衛(wèi)昱君王紫婷徐瑗聰，2許文濤，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京 100083）

致病性大腸桿菌現(xiàn)狀分析及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

衛(wèi)昱君1王紫婷1徐瑗聰1，2許文濤1，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京 100083）

致病性大腸桿菌是一類常見的致病菌，能夠通過多種感染渠道導(dǎo)致大腸桿菌感染疫情大規(guī)模爆發(fā)，其耐藥性的出現(xiàn)引起廣泛擔(dān)憂的同時(shí)，也促進(jìn)了新型抑菌方式的研究。目前大腸桿菌風(fēng)險(xiǎn)毒力因子作為致病的直接因素，備受國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注。大腸桿菌檢測(cè)技術(shù)也相應(yīng)獲得了較快的發(fā)展，相較傳統(tǒng)方法，新型的病原菌檢測(cè)技術(shù)能夠快速、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)目標(biāo)菌。結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀從大腸桿菌的污染情況、感染途徑及癥狀、耐藥性、風(fēng)險(xiǎn)毒力因子及檢測(cè)方法等方面綜述了大腸桿菌毒力評(píng)估及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展。

致病性大腸桿菌；現(xiàn)狀分析；檢測(cè)技術(shù)

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常被稱為大腸桿菌，為埃希氏菌屬的代表菌種。有鞭毛及動(dòng)力，為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。大腸桿菌為兼性厭氧菌，生長(zhǎng)溫度范圍是8-46℃，最適生長(zhǎng)溫度為37℃。其菌體抗原為“O”型抗原，鞭毛抗原為“H”型抗原，表面抗原為“K”型抗原，根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)的差異被分為180多種血清型別。致病性大腸桿菌是指能產(chǎn)生和攜帶腸毒素（LT、ST和SLT）、定居因子（CFA-Ⅰ和CFA-Ⅱ）、K抗原或類似物質(zhì)，以及帶有性菌毛、能分泌內(nèi)毒素的大腸桿菌。根據(jù)其不同的生物學(xué)特性可將致病性大腸桿菌分為6種類型［1］：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、 腸侵襲性大腸埃希桿菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhage E. coli，EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）及彌散黏附性大腸桿菌（DAEC）。

自1885年Esherich發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌以來，人們通常將其認(rèn)作腸道菌群中的正常組成部分。直到1982年，Riley和Remis等［2］通過對(duì)當(dāng)時(shí)美國(guó)密歇根州和俄勒岡州爆發(fā)的伴有腹瀉和腸出血的腸道疾病進(jìn)行調(diào)查研究，首次發(fā)現(xiàn)這種不同尋常的腸道疾病是由腸出血性大腸桿菌O157∶H7感染所引起的，人們才意識(shí)到大腸桿菌具有致病性。此后30多年，致病性大腸桿菌引發(fā)的食物中毒事件不勝枚數(shù)［3，4］，事件爆發(fā)后需要對(duì)污染的菌體進(jìn)行分析鑒定，明確其致病機(jī)制、耐藥情況等，才能對(duì)診斷做出有效的判定。因此探究致病性大腸桿菌的污染情況，能夠更加明確其容易侵染的基質(zhì)，為食物中毒事件的分析提供參考；總結(jié)致病性大腸桿菌的感染機(jī)制及癥狀能夠協(xié)助對(duì)病發(fā)狀態(tài)做出更加準(zhǔn)確的分析；分析耐藥性、致病因子及現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)能夠進(jìn)一步研究新型快檢技術(shù)以及核酸診斷藥物等，對(duì)治療具有重要意義?；诖?，本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀從污染情況、感染途徑及癥狀、耐藥性、風(fēng)險(xiǎn)毒力因子及檢測(cè)方法等方面綜述了致病性大腸桿菌的現(xiàn)狀分析及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展。

1 污染情況及限量情況

1.1 生物體污染

大腸桿菌O157所引起的疾病屬于人畜共患病，其中動(dòng)物為重要的傳染源，可于宰前感染［5］，較常見的有牛、雞、羊、狗、豬等，動(dòng)物的糞便中也常常能夠分離出O157∶H7大腸桿菌。其中以牛的帶菌率最高，可高達(dá)16%。

大腸桿菌常寄生于家畜及其奶中，或是被家畜糞便污染了的水中，以及用被污染了的水灌溉的作物中。人們食用了這些被污染過的食品，就可能引發(fā)腹瀉等癥狀。世界范圍內(nèi)爆發(fā)的嚴(yán)重大腸桿菌感染事件中，幾乎都是由食物傳播引起的。屠宰與加工中的污染，肉類帶大腸桿菌，在加工烹調(diào)過程中加熱不徹底或生吃都會(huì)導(dǎo)致進(jìn)食者感染［6］。

1.2 環(huán)境污染

大腸桿菌O157引起的環(huán)境污染主要在于土壤及水源。目前我國(guó)有關(guān)污水和禽畜糞便等隨意排放導(dǎo)致病原微生物污染環(huán)境的報(bào)道屢見不鮮［7］。腸道致病性微生物也是土壤中最為常見的病原菌，主要是通過糞肥的施用進(jìn)入土壤，Gagliardi等［8］通過研究發(fā)現(xiàn)土壤中的大腸桿菌O157∶H7還具有向地表和地下遷移的特性。

在我國(guó)，類似的污染也不時(shí)被報(bào)道。周淑玉等［9］報(bào)道稱，用污水灌溉的土壤中糞大腸桿菌的檢出率高達(dá)93.9%。朱奇等［10］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，使用被大腸桿菌及腸道致病菌污染的水源水灌溉導(dǎo)致2000年聊城上市蔬菜中，高達(dá)47%都受到不同程度的污染。由此可見，土壤與水源都是大腸桿菌污染傳播的重要媒介。葉小梅等［11］對(duì)江蘇省10家畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的排放物及周邊水、土樣進(jìn)行了分析，并以糞大腸菌群和沙門菌為指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10家養(yǎng)殖場(chǎng)中有9家廢物排放不合格，其中糞大腸菌群全部嚴(yán)重超標(biāo)，施于土壤的糞肥中糞大腸菌群數(shù)在105/g以上，此外，從中分離出的大腸桿菌能夠表現(xiàn)出多重耐藥性。

大腸桿菌極易通過土壤作物進(jìn)入人類食物鏈，引發(fā)大規(guī)模的傳染，因此保護(hù)灌溉水源及使用經(jīng)過無害化處理的糞肥也是生態(tài)環(huán)境保護(hù)的重要工作。

1.3 國(guó)內(nèi)外對(duì)于大腸桿菌的限量情況

針對(duì)致病菌的限量，不同的國(guó)家和地區(qū)有著相似標(biāo)準(zhǔn)，但食品微生物限量指示菌在不同的食品中標(biāo)準(zhǔn)限量值的差異很大［5］。歐盟對(duì)市場(chǎng)銷售的27類食品進(jìn)行了微生物限量規(guī)定。以總菌落數(shù)、大腸埃希氏菌、腸桿菌科指示菌限量，對(duì)水果、蔬菜及其制品、乳與乳制品、肉及肉制品，以及水產(chǎn)品、蛋制品的加工進(jìn)行了規(guī)范。歐盟對(duì)大腸埃希氏菌的限量采用三級(jí)采樣手段，在市場(chǎng)銷售的產(chǎn)品中僅限定了水產(chǎn)品，限量為n=1，c=0，m=230 MPN/100 g；在生產(chǎn)加工中限定的種類較多，規(guī)定在加工過程中果蔬制品及乳制品的限量為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g；生產(chǎn)過程結(jié)束時(shí)加工生鮮肉的限量為n=5，c=2，m=50 MPN/g，M=500 MPN/g；乳制品的限量為n=5，c=2，m=10 MPN/g，M=100 MPN/g；水產(chǎn)品限量為n=5，c=2，m=1 MPN/g，M=10 MPN/g。澳大利亞、新西蘭微生物通用標(biāo)準(zhǔn)中，共26類食品涉及到微生物限量，其中14類食品具有指示菌限量，其中對(duì)大腸埃希氏菌做出限量的食品共有9種，在這9種食品中，礦泉水、瓶裝水、定型包裝的冰及豆腐中均不得檢出大腸埃希氏菌。此外，干酪中要求n=5，c=1，m=10 MPN/g，M=100 MPN/g，未經(jīng)巴氏消毒牛乳中要求n=5，c=1，m=3 MPN/g，M=9 MPN/g，肉粉中要求n=5，c=1，m=3.6 MPN/g，M=9.2 MPN/g，雙貝殼類軟體動(dòng)物要求n=5，c=1，m=2.3 MPN/g，M=7 MPN/g。加拿大主要對(duì)果蔬、乳制品、即食食品中菌落總數(shù)、大腸菌群作出限量以進(jìn)行規(guī)范，22種具有指示菌限量的食品中，有15種對(duì)大腸桿菌做出限量。其中巴氏消毒奶制備的奶酪限定標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M= 2 000 MPN/g，非巴氏消毒奶制備的奶酪限定標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=2，m=500 MPN/g，M=2 000 MPN/g，嬰兒配方食品的限定標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=1，m＜1.8 MPN/g，M=10 MPN/g，面制品及焙烤食品的限定標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=2，m＜1.8 MPN/g，M=1 000 MPN/g，經(jīng)熱處理的發(fā)酵香腸的限定標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=1，m=10 MPN/g，M= 1 000 MPN/g，生的發(fā)酵香腸的限定標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=1，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g，即食類香腸、豆制品、調(diào)味品以及鮮果蔬等的限定標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g。

在我國(guó)于2010年新發(fā)布的15項(xiàng)乳制品產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中，針對(duì)11種產(chǎn)品規(guī)定了大腸菌群限量標(biāo)準(zhǔn)，分別是巴氏殺菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳、煉乳、乳粉、稀奶油/奶油/無水奶油、干酪、再制干酪、嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品以及嬰幼兒谷類輔助食品。在《GB29921-2013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》中，要求牛肉制品和生食果蔬制品中不得檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，其他無說明。香港只是在即食食品中規(guī)定了菌落總數(shù)、大腸埃希氏菌的限量，要求大腸埃希氏菌的檢出量為20-100 CFU/g，方可認(rèn)定為滿意級(jí)別。

2 大腸桿菌感染機(jī)制途徑與癥狀

2.1 感染途徑

根據(jù)眾多致病性大腸桿菌引發(fā)的食物中毒事件的分析可知，大腸桿菌的感染途徑有3種方式：食物傳播、水傳播、親密接觸傳播，其中食物傳播為最主要的感染途徑。在過去的40年內(nèi)，較為嚴(yán)重的大腸桿菌爆發(fā)事件均是通過食物傳播引起的，例如美國(guó)爆發(fā)的O157食物中毒基本都與漢堡包肉餡有關(guān)，1996年日本爆發(fā)的疫情與進(jìn)食牛肉、牛肝有關(guān)。另外，牛奶及其制品、生蔬菜、飲料等也常作為傳播介質(zhì)，這些都是通過食品進(jìn)行傳播的。通過水進(jìn)行傳播主要是由糞便污染導(dǎo)致的。此外，通過親密接觸感染者，并可產(chǎn)生二代污染，二代病人出現(xiàn)的癥狀通常較輕，出血性腸炎的發(fā)病率很低。

2.2 感染機(jī)制與癥狀

腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是一類能侵染小腸上皮細(xì)胞的病原菌，能夠在細(xì)胞上定植和增殖，并產(chǎn)生腸毒素。腸毒素是由質(zhì)?；蛉旧w編碼的，具有熱敏感或熱不穩(wěn)定的特點(diǎn)［12］。腸道感染患者常伴有輕微或嚴(yán)重腹瀉，這類病原菌的感染對(duì)腸道的營(yíng)養(yǎng)吸收、兒童的生長(zhǎng)發(fā)育甚至于全球的死亡率都有著深遠(yuǎn)的影響［13］。臨床上ETEC感染的癥狀通常為急性水樣腹瀉，有從溫和到嚴(yán)重多種程度。感染者也曾出現(xiàn)頭痛、發(fā)燒、惡心、嘔吐等癥狀。

腸侵襲性大腸桿菌（enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）是一類具有強(qiáng)致病毒力的病原菌，能夠感染較大兒童及成年人。常見的臨床癥狀主要是水樣腹瀉，少數(shù)人出現(xiàn)痢疾癥狀，通常是以食物或水源為媒介進(jìn)行感染的，也可經(jīng)過親密接觸傳播產(chǎn)生散發(fā)病例［14］。

腸致病性大腸桿菌（enteropathic Escherichia coli，EPEC）是在小腸上段寄居繁殖的一類病原微生物，EPEC在1945年就被認(rèn)定為致瀉大腸桿菌，主要引起嬰幼兒急性腹瀉或慢性腹瀉以及成人散發(fā)腹瀉。

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是一類毒力強(qiáng)、致病性高的病原菌，腸出血性大腸桿菌感染是一種人畜共患病，傳染源通常是帶菌者、感染病人及畜禽。其中牛的帶菌率最高，因此，牛肉、奶制品等動(dòng)物來源食品通常是主要的污染源。畜禽的糞便同樣會(huì)對(duì)環(huán)境中的土壤和水源產(chǎn)生污染使其污染范圍更加廣泛。其主要臨床癥狀為右下腹劇烈疼痛、腹瀉、便血，并伴有低熱或不發(fā)熱，病程7-10 d，少數(shù)病人特別是幼兒及老人可并發(fā)溶血尿毒綜合征，病情較為嚴(yán)重［15］。

腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）是Nataro等于1987年首次從智利腹瀉兒童的糞便中分離出的一種大腸桿菌，其特點(diǎn)是在組織培養(yǎng)過程中能以特有的“聚集樣”或“磚堆樣”的方式黏附于組織培養(yǎng)的上皮細(xì)胞株HEp-2，后被命名為腸聚集性大腸桿菌（EAEC或EAggEC）。其在侵染時(shí)不侵入腸上皮細(xì)胞，不產(chǎn)生LT、ST或是VT毒素，臨床表現(xiàn)為急性、持續(xù)性腹瀉和腹瀉，含粘液的水樣分泌性腹瀉是其典型表現(xiàn)，部分病人伴有發(fā)熱、嘔吐、腹痛，1/3病人有便血癥狀［16］。

彌散黏附性大腸桿菌（dispersion adhesion Escherichia coli，DAEC）的感染病例較為少見，該菌曾引起墨西哥兒童腹瀉從而被分離發(fā)現(xiàn)。

2.3 防范措施

針對(duì)致病性大腸桿菌的污染情況以及感染途徑，國(guó)家應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其監(jiān)測(cè)力度，掌握大腸桿菌的分布特征及疾病流行趨勢(shì)并建立早期預(yù)警機(jī)制，一旦發(fā)生疫情立即進(jìn)行診斷并及時(shí)預(yù)警，而后進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)測(cè)，及時(shí)防控，防止病情蔓延。中央還應(yīng)對(duì)地方進(jìn)行統(tǒng)一應(yīng)急管理，疫情發(fā)生后及時(shí)向民眾通報(bào)實(shí)施狀況。有關(guān)部門還需加強(qiáng)對(duì)食品和水源的管理，并確保禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)污染物進(jìn)行處理后排放。

個(gè)人也應(yīng)加強(qiáng)衛(wèi)生習(xí)慣以避免感染病原菌，應(yīng)保持雙手清潔，飲用煮沸的自來水，避免進(jìn)食未經(jīng)徹底殺菌的帶菌率高的食物。體質(zhì)較弱者及外出旅游者應(yīng)補(bǔ)食乳酸菌，以細(xì)菌間的拮抗作用防止大腸桿菌的侵染。

3 大腸桿菌耐藥性的相關(guān)研究

3.1 耐藥性與菌株血清型

近年來的研究表明，血清型大腸桿菌已產(chǎn)生較高的耐藥性，且相對(duì)于其他血清型，O141含有更多的獨(dú)立因子。此外近些年研究結(jié)果表明O6、O8、 O18三種血清型的菌株普遍對(duì)氨芐西林產(chǎn)生較高抗性［17］，抗生素的濫用是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性主要原因。

3.2 耐藥性與毒力基因

相較于國(guó)內(nèi)，國(guó)外對(duì)于毒力基因與耐藥性有更多研究。Ojo等［18］針對(duì)O157、O26、O91、O103、O111、O128、O145這7種產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌（shiga toxin Escherichia coli，STEC）進(jìn)行了一系列研究，結(jié)果表明STEC菌株攜帶的主要毒力基因?yàn)镾tx1、Stx2、EaeA及HlyA。STEC菌株對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、鏈霉素及氯霉素等耐藥率超過40%。Soufi等［19］以從突尼斯家禽肉中分離出來的166株大腸桿菌為研究對(duì)象，對(duì)其抗藥性表現(xiàn)和基因型及其耐磺胺基因的側(cè)翼區(qū)及整合子進(jìn)行了研究分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素、鏈霉素、萘啶酸、磺胺類及四環(huán)素都具有較高抗性，而對(duì)慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸及頭孢西丁的抗性則不夠顯著，分析可知大腸桿菌攜帶的耐藥基因主要為Bla（TEM）、Tet（A）/Tet（B）、Aph（3’）-Ia，Aac（6’）-Ib-cr、Aac（3）-II及CmlA。因此，大腸桿菌針對(duì)氨芐西林、四環(huán)素及鏈霉素表現(xiàn)出明顯的耐藥性。

3.3 耐藥性與動(dòng)物來源

根據(jù)近年來報(bào)道，禽畜肉及奶制品成為主要污染源。Ewers等［20］對(duì)禽致病性大腸桿菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，從已爆發(fā)疾病的病雞體內(nèi)分離出的121株菌株、從健康雞糞便中分離出的211株以及從它們所生存的環(huán)境中分離的35株菌株中，有高達(dá)79.2%-89.3%的菌株存在耐藥性。de Jong和Bywater等［21］研究了從雞、豬、牛中分離的大腸桿菌對(duì)幾種新型抗生素（頭孢吡肟、頭孢噻肟和環(huán)丙沙星）的耐藥力，根據(jù)研究資料顯示，雖然大腸桿菌對(duì)這些新型抗生素表現(xiàn)出了較低的抗性，但從雞體內(nèi)分離出的大腸桿菌對(duì)這些新型抗生素已經(jīng)出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象。研究進(jìn)一步表明，除歐洲國(guó)家外，相較于從牛源分離出的大腸桿菌，豬源、雞源分離出的通常具有更高的耐藥性及毒力基因。以上研究均說明不同動(dòng)物來源的大腸桿菌有著不同的耐藥性。

4 風(fēng)險(xiǎn)毒力因子的研究

致病性大腸桿菌具有多種毒力因子，主要分為黏附素和毒素兩種類別。

4.1 黏附素和定植因子

黏附素是存在于細(xì)菌表面的某種特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或糖脂成分，存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等結(jié)構(gòu)中，能夠使細(xì)菌黏附到宿主靶細(xì)胞上，對(duì)細(xì)菌的定植起著重要的作用。黏附素又分為菌毛和非菌毛黏附物質(zhì)［22］。大腸桿菌的17種黏附素主要存在于腸致病性大腸桿菌、產(chǎn)Vero毒素大腸桿菌（verocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC）中，少數(shù)存在于腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）中，主要的寄主是人、牛、豬、兔等（表1）。對(duì)黏附素的研究在大腸桿菌的致病機(jī)制及診斷疫苗研制等方面具有重要意義。

表1 大腸桿菌的黏附素及寄主

4.1.1 菌毛黏附素 首次在豬和牛中分離出來的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了菌毛和菌毛黏附素，后來又在人源大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)［23］。最典型的是由腸致病性大腸桿菌（EPEC）產(chǎn)生的F4菌毛［26］。Devriendt等［27］通過研究發(fā)現(xiàn)F4菌毛是影響細(xì)菌黏附腸上皮細(xì)胞及影響腸上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（cytokine）的主要因素。已有研究表明腸上皮細(xì)胞通過分泌一些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，F(xiàn)4菌毛通過抑制IL-6和IL-8這兩種細(xì)胞因子的分泌使感染了產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的仔豬產(chǎn)生嚴(yán)重的腹瀉現(xiàn)象。

4.1.2 非菌毛黏附素 Duguid等于1995年發(fā)現(xiàn)無菌毛的大腸桿菌也能造成紅細(xì)胞的聚集，非菌毛黏附素（Afa）家族由這些導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集的血凝素組成，編碼基因位于質(zhì)粒或染色體上［25］。Afa家族中的大腸桿菌可在Hep-2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或MDCK細(xì)胞周圍表現(xiàn)擴(kuò)散粘連，這類大腸桿菌成為彌散黏附性大腸桿菌（DAEC），在這個(gè)家族中，還有一類大腸桿菌雖然不表現(xiàn)擴(kuò)散粘連，但也可以聚集黏附到Hep-2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞上，具有這些特點(diǎn)的大腸桿菌都叫做腸黏附性大腸桿菌（EAEC）［28，29］。

4.1.3 外膜蛋白 外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）是一種非常重要的蛋白質(zhì)，廣泛存在原核生物的細(xì)胞外膜和真核生物的細(xì)胞器外膜中。大腸桿菌的黏附素也能存在于外膜蛋白中，這種外膜蛋白能夠引發(fā)細(xì)菌與真核細(xì)胞之間的黏附。EPEC和VTEC兩種病原菌的質(zhì)粒能夠編碼不同特異性的外膜蛋白從而使人和豬受到彌散黏附感染［26］。

4.1.4 定植因子 定植因子（colonization factors，CFs）是一類異質(zhì)性蛋白質(zhì)樣的表面結(jié)構(gòu)，目前已發(fā)現(xiàn)至少25種定植因子，多數(shù)由質(zhì)粒編碼。最常見的定植因子是CFA/A，包括其在內(nèi)的已鑒別的定植因子中大多數(shù)被認(rèn)為是糖蛋白偶聯(lián)物，除此之外仍有部分定植因子還未被鑒別［30］。

4.2 LEE毒力島及其主要編碼的致病基因

毒力島（pathogenicity islands）是編碼毒素、黏附素等一些毒力因子的毒力基因位于病原菌染色體上的特定區(qū)域［31］。EPEC的腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)（LEE）毒力島包含了與黏附和脫落損傷（AE損傷）及一些其他毒力因子相關(guān)的所有編碼基因，主要編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)（ESC或SEP）、分泌型蛋白質(zhì)（ESP）及其分子伴侶、外膜蛋白緊密素（EAE）和緊密素易位受體（TIR）等［32］。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)是病菌分泌毒力蛋白或向宿主細(xì)胞注入毒力蛋白的通道，由多組分蛋白復(fù)合體形成，其一系列基因位于LEE的左側(cè)。位于LEE右側(cè)的Esps則編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)所要分泌的蛋白質(zhì)。外膜蛋白緊密素（EAE）所有能引起AE損傷的病原菌都可檢測(cè)到的基因，或可檢測(cè)到其同源序列，是引起AE損傷的主要基因。Tir基因位于Eae基因前方，編碼一種成為宿主與致病菌結(jié)合橋梁的蛋白，是重要的體內(nèi)致病因子。

4.3 毒素

病原微生物產(chǎn)生的毒素具有多種類型。有些病原菌可以產(chǎn)生寡肽毒素，寡肽素可黏附于胞質(zhì)膜受體上并激活胞內(nèi)聯(lián)級(jí)反應(yīng)，從而干擾真核細(xì)胞新陳代謝，大腸桿菌可產(chǎn)生的寡肽毒素主要是耐熱腸毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素。有些病原菌產(chǎn)生AB毒素，這種毒素以A亞基為毒力中心，B亞基則使該毒素與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，兩個(gè)亞基共同組成AB毒素的編碼區(qū)域。有的產(chǎn)生一種細(xì)胞溶解素-RTX毒素，這種毒素可以使細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生縫隙，從而使得細(xì)胞溶解、死亡［33］。

5 國(guó)內(nèi)外大腸桿菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

5.1 大腸桿菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法

根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.3-2010）規(guī)定，現(xiàn)行的大腸桿檢測(cè)方法主要有兩種，大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法和大腸菌群平板計(jì)數(shù)法，也是最為傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。在MPN檢測(cè)法中，首先根據(jù)待檢菌在LST肉湯管中是否產(chǎn)氣來進(jìn)行初步判斷，不產(chǎn)氣則判斷為大腸桿菌陰性，產(chǎn)氣的進(jìn)行BGLB肉湯培養(yǎng)，若在BGLB肉湯中培養(yǎng)仍產(chǎn)氣則報(bào)告為大腸桿菌陽性，否則報(bào)告為大腸桿菌陰性，最后通過查MPN表計(jì)數(shù)。平板計(jì)數(shù)法是將10倍系列稀釋的菌液接種VRBA平板，計(jì)數(shù)典型可疑菌落，并接種可疑菌落于BGLB肉湯中，報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)驗(yàn)材料及步驟可參見《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。

5.2 傳統(tǒng)檢測(cè)方法的劣勢(shì)及發(fā)展趨勢(shì)

傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)且操作復(fù)雜，不適合進(jìn)行食品檢疫等大批量樣品的檢測(cè)。醫(yī)療中，如果檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)也可能會(huì)導(dǎo)致診治的延遲。因此，多年來相關(guān)研究人員一直致力于研究快速、靈敏、特異的大腸桿菌檢測(cè)方法。

5.3 新型檢測(cè)方法

5.3.1 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 主要包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫層析技術(shù)、量子點(diǎn)熒光探針技術(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）是指利用抗原抗體能夠特異結(jié)合的特性，使之產(chǎn)生顏色反應(yīng)從而定性定量的進(jìn)行分析。Ge等［34］建立了一種高靈敏度、高特異性的PCR-ELISA技術(shù)用于檢測(cè)大腸埃希氏菌O157∶H7以及其他產(chǎn)志賀毒素的食源性大腸桿菌。Galikowska等［35］利用噬菌體代替抗體，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，這種方法具有簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。

免疫層析技術(shù)是通過毛細(xì)管作用使抗原或抗體與已知抗原抗體的微孔濾膜載體相連接，通過標(biāo)記物進(jìn)行定性檢測(cè)，具有快速，適用范圍廣、穩(wěn)定易判斷等優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度稍顯遜色。Park等［36］應(yīng)用免疫層析技術(shù)對(duì)大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌進(jìn)行了檢測(cè)，其中大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)范圍是9.2×103-9.2×105CFU/mL。Yonekita等［37］開發(fā)了一款免疫層析試紙從115種肉制品中成功檢測(cè)出5株E.coli O26菌株，檢測(cè)范圍是2.2×103到1.0×105CFU/mL。Cui等［38］應(yīng)用膠體金免疫層析法結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)對(duì)大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行了快速檢測(cè)，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度低，檢測(cè)限達(dá)10 CFU/g。

量子點(diǎn)熒光探針技術(shù)通過激發(fā)使量子點(diǎn)使其具有熒光特性，后與相關(guān)抗體結(jié)合形成熒光免疫復(fù)合物，從而通過復(fù)合物的熒光強(qiáng)度測(cè)定目標(biāo)菌濃度。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于效率高、穩(wěn)定性好且具有較高的靈敏度。Mitchell等［39］在免疫磁珠和DNA上修飾量子點(diǎn)，形成免疫磁珠-DNA-量子點(diǎn)復(fù)合物，對(duì)大腸桿菌O157∶H7的EaeA基因進(jìn)行了特異性檢測(cè)，通過熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)后體系的熒光強(qiáng)度的大小來判定樣品中含大腸桿菌量的多少，該方法最低檢測(cè)限為49×10-15mol/L。Sanvicens等［40］建立了一種量子點(diǎn)熒光抗體陣列檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，最低檢測(cè)限為10 CFU/mL，相較于傳統(tǒng)的ELISA方法，這種方法將檢測(cè)限提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。

5.3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要是建立在PCR基礎(chǔ)上衍生出來的檢測(cè)方法。包括常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、基因芯片及新型核酸擴(kuò)增技術(shù)等。

5.3.2.1 PCR 常規(guī)PCR技術(shù)是在短時(shí)間內(nèi)對(duì)特定DNA序列進(jìn)行大量體外擴(kuò)增，后通過電泳技術(shù)完成特定序列的檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)是能夠快速進(jìn)行微量的檢測(cè)，且具有較高的靈敏度，但是容易產(chǎn)生假陽性。Sangdee等［41］針對(duì)腸桿菌基因重復(fù)序列（ERIC）設(shè)計(jì)引物用于大腸桿菌的檢測(cè)。該方法具有良好的特異性，檢測(cè)限100 CFU/ mL。

5.3.2.2 定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種定量方法，通過在反應(yīng)體系中加入特定熒光物質(zhì)（熒光探針或核酸染料），對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行跟蹤標(biāo)記，也可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析。該方法優(yōu)勢(shì)在于靈敏度較高，操作簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的定量分析。Wang等［42］針對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌的Tuf基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)便，短時(shí)間內(nèi)能從生牛奶中同時(shí)檢測(cè)出兩種目標(biāo)致病菌，其中大腸桿菌在102CFU/mL-106CFU/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。Kim等［43］針對(duì)大腸桿菌O157∶H7的EaeA基因設(shè)計(jì)了新引物和探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鮮切卷心菜中的大腸桿菌O157∶H7的定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)至1.53 CFU/mL。Khatami等［44］開發(fā)了一種基于熒光PCR的特異性雜交方法（FLASH-PCR）檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7中由STX編碼的Stx-1基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果相符，與后者相比檢測(cè)過程更為快速、靈敏、簡(jiǎn)單。

5.3.2.3 高通量PCR 高通量檢測(cè)技術(shù)是近幾年基于PCR技術(shù)發(fā)展起來的新技術(shù)，相比傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法，該方法解決了每次只能檢測(cè)一種或一類樣品的局限性，其具有反應(yīng)體系簡(jiǎn)單、自動(dòng)化操作程度較高、快速省時(shí)、無污染及診斷結(jié)果精確等特點(diǎn)。目前用于病原微生物鑒定的高通量檢測(cè)技術(shù)主要有：多重PCR技術(shù)、焦磷酸測(cè)序技術(shù)、二代測(cè)序、變性高效液相色譜分析技術(shù)和芯片技術(shù)等。

多重PCR是一種可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)菌或基因檢測(cè)的技術(shù)，在反應(yīng)體系中同時(shí)加入多種特異性引物即可擴(kuò)增出多種DNA片段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)速度快、特異性高及簡(jiǎn)便高效。缺點(diǎn)在于反應(yīng)體系中各種引物容易相互干擾，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Son等［45］針對(duì)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的Stx1、Stx2、Eae、EhxA及UidA五種毒力基因建立了多重PCR檢測(cè)方法，該方法有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)其毒力基因的分析更加便捷，同時(shí)設(shè)計(jì)探針實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。Gordillo等［46］針對(duì)大腸桿菌O157∶H7的FliCh7和 RfbE基因構(gòu)建了引物和探針，建立了雙重定量PCR技術(shù)用于肉制品的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示本方法的準(zhǔn)確度要優(yōu)于傳統(tǒng)方法，兩個(gè)基因的結(jié)果均具有良好的線性關(guān)系。

隨著大規(guī)?；蚪M學(xué)的興起，二代測(cè)序技術(shù)（新一代測(cè)序技術(shù)）也隨之產(chǎn)生。二代測(cè)序技術(shù)大多采用大型矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)，使用引物和DNA聚合酶或連接酶擴(kuò)展延伸核酸鏈。這種方法通過連續(xù)記錄光信號(hào)周期來獲取序列信息，可用于大規(guī)模的測(cè)序。市場(chǎng)上已有多種測(cè)序儀，如Illumina公司的Genome Analyzer及HiSeq 2000 系統(tǒng)，ABI公司的AB SoLid sequencer等。隨著2008年Helicos Biosciences公司的第一臺(tái)DNA分子測(cè)序儀的問世，基因組學(xué)迎來了新的發(fā)展時(shí)期，同時(shí)也為微生物檢測(cè)提供給了新的途徑。焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）技術(shù)是在20世紀(jì)90年代年發(fā)明的DNA序列分析技術(shù)，這種技術(shù)是由酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)發(fā)展出的，該反應(yīng)由4種酶（DNA聚合酶、三磷酸腺硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶）催化的同一反應(yīng)體系產(chǎn)生。該技術(shù)是在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，當(dāng)加入的這種dNTP能夠與模板進(jìn)行配對(duì)時(shí)，聚合酶就會(huì)使其連接到引物鏈上，形成磷酸二酯鍵并釋放出等量的焦磷酸基團(tuán)（PPi），通過檢測(cè)轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào)的PPi量來確定參與反應(yīng)中的核苷酸數(shù)目［47］。

雖然第二代測(cè)序技術(shù)在全球測(cè)序市場(chǎng)上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但新一代的測(cè)序技術(shù)又快速發(fā)展起來。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，被稱之為第三代測(cè)序技術(shù)。與前兩代相比最大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，并且在測(cè)序過程不需要PCR擴(kuò)增。SMRT技術(shù)以SMRT芯片為測(cè)序載體邊合成邊測(cè)序，通過堿基配對(duì)發(fā)出光的波長(zhǎng)與峰值來判斷插入的堿基類型。SMRT技術(shù)的測(cè)序速度達(dá)到每秒約10個(gè)dNTP，最大的劣勢(shì)就是測(cè)序錯(cuò)誤率比較高。納米單分子測(cè)序技術(shù)基于電信號(hào)的測(cè)序技術(shù)，DNA穿過特殊的納米孔時(shí)，通過監(jiān)測(cè)電荷變化從而鑒定所通過的堿基。第三代測(cè)序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點(diǎn)而開發(fā)的，它最大的特點(diǎn)是單分子測(cè)序，且能避免由于PCR擴(kuò)增造成的錯(cuò)誤，極大的提高了測(cè)序長(zhǎng)度，為微生物的測(cè)序分析提供了新的解決方法［48］。

變性高效液相色譜分析技術(shù)（denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC）是利用離子配對(duì)逆相層析的原理來分析核酸的檢測(cè)方法，這種方法利用離子配對(duì)試劑TEAA（triethylammonium acetate）在核酸非變性條件下與DNA的磷酸基團(tuán)離子配對(duì)，帶正電的TEAA會(huì)將帶負(fù)電的核酸包裹，并以其非極性的烷基端吸附在非極性的固定相上，DNA因此滯留于分離管柱中。DHPLC系統(tǒng)對(duì)DNA片段的分離是基于其長(zhǎng)度，而非序列，DNA鏈越長(zhǎng)，所帶磷酸基團(tuán)就越多，與之結(jié)合的TAEE就越多，其在柱內(nèi)保留的時(shí)間也就相應(yīng)增長(zhǎng)。William等［49］通過不同譜系39種細(xì)菌進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，成功地把DHPLC技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌菌種的鑒定。

基因芯片技術(shù)是指將與熒光標(biāo)記探針結(jié)合后的樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的寡核苷酸進(jìn)行雜交，通過熒光強(qiáng)度及分布進(jìn)行分析鑒定。Suo等［50］對(duì)基因芯片進(jìn)行了優(yōu)化用于檢測(cè)食源性致病菌，并對(duì)26種鮮肉樣品進(jìn)行了檢測(cè)。Kim等［51］對(duì)基因芯片技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，使得檢出假陰性概率幾乎為零。

5.3.2.4 等溫PCR 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)不僅使得反應(yīng)時(shí)間大大縮短，同時(shí)也簡(jiǎn)化了操作過程中所使用的儀器，大大滿足了快速簡(jiǎn)便的要求。目前，多種基于PCR的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)逐漸發(fā)展起來，如核酸序列依賴的擴(kuò)增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA），高溫解旋酶依賴性擴(kuò)增（thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA），鏈置換擴(kuò)增（strand-displacement amplification，SDA）， 環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增（loopmediated isothermal amplification，LAMP），滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA），重組聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase reaction，RPA）恒溫和嵌合引物引發(fā)的核酸擴(kuò)增（chimeric primerinitiated amplification of nucleic acids，ICAN）以及切刻內(nèi)切酶信號(hào)放大反應(yīng)（nicking endonuclease signal amplification，NESA）。這些技術(shù)在反應(yīng)速度、反應(yīng)溫度、工藝簡(jiǎn)化、對(duì)DNA或RNA的特異性、對(duì)酶的依賴、檢測(cè)范圍、引物設(shè)計(jì)及成本等方面都有著自身的優(yōu)缺點(diǎn)［52］。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種發(fā)展最為成熟的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)溫度為60-65℃，是DNA雙鏈復(fù)性和延伸的中間溫度，DNA在此溫度中處于一種單雙鏈的動(dòng)態(tài)平衡。依據(jù)6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，實(shí)現(xiàn)循環(huán)擴(kuò)增，具有高效的特異性和靈敏度［53］。Wang等［54］利用這種技術(shù)對(duì)生乳中的大腸桿菌O157進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合核酸染料實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度是 PCR 方法的 1 000 倍。Wang等［55］分別針對(duì)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的Stx1、Stx2和Eae基因設(shè)計(jì)引物，利用LAMP 技術(shù)對(duì)萵苣、菠菜樣品中的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌進(jìn)行了檢測(cè)，該方法的準(zhǔn)確性和靈敏度與定量PCR方法幾乎一致，其顯示了在食品中大腸桿菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面良好的應(yīng)用前景。

5.3.2.5 ERIC-PCR 腸桿菌屬間的共有重復(fù)序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）是Sharples等［56］于1990年在大腸桿菌發(fā)現(xiàn)的一組序列，它具有一段保守性很高的反向重復(fù)序列，序列長(zhǎng)約44 bp。雖然功能尚未研究清楚，但了解到其在基因組的分配比較均勻，且存在的位置和拷貝隨物種的不同而有差異。Versalovic［57］根據(jù)這一核心序列設(shè)計(jì)了反向引物，用于擴(kuò)增ERIC兩端之間的片段，建立了ERIC-PCR技術(shù)。由于在不同種屬或同種不同菌株之間的拷貝數(shù)和定位都不同，通常被用于細(xì)菌基因組圖譜的研究，用于細(xì)菌的分類與鑒定。在應(yīng)用該方法的過程中發(fā)現(xiàn)，ERIC結(jié)果的帶型和條帶的強(qiáng)弱易受PCR的反應(yīng)參數(shù)和電泳條件的影響，因此有人建議將所有的樣本在相對(duì)集中的時(shí)間用同一條件進(jìn)行分析，以保證其結(jié)果的可比性［58］。

5.3.3 死活菌檢測(cè)技術(shù) 傳統(tǒng)的死活菌檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)每個(gè)活菌可以在平板上長(zhǎng)出一個(gè)菌落來進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的，但該方法局限于檢測(cè)能形成菌落的細(xì)菌，并且需要將菌液濃度稀釋到一定程度，因此，于PCR的新型死活菌檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。目前發(fā)展出的主要有RT-PCR、EMA-PCR和PMA-PCR。

RT-PCR是以細(xì)菌中適當(dāng)?shù)膍RNA作為靶基因，由于細(xì)菌死亡過后mRNA會(huì)快速降解，不會(huì)像DNA一樣降解緩慢，所以運(yùn)用 RT-PCR 技術(shù)只能檢測(cè)到具有活性的細(xì)菌，從而避免了假陽性的出現(xiàn)［59］。EMA-PCR是根據(jù)疊氮溴乙錠（ethidiummonoazide bromide，EMA）能夠選擇性地進(jìn)入死細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)并與DNA發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合從而抑制DNA的PCR擴(kuò)增，因此只有活菌能夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增［60］。Shi等［61］對(duì)EMA的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括體系的溫度、pH、滲透壓，并記錄了EMA-qPCR 的檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)EMA染料進(jìn)入死菌并與之核酸結(jié)合時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)被抑制。研究還發(fā)現(xiàn)光的存在可以推動(dòng)EMA與DNA的結(jié)合。優(yōu)化后EMA的使用濃度為10 μg/mL，光照時(shí)間為20 min，加熱可以使不同狀態(tài)的細(xì)胞都能夠與EMA充分結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行85℃滅活35 min后，EMA-qPCR 即無法檢出活菌，說明了這種檢測(cè)方式的有效性。高滲透壓（≥4%）會(huì)對(duì)EMA-qPCR產(chǎn)生抑制，且滲透壓越高，抑制效果越明顯。當(dāng)滲透壓達(dá)到8%時(shí)，EMA-qPCR擴(kuò)增出的菌數(shù)量急劇減少。將細(xì)胞在不同的pH溶液中處理后再用EMA處理發(fā)現(xiàn)，pH從1升高到5時(shí)，其Ct值顯著增加，pH大于5以后無明顯變化，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)pH為3時(shí)，細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)開始下降。用LB培養(yǎng)基對(duì)已經(jīng)損傷酸化了的細(xì)胞進(jìn)行40 min孵育，損傷的細(xì)胞即可復(fù)原且EMA不能進(jìn)入到其內(nèi)部。PMA-PCR是對(duì)于EMA-PCR的一種改進(jìn)方法，由于疊氮溴化乙錠（EMA）具有細(xì)胞毒性，使得EMAPCR應(yīng)用受限，因此，選用PMA來代替EMA進(jìn)行死活菌檢測(cè)可以有效擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，如臨床醫(yī)學(xué)、食品安全等領(lǐng)域［62］。

5.3.4 其他新型檢測(cè)技術(shù)

5.3.4.1 紅外光譜技術(shù) 紅外光譜技術(shù)主要用于測(cè)定微生物的傅里葉變換紅外光譜來獲得微生物及其生物大分子結(jié)構(gòu)的信息，由此鑒定微生物種類及狀態(tài)。慈云祥等［63］利用紅外光譜技術(shù)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及谷氨酸菌進(jìn)行了研究，大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間不同、微生物含量不同對(duì)FTIR圖譜沒有明顯影響，并且測(cè)定出大腸桿菌的吸收帶波數(shù)為1 080和1 238 cm-1。Siripatrawan等［64］利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法定性、定量地對(duì)大腸桿菌ATCC25922及大腸桿菌K12兩種菌株進(jìn)行了分析檢測(cè)。

5.3.4.2 生物傳感器技術(shù) 傳感器分為3種類型：物理傳感器、化學(xué)傳感器及生物傳感器。目前用于微生物快速檢測(cè)的傳感器技術(shù)主要有電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器等。電化學(xué)傳感器是微生物利用低電導(dǎo)率的大分子物質(zhì)進(jìn)行代謝，使其分解物帶有一定電荷，因此電導(dǎo)率發(fā)生變化，將電信號(hào)放大后記錄其變化即可對(duì)微生物量進(jìn)行分析。此方法具有快速廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。光學(xué)傳感器是利用微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物使預(yù)先加入的指示劑變色，由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)其顏色變化，找到突變點(diǎn)時(shí)間從而確定微生物的數(shù)量。

在各種類型的傳感器中，生物傳感器是最具優(yōu)勢(shì)的一類，它具有敏感性、專一性，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，且具有時(shí)效性。生物傳感器可與納米材料結(jié)合，用于測(cè)定核酸、酶、抗體、噬菌體甚至整個(gè)細(xì)胞。一種具有高特異性和敏感性的RNA生物傳感器被構(gòu)建用于檢測(cè)具有活性的大腸桿菌，用mRNA（ClpB）基因構(gòu)造的基于NASBA的生物傳感器可用于對(duì)活性大腸桿菌進(jìn)行定性和定量［65］。Varshney等［66］構(gòu)建了一種電阻生物傳感器，用于鑒定具有活性的大腸桿菌O157∶H7，如果細(xì)菌生長(zhǎng)，就會(huì)監(jiān)測(cè)到有電阻產(chǎn)生。Chang 等［67］利用EMA構(gòu)造了一種微流控平臺(tái)，用于檢測(cè)區(qū)分有無活性的大腸桿菌，采用納米金探針對(duì)活性細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)，并使得具有生物活性的細(xì)胞得以擴(kuò)增，這是第一次在同一微流控平臺(tái)上對(duì)活性細(xì)菌進(jìn)行這兩項(xiàng)連續(xù)的操作。

側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)（lateral flow testsL，F(xiàn)T）及其試紙條已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室的診斷工具，是一種基于紙張的生物傳感器，這種技術(shù)具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，不需要專業(yè)的技術(shù)或復(fù)雜的儀器。這種試紙條通常被膠體金、乳膠、碳、磷、單鏈核酸等標(biāo)記，最常見的是膠體金粒子試紙條。目前，LFT被認(rèn)為具有高效檢測(cè)細(xì)菌的巨大潛力，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等都可以用這種試紙條進(jìn)行快速檢測(cè)。

除了傳統(tǒng)的生物傳感器，一些新型的傳感器也被構(gòu)建出來用于檢測(cè)一些特定的細(xì)菌。Li等［68］構(gòu)建出了一種用于檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7 的新型傳感器，這種傳感器采用了一種由二茂鐵與抗菌肽相組成的薄膜，其上的馬加寧抗菌肽為生物識(shí)別元件。Chan等［69］基于免疫傳感器研究出一種用于檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的生物功能磁珠，可用于在納米多孔氧化鋁膜上進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞濃度的測(cè)定，這種傳感器具有高度的敏感性。

5.3.4.3 適配體 適配體是通過指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù)從體外篩選得到的一類單鏈寡核苷酸，能夠特異性的與靶分子結(jié)合并具有較高的親和性，是由Ellington和 Tuerk于1990年首次提出的［70-72］。適配體與靶分子的特異性結(jié)合基于其單鏈結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的多樣性，高親和性基于核酸分子間的堿基互補(bǔ)配對(duì)、靜電作用、氫鍵以及其自身的適應(yīng)性折疊。人們利用基于細(xì)胞層面的SELEX技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種僅結(jié)合于E. coli O157∶H7血清型菌株細(xì)胞表面的一種RNA適配體，該適配體還具有核酸酶抗性，這種在適配體可用于大腸桿菌O157∶H7菌株的特異性鑒別。化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）是一類曾引起過許多嚴(yán)重臨床疾病的致病菌，是A型鏈球菌（group A Streptococcus，GAS）的一種，目前發(fā)現(xiàn)一種能夠選擇性識(shí)別10種主要A型鏈球菌的DNA適配體序列，可用于A型鏈球菌的特異性檢測(cè)。

6 展望

目前，國(guó)內(nèi)外大腸桿菌的疫情爆發(fā)依然時(shí)有發(fā)生，究其根本主要還是通過食物傳播。因此，大腸桿菌在分析、診斷、治療等各個(gè)方面均有待進(jìn)一步的研究。隨著外界環(huán)境的影響，可能會(huì)引發(fā)大腸桿菌基因的變化，如基因突變、單核苷酸的多態(tài)性等，因此在今后的研究中，需要將研究重點(diǎn)向基因組、尤其是毒力基因的分析方面進(jìn)行拓展，為大腸桿菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供更加可靠的理論基礎(chǔ)。隨著生物技術(shù)的大力發(fā)展，對(duì)于大腸桿菌的新型檢測(cè)方法不斷被開發(fā)應(yīng)用，但快速、特異、靈敏、高通量仍然是新型檢測(cè)方法開發(fā)需要繼續(xù)改進(jìn)方向，迎合企業(yè)及政府等現(xiàn)場(chǎng)篩查檢測(cè)的需求。目前研究重點(diǎn)均是圍繞檢測(cè)技術(shù)展開，因此在今后的研究中，需要將重點(diǎn)向?qū)ふ倚碌囊志椒ㄟM(jìn)行拓展，保證大腸桿菌的有效治療。

目前大量抗生素的使用使病原菌變得更加耐藥，為了防止動(dòng)物感染病原菌，飼料中添加的大量抗生素最終使食用這些動(dòng)物的人類產(chǎn)生耐藥性，針對(duì)此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)病原菌的監(jiān)控以及抗生素類用藥的管理。此外，對(duì)于大腸桿菌新毒力因子的挖掘以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究也應(yīng)繼續(xù)拓寬、深入，掌握致病機(jī)理能夠方便人們針對(duì)不同的致病原因?qū)で蟾佑行е委煼桨浮?/p>

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Current Situation Analysis and Detection Techniques of Pathogenic Escherichia coli

WEI Yu-jun1WANG Zi-ting1XU Yuan-cong1，2XU Wen-tao1，2
（1.College of Food Science & Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；2. The Supervision，Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms，Ministry of Agriculture of P. R. China，Beijing 100083）

Pathogenic Escherichia coli is one of the most common pathogenic microorganisms. This kind of pathogen spreads through a variety of ways and its infection has caused many food safety accidents in the world. Though the emergence of its antibacterial resistance has raised concern，it also facilitates institutions and researchers to design new bacteriostatic methods. As direct pathogenic factor，E. coli risk virulence factor has drawn much attention by researchers. Also the technology of detecting E. coli developed rapidly too. Compared to traditional methods，advanced detection techniques for pathogens are fast，specific and accurate in determination of the pathogen. Based on the research status in domestic and abroad，this article introduces the research progress on assessments of E. coli virulence and techniques of detecting E. coli from several aspects such as the situation of E. coli’s contamination，infection route，symptoms，antibacterial resistance and its risk virulence factors，as well as detection techniques.

pathogenic E.coli；current situation analysis；detection techniques

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.011

2016-08-25

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2012AA101606），北京市科技新星計(jì)劃（XX2014B069）

衛(wèi)昱君，女，本科；E-mail：weiyj95@foxmail.com

許文濤，男，副教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品病原微生物的檢測(cè)技術(shù)和致毒機(jī)制、轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)和食用安全性評(píng)價(jià)等；E-mail：xuwentaoboy@sina.com