集一管。從每管樣品中取5 μL樣品，15% SDS-PAGE凝膠進行電泳，檢測目的樣本的分布。

1.2.6 重組蛋白的復性 將收集后的目的蛋白裝入透析袋，在燒杯中用20倍收集蛋白量的PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KHPO4，pH7.4）進行3次透析。前2次 2 h/次，第3次過夜。將透析后的蛋白放入15 mL tube中，分別取2、4和8 μL進行電泳，通過BSA及ImageMaster 1D version 3.0解析軟件對透析后蛋白進行定量分析。

1.2.7 重組蛋白Western blot鑒定 將PVDF膜、濾紙分別剪切成與凝膠相同大小，使用轉膜緩沖液處理后，按濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序依次放在轉膜儀電極板之間，開始轉膜。將PVDF膜置于含1.5% BSA 的10 mL 封閉液中，4℃平放過夜封閉。使用稀釋后的Antibody BSA free Mouse monoclonal IgG溶液5 mL，進行一次抗體反應1 h。TBST緩沖液（20 mL）洗滌2次；TBS緩沖液洗滌3次。使用稀釋后的Rabbit anti Mouse IgG HRP抗體溶液5 mL，進行二次抗體反應1 h。TBST緩沖液（20 mL）洗滌2次；TBS緩 沖 液 洗 滌3次。1 mL TrueBlue Peroxidase Substrate顯色1 min。

1.2.8 重組蛋白間接ELISA活性鑒定 以金黃色葡萄球菌為抗原檢測原核表達的蛋白是否有抗體活性。將購買的金黃色葡萄球菌接種到TSB（胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%）培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，第2天，4℃，8 000 r/min，離心10 min，收集菌體，將獲得的菌體用PBS重懸，洗滌3次，之后用1%甲醛37℃滅活24 h，再用PBS重懸洗滌3次，用生理鹽水稀釋備用。為了確保實驗的嚴謹性，實驗用同樣處理的大腸桿菌做為陰性對照。首先，用100 μL 濃度為0.02 mg/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌過夜包被ELISA板，第2天，傾倒包被液，使用100 μL封閉液（含1.0% BSA）37℃封閉1 h，棄孔中溶液，然后每孔加入100 μL 濃度為0.016 mg/mL的可溶性蛋白，于37℃孵育1 h，棄孔中溶液，用TBST洗滌3次；之后每孔加入100 μL1∶1 000稀釋的Antibody BSA free Mouse monoclonal IgG，37℃孵育1 h，棄孔中溶液，用TBST洗滌3次；再加入100 μL 1∶1 000稀釋的Rabbit anti Mouse IgG HRP抗體，37℃孵育1 h，棄孔中溶液，用TBST洗滌5次；加100 μL TMBZ顯色液，室溫密閉顯色20 min，之后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液，立即在TECAN Infinite F200酶標儀上讀取A450值。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌抗體scFv基因PCR擴增結果

使用In-Fusion引物對scFv基因進行PCR擴增，擴增后的片段見圖1。使用Nde I 和Xho I對pCold I載體進行酶切，酶切結果見圖2。

圖1 scFv片段的PCR擴增結果

圖2 pCold I載體Nde I和Xho I酶切前后結果

2.2 重組質粒的構建及測序

隨機從轉化平皿上挑取4個pCold I -scFv重組菌落，使用pCold I載體上的引物進行PCR擴增，電泳結果（圖3）顯示，重組菌落擴增后得到了1 kb左右的核酸條帶，擴增條帶大小與目的基因大小吻合。測序結果顯示所構建的重組質粒讀碼框完整，讀碼正確，說明目的重組質粒構建成功。

圖3 重組菌落PCR產物電泳結果

2.3 重組蛋白的小量表達及檢測

重組質粒pCold I-scFv轉化大腸桿菌 BL21感受態(tài)細胞，用終濃度為1 mmol/L 的IPTG，15℃誘導培養(yǎng)22 h，用SDS-PAGE電泳分析表達產物。結果顯示，有目的蛋白表達，重組蛋白分子量約為32 kD，與預測的分子量一致。大量收集菌體并破碎、離心，分別取等量全蛋白、上清和沉淀，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白的可溶性。結果（圖4）表明，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。

圖4 pCold I-scFv小量誘導表達蛋白的可溶性檢測

2.4 重組蛋白包涵體的溶出及柱層析純化

為了獲得目的蛋白，本研究將重組質粒pCold I-scFv用終濃度為1 mmol/L的 IPTG 500 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基大量誘導表達后，按照1.2.4的方法，使用4 mol/L的尿素對包涵體進行處理，將包涵體蛋白溶出，如圖5所示，經處理后，目的蛋白都溶解于上清液中。表達的目的蛋白羧基端含組氨酸標簽，因此考慮利用親和柱分離目的蛋白，GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow層析介質含有Co2+離子四配位螯合基團，其與瓊脂糖微球高度交聯。這種層析介質高選擇性結合含有組氨酸標簽的蛋白，低親和性結合宿主蛋白，從而提供更低的純化背景。變性狀態(tài)的目的蛋白使用0.45 μmol/L 的過濾膜過濾后，用GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow 進行柱層析純化。純化過程中，將GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow層析柱與AKTA prime Plus機器相連接，使用AKTA prime Plus機器進行層析柱的上樣，待樣品流穿后，用20倍柱體積的Buffer A在低咪唑濃度下洗3次柱，充分除去非特異結合的蛋白，3次清洗狀態(tài)如圖6所示。之后使用AKTA prime Plus機器將10倍柱體積的Buffer A和10倍柱體積的Buffer B緩慢混合，混合的過程中咪唑的濃度按線性梯度由5 mmol/L提高到300 mmol/L，目的蛋白在合適的咪唑濃度下洗脫下來。在純化的過程中AKTA prime Plus的自動收集盤對洗脫樣品進行收集，每1.1 mL收集一管。由AKTA prime Plus的出峰情況（圖7）可以看出，目的蛋白從第40管開始大量溶出，從第40-69管中各取5 μL樣品，進行15% SDSPAGE凝膠電泳，檢測目的樣本的分布，結果如圖8所示。

圖5 包涵體溶出后SDS-PAGE電泳檢測

圖6 非目的蛋白洗脫情況分析

圖 7 pCold I-scFv蛋白溶出

2.5 重組蛋白的收集與透析復性

收集目的蛋白第40-69管共計約34.1 mL。使用收集樣品20倍量的PBS在4℃對蛋白進行3次透析。前2次 2 h/次，第3次過夜透析，透析過程中未見絮狀沉淀，透析后也未見沉淀產生，證明復性成功。復性后共收集樣品32 mL，取少量復性后蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果如圖9-A所示；取少量復性后蛋白進行Western blot檢測，結果如圖9-B所示。使用ImageMaster 1D version 3.0解析軟件根據定量蛋白BSA進行定量分析，分析結果顯示目的蛋白的濃度為0.16 mg/mL，目的蛋白的純度為98%。32 mL透析后的目的蛋白總量為5.12 mg，蛋白收率為10 mg/L菌體。

圖8 目的蛋白梯度洗脫液情況分析

圖9 pCold I-scFv蛋白的透析（A）及Western blot檢測（B）

2.6 重組蛋白間接ELISA活性鑒定

實驗以大腸桿菌為陰性對照，使用蛋白上帶有的his標簽對應的一抗和二抗檢測可溶性蛋白與金黃色葡萄球菌（金葡菌）抗原及大腸桿菌的結合能力。間接ELISA的結果（圖10）顯示，pCold I -scFv蛋白與金黃色葡萄球菌抗原的結合能力明顯高于與大腸桿菌的結合能力，說明通過原核表達及純化、透析得到的是有金黃色葡萄球菌生物活性的目的蛋白。

圖10 pCold I-scFv蛋白ELISA檢測

3 討論

IgY抗體是一種具有較大應用潛力的抗體，目前，已有大量添加IgY的產品，如發(fā)酵酸奶、衛(wèi)生消毒產品、功能性食品及化妝品等上市銷售［9，10］。IgY可應用于醫(yī)療診斷及治療，通過臨床驗證也顯示出良好效果［11-20］。雖然IgY抗體有著較大的應用潛力，但是傳統(tǒng)的制備IgY抗體的方法特異性抗體的得率較低、純化也比較復雜；隨著生物科學的發(fā)展，采用基因工程方法制備IgY單鏈抗體的技術應運而生，通過體外表達的方式得到具有商業(yè)應用價值的單鏈抗體也成為眾多研究者追捧的目標。

大腸桿菌原核表達系統(tǒng)具有繁殖快、遺傳背景清楚、表達效率高等優(yōu)點，是目前應用最廣泛的蛋白表達系統(tǒng)。金黃色葡萄球菌是一種特別常見的人畜共患菌，目前鮮有使用原核表達系統(tǒng)表達金黃色葡萄球菌IgY單鏈抗體的報道。本研究通過選擇合適的表達載體pCold I及低溫誘導培養(yǎng)條件，實現了scFv單鏈抗體的高表達，表達的重組抗體蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體通過離心容易收集，有利于分離純化；包涵體能夠保護蛋白免受蛋白酶的水解；目的蛋白以無活性的包涵體形式表達，不會影響宿主菌生長。本研究使用4 mol/L尿素成功地將包涵體溶出，溶出的蛋白通過TALON樹脂進一步親和純化得到了較高純度的目的蛋白。TALON樹脂以Co2+作為螯合金屬，與傳統(tǒng)的以Ni2+作為螯合金屬的樹脂相比，其結構更規(guī)則，結合能力更強，故使用TALON樹脂比通常以Ni2+作為螯合金屬的樹脂純化效果更好。

溶出蛋白質的復性也是特別關鍵的一個步驟，因此復性方法的選擇就顯得尤為重要。透析法操作簡單、不增加蛋白質的體積，通過逐漸降低外透液的濃度來控制變性劑的去除速度，使蛋白質呈現生物活性［21-23］。本研究選擇透析法進行蛋白復性，將從TALON樹脂中溶出的蛋白溶液置于SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing 3500 MWCO透析膜內，透析過程中未見絮狀沉淀，透析后也無沉淀產生，證明復性成功。復性后的目的蛋白濃度為0.16 mg/mL，純度為98%。體外抗體活性測定顯示，純化的重組蛋白在0.016 mg/mL時就表現出良好的金黃色葡萄球菌抗原的結合能力，說明重組蛋白具有良好的金黃色葡萄球菌抗體活性。

本研究通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)以及搖瓶培養(yǎng)，獲得了純化收率為10 mg/L菌體、純度為98%的有活性的scFv單鏈抗體蛋白。其方法具有成本低、產率高、純度高、技術路線簡單的優(yōu)勢，不僅為規(guī)模化制備scFv單鏈抗體提供了寶貴的技術路線，為金黃色葡萄球菌IgY抗體蛋白進一步的功能和應用研究奠定了基礎，同時也為大腸桿菌生產其它重組小分子抗體提供了有價值的參考。

4 結論

本研究通過質粒構建及大腸桿菌原核表達的方法，獲得了以包涵體形式存在的金黃色葡萄球菌抗體蛋白，此包涵體經4 mol/L尿素成功溶出，使用透析法對蛋白進行復性之后，經ELISA鑒定證實所表達的蛋白具有金黃色葡萄球菌抗體活性。

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（責任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression and Purification of Single-chain Variable Fragment（scFv）Against Staphylococcus aureus

LI Jing-quan1XU Yong-ping1，2WANG Xi-tao1LI Yuan1WANG Li-li1，2LI Xiao-yu1，2
（1. School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024；2. Ministry of Education Center for Food Safety of Animal Origin，Dalian 116620）

This work aims to clone and express single-chain variable region fragment（scFv）of Staphylococcus aureus in Escherichia coli，and to obtain the target protein with scFv activity. A plasmid containing target scFv gene was constructed，then transformed into a prokaryotic expression strain to be induced，and the activity of the harvested protein was identified. As results：（1）Recombinant plasmid pCold I-scFv was successfully constructed，and transformed into the expression strain of Escherichia coli.（2）After induction，the target proteins mainly exist in pellet in the form of inclusion bodies. （3）Inclusion body was dissolved successfully using 4 mol/L urea. （4）Purified and renatured target protein by column chromatography and dialysis was favorable. （5）The refolded protein showed specific binding activity with S. aureus in ELISA experiment. Conclusively，the target protein with S. aureus antibody activity was successfully acquired by plasmid construction and prokaryotic expression，inclusion body dissolving and refolding.

soluble expression；inclusion；protein purification；protein refolding；active protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.022

2016-03-14

基金情況：中央高?；究蒲袠I(yè)務費（DUT13 JB04），國家海洋公益項目（201405003-3）

李晶泉，女，博士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：lijq@takara.com.cn

李曉宇，女，博士，研究方向：特異性卵黃抗體替代抗生素；E-mail：xiaoyuli@dlut.edu.cn