張 玉, 倪紅偉， 隋 心,2， 徐明怡， 冷海楠

(1.黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

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小葉章組培快繁體系的研究

張 玉1, 倪紅偉1， 隋 心1,2， 徐明怡1， 冷海楠1

(1.黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

以野生小葉章幼嫩莖段為外植體，研究MS對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究不同種類及濃度配比激素對(duì)叢生芽增殖和生根的影響。表明小葉章莖段用75%酒精消毒30 s，再經(jīng)0.01 L汞溶液浸泡4 min的滅菌效果較好；莖段直接誘導(dǎo)不定芽的最適宜培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L+TDZ 0.1 mg/L NAA，誘導(dǎo)率可達(dá)87.44%；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA，增殖系數(shù)可達(dá)5.76；生根最適宜培養(yǎng)基為0.5MS+2.0 mg/L NAA，生根率為93.33%。

小葉章； 莖段； 組織培養(yǎng)； 快速繁殖

0 引 言

小葉章(CalamagrostisangustifoliaKom.)是禾本科拂子茅屬多年生根莖型草本植物，我國(guó)主要分布于東北、華北、內(nèi)蒙古等地的平原低洼濕地，是三江平原典型草甸、沼澤化草甸的建群植物和優(yōu)勢(shì)植物[1-4]。小葉章具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值,例如在東北草地地區(qū)其飼用價(jià)值僅次于羊草，同時(shí)它也是很好的水土保持植物和造紙等輕工業(yè)的良好原料[5]。近年來(lái)，由于三江平原大量濕地開(kāi)墾成農(nóng)田，使得濕地生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，濕地生物多樣性降低，小葉章的種群受到嚴(yán)重的破壞，生態(tài)功能下降。因此，對(duì)小葉章的人工繁殖可以減少對(duì)野生資源的破壞，對(duì)于研究小葉章生理學(xué)、分子生物學(xué)具有重要的意義。

目前，對(duì)于小葉章的研究主要集中在種群特征[6-7]、生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)[8]、溫室氣體排放[9]及土壤物質(zhì)循環(huán)等方面[10]，而關(guān)于小葉章的離體培養(yǎng)研究目前為止還沒(méi)有，僅有同屬的拂子茅是以莖尖為外植體材料，誘導(dǎo)獲得愈傷組織，然后愈傷組織再分化成芽的方式進(jìn)行的[11]。而利用植物離體器官直接再生不定芽具有培養(yǎng)時(shí)間短，不容易發(fā)生變異等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。鑒于此，本研究以小葉章幼嫩莖段為外植體，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選組織培養(yǎng)條件，通過(guò)直接誘導(dǎo)不定芽、繼代增殖、生根和煉苗移栽等過(guò)程，從而建立小葉章的組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，為小葉章的資源保護(hù)、基因工程研究提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小葉章采自黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所三江平原濕地生態(tài)定位研究站——洪河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)(47°49′N， 133°40′E，年均氣溫1.9 ℃，年均降水量500～650 mm)。選取當(dāng)年新生無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)健壯的幼嫩莖段作為外植體。本試驗(yàn)室內(nèi)研究部分在黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，擴(kuò)繁部分在本所溫室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基條件

以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L和瓊脂6 g/L，調(diào)整pH 5.5～5.8，配制分裝后于121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光照16 h/d。

1.2.2 外植體處理

將采集的莖段去除葉片后，剪成4～6 cm長(zhǎng)的莖段，用自來(lái)水沖洗10 min左右，再用適量的洗潔精水沖洗2遍，自來(lái)水沖洗干凈后置于超凈工作臺(tái)中，用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2次；用0.1%HgCl2溶液消毒2、4、6、8、10、15 min，期間不斷搖晃，無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，于消毒過(guò)的濾紙上切除上下切口處的褐化部分，將材料切成1.5～2.0 cm、帶1或2個(gè)葉腋的莖段并吸干莖段上的水分，接種于初代培養(yǎng)基上。比較0.1%HgCl2不同消毒時(shí)間的滅菌效果，7 d后觀察污染情況，14 d后統(tǒng)計(jì)污染率、成活率。

污染率(%)=(污染數(shù)/接種數(shù))×100%

成活率(%)=(芽誘導(dǎo)直接成苗率/接種未污染芽數(shù))×100%

1.2.3 初代培養(yǎng)

將消毒好的小葉章帶腋芽莖段接種在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS，同時(shí)添加不同種類和濃度的激素。按照表1設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平，采用L16(45)正交表設(shè)計(jì)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見(jiàn)表2)。每瓶一個(gè)莖段，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次。4周后,腋芽萌發(fā)并伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成綠梢，獲得的這些無(wú)菌苗用于進(jìn)一步進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)的材料。

腋芽誘導(dǎo)率(%)=(萌芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平 mg/L

表2 按正交表設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基配方 mg/L

1.2.4 繼代增殖

采用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置KT(0.05，0.1 mg/L)、6-BA(0.1，0.5 mg/L)、TDZ(0.05，0.1 mg/L)、NAA(0.1，0.2 mg/L)四因素二水平共8個(gè)處理。每處理10瓶，每瓶接種1個(gè)芽叢，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)=培養(yǎng)30 d后的總芽數(shù)/接種時(shí)的芽數(shù)，并記錄增殖芽生長(zhǎng)情況。

1.2.5 生根培養(yǎng)

以0.5MS作為生根培養(yǎng)基，當(dāng)繼代苗長(zhǎng)到約2 cm高、具2～4片小葉時(shí)，將植株從基部剪下，轉(zhuǎn)接至添加不同濃度(0，0.1，0.5，1.0，2.0 mg/L)的NAA生根培養(yǎng)基中，每瓶接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次，并計(jì)算生根率和平均每株根數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.5分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的消毒處理

從表3可以看出,隨著0.1% HgCl2消毒時(shí)間的增加，外植體污染率下降，而成活率先升后降，4 min時(shí)達(dá)到最高，71.6%，當(dāng)消毒15 min時(shí)，外植體全部死亡，所以升汞溶液消毒的適宜時(shí)間為4 min。

表3 消毒時(shí)間對(duì)小葉章莖段滅菌效果的影響

2.2 初代培養(yǎng)

從表4可以看出，小葉章莖段在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，莖段腋芽不萌發(fā)。在添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率為5.56%～87.44%。其中8號(hào)培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率最高，為87.44%，培養(yǎng)效果較好(圖1(b))；其次是7號(hào)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)率為59.89%。從各因素水平均值k的大小，比較四因素各水平求得最優(yōu)水平組合仍為8號(hào)培養(yǎng)基；由R值大小可知，各因素不同水平對(duì)小葉章莖段腋芽誘導(dǎo)率的影響大小為：KT>TDZ>6-BA >NAA。對(duì)誘導(dǎo)率反正弦轉(zhuǎn)換值方差分析(見(jiàn)表5)，結(jié)果表明，KT、TDZ、6-BA和NAA濃度對(duì)小葉章莖段腋芽誘導(dǎo)率都有顯著影響(P<0.05)，且8號(hào)培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基的差異顯著(見(jiàn)表4)。

2.3 繼代增殖

將初代培養(yǎng)的腋芽切下接到繼代增殖培養(yǎng)基中，由表6可以看出，影響增殖系數(shù)的主要因素是6-BA>KT>NAA>TDZ。由方差分析表7可知，除了TDZ對(duì)小葉章的增殖影響不顯著(P>0.05)外，KT、6-BA、NAA對(duì)增殖系數(shù)的影響均達(dá)到顯著水平。綜合以上因素，7號(hào)培養(yǎng)基為最佳。

表4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小葉章莖段初代培養(yǎng)的影響

注：K1、K2、K3、K4分別代表不同水平 4次誘導(dǎo)率之和；kl、k2、k3、k4分別代表不同水平均值誘導(dǎo)率；R代表平均極差(R=最大均值-最小均值), 同一列中不同字母表示數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)

表5 正交設(shè)計(jì)方差分析表(完全隨機(jī)模型)

2.4 生根培養(yǎng)

由表8可見(jiàn)，不同濃度NAA對(duì)小葉章組織培養(yǎng)苗生根率的影響顯著，其中，0.5MS+2.0 mg/L NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，生根率最高，達(dá)到93.33%，根多且粗壯，植株生長(zhǎng)健壯(圖1(g))。

表6 正交試驗(yàn)不同培養(yǎng)基小葉章的增殖系數(shù)

(a) 剛接種的無(wú)菌外植體，(b) 莖段腋芽萌發(fā)，(c)、(d) 增殖培養(yǎng)，(e)、(f) 芽苗生根，(g)、(h) 生根苗移栽

表8 不同NAA濃度對(duì)小葉章生根培養(yǎng)的影響

3 討 論

在植物組織培養(yǎng)中，外植體無(wú)菌體系的建立是很關(guān)鍵的一步。其中，適當(dāng)?shù)南緯r(shí)間和合適的消毒劑是非常重要的。本試驗(yàn)選取當(dāng)年生長(zhǎng)健壯的小葉章幼嫩莖段為外植體，在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用2%的次氯酸鈉消毒效果較差，污染率極高。而使用0.1%的升汞，污染率大幅降低，成活率較高，這與張娟等[11]在拂子茅莖尖作為外植體中的研究基本相似。所以，本試驗(yàn)中篩選出最佳的消毒處理方案為75%酒精30 s+0.1% HgCl24 min，該條件下植株成活率最高。

在植株分化過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比值，能調(diào)控植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和定向分化[14]。對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，為了達(dá)到腋芽萌發(fā)或者芽增殖的目的，采用一定濃度的單一細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，就可以得到較好的效果。孫清榮等[15]在歐洲李的組織培養(yǎng)與快速繁殖中發(fā)現(xiàn)MS+BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L增殖效果較好，紅歌等[16]在單頭亞菊組培快繁技術(shù)研究中提出MS+0.75 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，的組合就能得到較高的增殖率，但在小葉章組培試驗(yàn)中，用單一的細(xì)胞分裂素，分化率低，筆者猜測(cè)只有用一定濃度兩種或兩種以上的細(xì)胞分裂素結(jié)合較低濃度的生長(zhǎng)素，才有可能找到最佳分化配方。因此，本試驗(yàn)采用6-BA、KT、TDZ及NAA組合試驗(yàn)，結(jié)果表明，MS+KT0.05 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L為最適外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)87.44%。

在生根培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，生根培養(yǎng)基中適量降低無(wú)機(jī)鹽的濃度能有效促進(jìn)生根，因此，采用1/2MS作為基本培養(yǎng)基，小葉章的生根效果更好，這與王雪芳[17]，趙智燕[18]在小花堿茅和高羊茅生根試驗(yàn)中的結(jié)果相一致。預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用IBA不能使小葉章組培苗生根，在培養(yǎng)基中加入2.0 mg/L的NAA后，生根效果最好，生根率明顯提高，這與吳玲利等[19]在白木通生根過(guò)程中的研究相一致，說(shuō)明NAA對(duì)小葉章的生根有明顯的促進(jìn)作用。

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究通過(guò)小葉章組培快繁各個(gè)階段最佳培養(yǎng)基的篩選，建立穩(wěn)定而高效的小葉章組織培養(yǎng)與快速繁殖體系，為小葉章的遺傳改良提供技術(shù)支持，有利于促進(jìn)小葉章基因工程的深度開(kāi)發(fā)。

[1] 倪紅偉. 三江平原典型草甸小葉章種群地上器官生物量及其分層結(jié)構(gòu)[J]. 植物研究，1996，16(3)：356-362.

[2] 倪紅偉，臧淑英，高亦珂.三江平原沼澤化草甸小葉章種群地上生物量及其生長(zhǎng)速率季節(jié)動(dòng)態(tài)的研究[J]. 植物研究，1996，16(4)：122-128.

[3] 倪紅偉，張 興，賈 利. 三江平原典型草甸小葉章種群地上生物量動(dòng)態(tài)[J]. 植物研究，1998，18(3)：72-79.

[4] 王建波，倪紅偉，付小玲.大氣CO2濃度升高對(duì)小葉章光合色素含量和光合參數(shù)的影響[J]. 國(guó)土與自然資源研究，2013(1)：82-83.

[5] 鐘章成, 曾 波. 植物種群生態(tài)研究進(jìn)展[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2001(2)： 230-236.

[6] 高福元，石福習(xí). 基于不同零模型的三江平原沼澤濕地主要物種小尺度點(diǎn)格局分析[J].生態(tài)學(xué)報(bào)， 2015，35(7)：2029-2037.

[7] 倪紅偉，郭亞勝，吳海一. 小葉章種群分布格局的分形特征Ⅱ信息維數(shù)與關(guān)聯(lián)維數(shù)[J]. 植物研究，2000，20(3)：351-354.

[8] 孫志高，劉景雙，楊繼松. 三江平原小葉章濕地種群生物量結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)與生長(zhǎng)速率分析[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(2)： 21-29.

[9] Zhang L，Song C，Zheng X，etal. Effects of nitrogen on the ecosystem respiration，CH4and N2O emissions to the atmosphere from the freshwater marshes in northeast China[J]. Environmental Geology. 2007，52(3)：529-539.

[10] Wang J，Zhu T，Ni H，etal. Effects of elevated CO2and nitrogen deposition on ecosystem carbon fluxes on the Sanjiang plain wetland in Northeast China[J]. PLo S One, 2013, 8(6): e66563.

[11] 張 娟，韓 蕾，巨關(guān)升.拂子茅組培再生體系的建立[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(11)：123-125.

[12] 陳怡佳，崔媛媛，張曉明. 美國(guó)紅葉紫薇的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2015，51(6)： 882-886.

[13] 林 青，吳玲利，張 琳，等. 油桐葉柄高效直接再生體系的建立[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2014，50(10)：1608-1612.

[14] 李偉玲，劉 君，于景金，等.海濱雀稗再生體系的建立[J]. 中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2013，35(4)：19-24.

[15] 孫清榮，王金政，薛曉敏，等. 歐洲李‘紅艷1號(hào)’的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2015, 51(7): 1024-1028.

[16] 紅 歌，吳瀟波，謝 菲，等. 單頭亞菊的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2013，49(12)：1359-1362.

[17] 王雪芳，王春梅，張金林，等.小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系的建立[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2014，23(6)： 355-360.

[18] 趙智燕，潘俊松，何亞麗，等.兩個(gè)高羊茅無(wú)性系的營(yíng)養(yǎng)器官組織培養(yǎng)及再生體系的建立[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(5)：168-175.

[19] 吳玲利，柯鑌峰，龔 春，等.白木通組織培養(yǎng)及快速繁殖[J].植物生理學(xué)報(bào)，2015，51(6)： 903-908.

Tissue Culture and Rapid Propagation of Calamagrostis Angustifolia

ZHANGYu1,NIHong-wei1,SUIXin1,2,XUMing-yi1,LENGHai-nan1

(1. Institute of Natural Resources and Ecology, HAS, Harbin 150040, China; 2. Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

In order to provide experimental and technological basis for Calamagrostis Angustifolia community propagation, protection and sustainable development, this study explored the techniques of in vitro propagation of Calamagrostis Angustifolia using stem segments, and MS(as basal medium) to find the most suitable time for surface sterilization of explants. The effects of different plant growth regulators on buds multiplication and root formation were studied by orthogonal design method. It found that the best sterilization method for Calamagrostis Angustifolia was to soak explants into 75% alcohol for 30s and 0.1% HgCl2 for 4 min after pretreatment. The best medium for the buds induction was MS+KT0.05 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L, by which the induction rate was 87.44%; the optimal medium for subculture was MS+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA, by which the multiplication coefficient was 5.76; the best rooting medium was 1/2MS+2.0 mg/L NAA, by which the rooting rate was 93.33%.

Calamagrostisangustifolia; stems; tissue culture; rapid propagation

2015-11-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31470019)；黑龍江省財(cái)政應(yīng)用技術(shù)專項(xiàng)(STJB16-01)；黑龍江省科學(xué)院創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目

張 玉(1983-)，女，黑龍江東寧人，碩士, 助理研究員,主要從事分子生態(tài)方向研究。

Tel.：15124502196；E-mail：lengning1029@126.com

倪紅偉(1964-)，男，黑龍江雙城人，博士，研究員，主要從事濕地生態(tài)學(xué)研究。E-mail: nihongwei2000@163.com

Q 938

A

1006-7167(2016)08-0047-05