蒲遠(yuǎn)波郭翠平淑珍

（1. 川北幼兒師范高等?？茖W(xué)校，廣元 628017；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

基因側(cè)翼序列擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

蒲遠(yuǎn)波1郭翠2平淑珍2

（1. 川北幼兒師范高等?？茖W(xué)校，廣元 628017；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

擴(kuò)增基因的側(cè)翼序列在分子生物學(xué)研究中具有重要作用。到目前為止，克隆基因側(cè)翼序列的方法主要可以分為3類：反向PCR、外源接頭介導(dǎo)PCR、半隨機(jī)引物PCR。對(duì)這些技術(shù)的原理以及近期的應(yīng)用情況進(jìn)行了較為系統(tǒng)的綜述，旨在為研究者選擇更可靠、更合理的方法提供依據(jù)。

側(cè)翼序列；反向PCR；外源接頭介導(dǎo)PCR；半隨機(jī)引物PCR

側(cè)翼序列是指染色體中特定位點(diǎn)兩側(cè)的DNA序列。整合進(jìn)入轉(zhuǎn)基因作物染色體的外源目的基因插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，對(duì)目的基因的正常轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及調(diào)控有重要影響，且對(duì)研究轉(zhuǎn)基因作物的穩(wěn)定遺傳性以及轉(zhuǎn)基因作物的安全生產(chǎn)具有重要意義，因此，側(cè)翼序列的分析成為植物轉(zhuǎn)基因育種安全評(píng)估的重要研究手段，受到廣大科學(xué)研究者的重視［1，2］。此外，側(cè)翼序列也包括基因的啟動(dòng)子和調(diào)控位點(diǎn)，因此對(duì)側(cè)翼序列的分析對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控研究也有重要作用。目前已經(jīng)建立了許多關(guān)于側(cè)翼序列的分析方法，根據(jù)其技術(shù)原理，可將這些方法歸為3類：反向PCR、外源接頭介導(dǎo)PCR、半隨機(jī)引物PCR。

1 反向PCR（inverse or inverted PCR，I-PCR）

反向PCR方法的重要功能是擴(kuò)增目標(biāo)序列的側(cè)翼序列。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，先用合適的限制性內(nèi)切酶消化基因組，然后讓酶切后的片段環(huán)化，最后通過(guò)擴(kuò)增引物擴(kuò)增獲得上、下游片段?，F(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫(kù)染色體上DNA片段序列的識(shí)別十分重要。該方法的關(guān)鍵之處在于選擇一種合適的酶，且這種選擇不能在目的位點(diǎn)切斷靶DNA［4］，其原理見(jiàn)圖1。

I-PCR在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，可以用于鑒定外源基因或轉(zhuǎn)座子在基因組中的整合位點(diǎn)，或者用于克隆基因的鄰接序列［5］。下面對(duì)I-PCR的應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹；首先，I-PCR在基因啟動(dòng)子克隆的應(yīng)用，Digeon等［6］用該方法成功克隆了小麥puroindoline基因啟動(dòng)子約1 000 bp片段；Van和Chen等［7，8］基于I-PCR技術(shù)克隆了小麥花粉特異性基因TaPSG719啟動(dòng)子序列；2006年，馮麗等［9］在I-PCR的基礎(chǔ)上通過(guò)技術(shù)優(yōu)化，建立互補(bǔ)末端連接反向PCR（CELI-PCR）技術(shù)，該技術(shù)能夠用于快速分離目的基因全長(zhǎng)cDNA和啟動(dòng)子序列；Forester等［10］用I-PCR技術(shù)分離出豌豆種子脂肪加氧酶基因的啟動(dòng)子區(qū)，約800 bp片段；Heel等［7］擴(kuò)增了人類ITGB7基因啟動(dòng)子；Tsaftaris等［11］成功克隆出了番紅花CsatAP1/FUL啟動(dòng)子。

圖1 反向PCR原理示意圖

除了克隆啟動(dòng)子區(qū)外，I-PCR在分析基因旁側(cè)序列上也得到廣泛應(yīng)用。研究表明，甲酰胺、二甲基亞砜（DMSO）等能夠在不影響Taq酶活力的情況下降低非特異性擴(kuò)增。1998年，李竹紅等［12］依據(jù)以上原理改進(jìn)反向PCR方法，通過(guò)優(yōu)化的I-PCR技術(shù)克隆獲得Tc1轉(zhuǎn)座子左側(cè)反轉(zhuǎn)重復(fù)序列的旁側(cè)序列。2001年，Yu［13］在皰疹病毒中通過(guò)IPCR技術(shù)獲得GTFP基因旁側(cè)序列。同年，韓志勇［14］通過(guò)反向PCR建立了分離水稻外源基因旁側(cè)序列技術(shù)體系，該技術(shù)在套式PCR中結(jié)合了熱啟動(dòng)PCR和降落PCR技術(shù)，成功克隆了35個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系的外源基因側(cè)翼序列，得到的側(cè)翼序列長(zhǎng)度在300-750 bp，并且通過(guò)用Southern雜交對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了后期驗(yàn)證。洪宇植［5］在0.5 μg DNA/mL的反應(yīng)體系中，用DNA酶消化基因組并使酶解片段充分環(huán)化連接，最后用特異性引物進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR使得酶解片段充分自身環(huán)化連接，其產(chǎn)物用25-30 nt的序列特異引物進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR，從而獲得漆酶LacA基因上下游9 kb的序列信息。2010年，俄廣鑫等［15］利用優(yōu)化的I-PCR技術(shù)，參考限制性內(nèi)切酶EaeI Kit的具體實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)cDNA進(jìn)行酶切消化，通過(guò)T4連接酶連接環(huán)化，獲得環(huán)狀DNA分子，最后通過(guò)PCR擴(kuò)增得到豬部分豬精氨酸-絲氨酸蛋白激酶1（SRPK1）的5' UTR序列。2012年，張曉等［16］為獲取atpA基因的側(cè)翼序列，對(duì)I-PCR技術(shù)在2個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化，分別是將DNA片段自連時(shí)間延長(zhǎng)到24 h、將PCR的起始模板量增加到500 ng，以保證目標(biāo)產(chǎn)物高的擴(kuò)增效率。Zimmermann［17］獲得了Bt11玉米的左右旁側(cè)序列。但是，該方法仍然存在許多不足之處：（1）需要從多種限制性內(nèi)切酶中選擇合適的限制酶，只有這樣才能獲得大小合適的DNA片段，因此，由于酶切位點(diǎn)的限制，導(dǎo)致部分靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增不能使用該方法。（2）大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，因而通過(guò)反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。

2 外源接頭介導(dǎo)PCR

該技術(shù)是將已知的序列通過(guò)連接酶的作用與待分離側(cè)翼區(qū)域連接起來(lái)，且已知序列位于限制性片段外側(cè)，然后根據(jù)未知序列兩旁的序列設(shè)計(jì)引物，從而進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得未知序列。根據(jù)連接到未知序列的接頭不同，將外源接頭介導(dǎo)PCR分為單鏈接頭、雙鏈接頭、載體接頭3類［4］。

2.1 單鏈接頭PCR

單鏈接頭PCR，又稱panhandle PCR（P-PCR）。1997年，Jones［18］發(fā)明了該方法，其基本原理：首先根據(jù)物種選擇合適的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，使酶切下的片段產(chǎn)生5'端黏性末端；在5'端黏性末端上接上一條單鏈接頭，單鏈接頭有以下兩個(gè)特點(diǎn)：一是接頭的5'端和黏性末端互補(bǔ)，二是單鏈接頭上，除了酶切序列以外，其余序列必須和已知序列中的一部分序列反向互補(bǔ)；由于單鏈接頭的末端是一個(gè)反向重復(fù)序列，故用該方法分離未知序列只需要一條引物。由于該方法的復(fù)雜性以及較低的特異性，導(dǎo)致該方法的應(yīng)用較少。

Chen［19］通過(guò)對(duì)P-PCR改良，成功從線蟲(chóng)中分離得到FOG-3基因啟動(dòng)子序列；1997年，Jones對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化，在PCR復(fù)性前，在3'末端加上ddCTP，利用改進(jìn)的 P-PCR方法從人類基因組DNA擴(kuò)增得到4-9 kb的片段。P-PCR在分離基因旁側(cè)序列研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。1999年，黃君健等［20］應(yīng)用該技術(shù)擴(kuò)增出端粒催化亞基hTERT基因5'端上游2 090 bp的旁側(cè)序列，F(xiàn)an等［21］利用該技術(shù)克隆出漆酶基因lac48424-1啟動(dòng)子序列；Shang等［22］成功克隆出靈芝羊毛固醇合酶（LS）基因啟動(dòng)子序列。

2014年，采用單接頭連接PCR 法順利地分離到了甘蔗SPSⅢ基因5'側(cè)翼序列。序列提交GenBank，查詢登錄號(hào)KC422670，為公共數(shù)據(jù)庫(kù)中首次提交的甘蔗SPSⅢ基因5'側(cè)翼序列［23］。

2.2 雙鏈接頭PCR

雙鏈接頭PCR，基本原理是先用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，讓基因組片段能產(chǎn)生黏性末端，將末端配對(duì)的接頭和限制性片段連接，以其作模板，用接頭引物和已知序列特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可獲得包含側(cè)翼序列的目標(biāo)片段［24］。雙鏈接頭PCR在克隆基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或啟動(dòng)子方面得到廣泛應(yīng)用。

1994年，張國(guó)裕［25］用Sma I和EcoR V酶切的總DNA及雙鏈接頭介導(dǎo)PCR的染色體步行擴(kuò)增出大小分別約為4.5 kb和900 bp的條帶，選擇較長(zhǎng)的片段克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該技術(shù)成功克隆了青花菜脫氫抗壞血酸還原酶DHAR（dehydroascorbate reductase）上游的啟動(dòng)子序列。2002年，北京大學(xué)蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選用Bcl I消化油菜基因組，用雙鏈接頭PCR成功克隆出一條專一條帶條，長(zhǎng)約1.6 kb，經(jīng)測(cè)序表明該條帶與油菜質(zhì)膜水孔蛋白BnPIPI基因啟動(dòng)子區(qū)完全相同（54 bp）［26］。2006年，張國(guó)裕等通過(guò)該技術(shù)克隆了青花菜雄性不育相關(guān)基因BoDHAR上游序列并獲得了DHAR基因cDNA及基因全長(zhǎng)序列，且研究者表明，該技術(shù)的關(guān)鍵在于接頭的防自身擴(kuò)增的設(shè)計(jì)以及通過(guò)兩步高退火溫度的PCR擴(kuò)增來(lái)減少非特異性擴(kuò)增［25］。2009年，鐘秋月［27］利用改良的雙鏈介導(dǎo)接頭PCR技術(shù)，通過(guò)兩輪極高退火溫度的PCR擴(kuò)增，獲得番茄GGPS基因上游側(cè)翼序列。

2.3 載體接頭PCR

載體接頭PCR，是以基因組DNA的特異序列為引物和載體的通用引物擴(kuò)增目的片段［28］。王新國(guó)等［29］通過(guò)載體接頭的技術(shù)克隆了胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子。小鼠生長(zhǎng)釋放激素基因5'端側(cè)翼序列和矮牽P450基因的5'端側(cè)翼序列也通過(guò)該方法獲得［30，31］。

3種外源接頭介導(dǎo)PCR雖然在分離基因啟動(dòng)子與側(cè)翼序列等研究上得到廣泛應(yīng)用，但該方法仍然存在一些明顯的缺點(diǎn)：（1）由于DNA缺口是被直接檢測(cè)，故需要合適酶或化學(xué)方法對(duì)基因組進(jìn)行消化處理；（2）因?yàn)楸仨殞?duì)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，因此需要酸化DNA分子的5'端，使其具有可連接性；（3）參與平端連接只能在引物延伸進(jìn)行到模板鏈的末端之后，因此控制好PCR的延伸時(shí)間十分重要。

3 半隨機(jī)引物PCR

3.1 熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR法（TAIL-PCR）

熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR法是一種依據(jù)已知基因序列來(lái)得到未知序列的PCR擴(kuò)增技術(shù)，其原理為：通過(guò)高簡(jiǎn)并性引物結(jié)合目標(biāo)DNA；利用巢式PCR增強(qiáng)特異性、高、低溫超級(jí)PCR提高特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增效率，減少非特異性擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物作為下一輪模板，需進(jìn)行一定程度的稀釋，以降低非特異性模板的比例；將第2輪和第3輪PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳分析來(lái)判斷獲得的條帶是否為目標(biāo)帶。該技術(shù)由Liu和Whitter［32］于1995年首先研究并報(bào)道，TAIL-PCR利用已知序列設(shè)計(jì)嵌套式特異性，且特異性引物的退火溫度均大于65℃，而兼并引物含有15-16個(gè)堿基，退火溫度在45℃左右，其兼并性在65-256倍之間，因此特異與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)效率能通過(guò)溫度很好的控制。該技術(shù)的具體原理見(jiàn)圖2，具體的擴(kuò)增方法見(jiàn)Liu等［32］的方法。

目前，應(yīng)用該方法克隆了許多啟動(dòng)子片段，通常能克隆約0.2-2 kb的旁側(cè)片段。因此，該方法在克隆基因啟動(dòng)子的應(yīng)用中表現(xiàn)出簡(jiǎn)單、快速、高效等特點(diǎn)。如陳軍營(yíng)［34］利用改良的TAIL-PCR通過(guò)4輪PCR反應(yīng)，成功克隆到小麥PMH+-ATPase上游363 bp的旁側(cè)序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含該基因的啟動(dòng)子區(qū)域；財(cái)音青格樂(lè)［35］通過(guò)3輪PCR擴(kuò)增，分離得到300 bp的大豆β伴球蛋白α-亞基基因5'側(cè)翼序列，其中含有其啟動(dòng)子片段；韓兆雪等［36］成功克隆了青稞2個(gè)B組醇溶蛋白基因Hordein基因的上游分別為395 bp、396 bp的調(diào)控序列、嗜堿芽孢桿菌PB92堿性蛋白酶基因aprE的619 bp的啟動(dòng)子序列被成功克隆等［37］；邵彥春等［38］采用TAIL-PCR法，以紅曲霉色素突變株基因組為模板，獲得7個(gè)顯著片段，測(cè)序分析表明有一個(gè)片段為T(mén)-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，番薯的pal和 pgi基因的5'側(cè)翼序列和銀杏查爾酮合成酶基因全序列也是通過(guò)該方法克隆得到的［39，40］。

圖2 TAIL-PCR技術(shù)原理［33］

3.2 高效熱不對(duì)稱PCR（hi-TAIL-PCR）

Liu等［41］結(jié)合TAIL-PCR以及抑制PCR的原理，提出的新的側(cè)翼序列分析方法，該方法在兼并引物的結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)短，兼并性上做了優(yōu)化，且運(yùn)用了抑制PCR的原理，使得該方法比TAIL-PCR擴(kuò)增得到的片段更長(zhǎng)，更特異。與TAIL-PCR 相比，hi-TAILPCR用的具有更高簡(jiǎn)并性（2304）的簡(jiǎn)并引物（圖3），hi-TAIL-PCR由3輪PCR組成，第1輪由11次高特異性（Tm=65℃）擴(kuò)增、一次極低退火溫度（25℃）的低特異性擴(kuò)增、12次較高特異性（Tm=58℃）擴(kuò)增；第2輪由2次較高特異性（Tm=65℃）擴(kuò)增、2次高特異性（Tm=68℃）擴(kuò)增和1次較低特異性（Tm= 68℃）擴(kuò)增構(gòu)成的14個(gè)超級(jí)循環(huán)；第3輪由2次高特異性（Tm=68℃）擴(kuò)增和1次較低特異性（Tm= 68℃）擴(kuò)增構(gòu)成的6-7個(gè)超級(jí)循環(huán)。如Terauchi和 Kahl［42］從甘薯中克隆獲得苯丙氨酸氨裂解酶基因（Pal）啟動(dòng)子；蕓苔 BcMF21 基因ATG上游約779 bp的啟動(dòng)子都通過(guò)該技術(shù)克隆獲得［43-45］。侯娜等［46］采用hi-TAIL-PCR的方法，獲得了抗蟲(chóng)棉06N-119的外源DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。2013年，梁麗霞等［47］通過(guò)Hi-TAIL-PCR分離了轉(zhuǎn)SCK基因抗蟲(chóng)水稻科豐2號(hào)的插入載體插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列，并建立事件特異性檢測(cè)方法。

圖3 Hi-TAIL-PCR簡(jiǎn)并引物示意圖

3.3 限制位點(diǎn)PCR（Restriction-site PCR，RSPCR）

由于基因組的復(fù)雜性，很多側(cè)翼序列擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用受到很大程度的限制。1993年Sarkar［48］發(fā)明了RS-PCR，該方法中運(yùn)用到的酶切位點(diǎn)分別是Taq I、EcoR I、Sau3A和BamH I。這些酶切位點(diǎn)具有以下特點(diǎn)：在生物基因組中分布具有隨機(jī)性；出現(xiàn)的頻率較高；不帶重復(fù)序列。Upcroft等［49］利用RS-PCR技術(shù)，通過(guò)SacⅠ酶切消化鞭毛蟲(chóng)基因組，并用PCR方法成功擴(kuò)增出抗藥性相關(guān)基因5'側(cè)翼序列片段。在這一成功案例的啟示下，Ji等［50］設(shè)計(jì)了一種無(wú)需酶切連接反應(yīng)的染色體步移法，稱為“Restriction Site Extension PCR（RSE-PCR）”。

3.4 單寡核苷酸巢式PCR（single oligonucleotide nested PCR，SON-PCR）

SON-PCR由TAIL-PCR改進(jìn)而來(lái)，用嵌套式特異引物代替其兼并引物，且用特殊的PCR循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，見(jiàn)圖4。

Antal等［51］利用SON-PCR分離了兩基因（palH和pacC）的旁側(cè)序列。2006年，Guo等［52］研究者利用SON-PCR擴(kuò)增了2個(gè)光合多樣性基因位點(diǎn)。

圖4 SON-PCR擴(kuò)增未知序列示意圖［53］

4 其他方法

4.1 質(zhì)粒拯救法（plasmid rescue）

Plasmid rescue技術(shù)的原理如下：首先選擇合適的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，用連接酶連接環(huán)化消化產(chǎn)物，通過(guò)轉(zhuǎn)化方法將環(huán)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過(guò)菌落PCR等方法鑒定陽(yáng)性菌株，經(jīng)測(cè)序分析獲得側(cè)翼序列。該方法應(yīng)用范圍窄，篩選繁瑣，工作量大，只能作為染色體步移的補(bǔ)充工具。質(zhì)粒拯救法是一種經(jīng)典的分子生物學(xué)方法，目前該方法主要用于轉(zhuǎn)座子或自殺質(zhì)粒插入位點(diǎn)周圍序列的鑒定。細(xì)菌基因組大片段的克隆是細(xì)菌功能研究的一個(gè)難點(diǎn)，王玉飛［54］通過(guò)質(zhì)粒拯救法，將待克隆的基因一側(cè)序列連接到自殺載體上，構(gòu)建出打靶質(zhì)粒并將其整合到原細(xì)菌基因組上，通過(guò)酶切、自連及轉(zhuǎn)化后將自殺載體與需要克隆的目標(biāo)大片段一起拯救出來(lái)。質(zhì)粒拯救法除了在克隆細(xì)菌大片段上用得較為廣泛外，其在克隆已知基因的插入位點(diǎn)及其相關(guān)基因上大量應(yīng)用。鮑曉明［55］將轉(zhuǎn)座標(biāo)簽導(dǎo)入酵母，建立插入突變株庫(kù)，通過(guò)質(zhì)粒拯救法，在非生物脅迫的下篩選出抗逆相關(guān)基因。袁亮［56］通過(guò)TAIL-PCR與質(zhì)粒拯救PCR法再8個(gè)水稻突變體中快速分離水稻條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）Tn5致病相關(guān)基因，譚曉紅等［57］通過(guò)該技術(shù)獲得了來(lái)自誘捕載體整合位點(diǎn)附近的新基因。

4.2 PCR-walking法

PCR-walking法是利用DNA探針作為“誘餌”，依次釣出與探針有重疊區(qū)域的DNA片段，從而獲得目的基因的旁側(cè)序列，只將PCR與探針結(jié)合就提高了該方法的特異性，且免去建庫(kù)的繁瑣步驟，操作更加簡(jiǎn)明［58］。Sibert等［59］利用該技術(shù)克隆了tPA基因上游分別為1.8、4.5和0.9 kb的片段。

4.3 Sequence-base分離法

Sequence-base分離法通常通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得T-DNA與被研究基因之間的連接區(qū)域。該方法的關(guān)鍵在于引物，一端引物根據(jù)插入T-DNA的末端序列設(shè)計(jì)，該引物3'端向外，另一條擴(kuò)增引物根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)。擬藍(lán)芥actin基因的研究就用到了此方法。

4.4 連接介導(dǎo)PCR（Ligation-mediated PCR，LMPCR）

連接介導(dǎo)PCR法首先使用小的寡核苷酸接頭連接通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化的靶DNA片段，然后選擇與接頭結(jié)合的PCR引物來(lái)擴(kuò)增未知的靶片段。該方法在擴(kuò)增單側(cè)序列上應(yīng)用較多，此外，該方法在分離啟動(dòng)子和基因側(cè)翼序列也有應(yīng)用。

5 小結(jié)

綜上所述，基因側(cè)翼序列的分析方法很多，但均有其優(yōu)勢(shì)與不足（表1）。它們?cè)诜肿由飳W(xué)的研究中起重要的作用，并且隨著人們對(duì)生物體乃至基因的了解不斷深入，對(duì)基因的調(diào)控序列、側(cè)翼序列、啟動(dòng)子序列的研究將會(huì)越來(lái)越多，這些用于克隆側(cè)翼未知序列的技術(shù)將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用空間。目前對(duì)克隆側(cè)翼序列方法的研究從未停止過(guò)，因此，隨著分子生物物技術(shù)的不斷進(jìn)步，更多簡(jiǎn)單、高效的旁側(cè)序列克隆方法一定會(huì)不斷涌現(xiàn)。

表1 側(cè)翼虛列擴(kuò)增技術(shù)比較

［1］祁洋, 李燕, 王永智, 等. 擴(kuò)增 T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的方法及其應(yīng)用進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37（17）：7907-7908, 7927.

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Application Progress on Amplified Methods to Clone Flanking Sequence

PU Yuan-bo1GUO Cui2PING Shu-zhen2
（1. North Sichuan College of Preschool Teacher Education，Guangyuan 628017；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Amplifying the flanking sequence of genes plays an important role in molecular biology research. Until so far，the methods used to clone flanking sequence can been categorized into three groups：I-PCR，LA-PCR and TAIL-PCR. This paper briefly introduces the principle and present applications of these methods，which provides basis for researchers to choose more reliable and reasonable method.

flanking sequence；I-PCR；LA-PCR；TAIL-PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.010

2016-07-13

蒲遠(yuǎn)波，男，研究方向：生物教育，教育技術(shù)學(xué)；E-mail：wjdsz@vip.sina.com

平淑珍，女，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：pingszhen@126.com