李 丹,李存華,胡勝科,徐洪富*

(1.山東英才學(xué)院藝術(shù)學(xué)院,山東 濟(jì)南250001；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院)

萱草新品種‘大眼睛’的組織培養(yǎng)技術(shù)研究

李 丹1,李存華2,胡勝科1,徐洪富1*

(1.山東英才學(xué)院藝術(shù)學(xué)院,山東 濟(jì)南250001；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院)

本研究以萱草新品種‘大眼睛’的莖尖為外植體,采用植物組織培養(yǎng)技術(shù),建立一套完善的萱草快繁技術(shù)體系。以MS為基本培養(yǎng)基,添加了不同濃度的6－BA和NAA等植物植物生長調(diào)節(jié)劑,探討了不同培養(yǎng)條件對(duì)‘大眼睛’啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明:適合‘大眼睛’的最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基是MS＋6－BA2.0mg/L＋NAA0.5mg/L,不定芽分化率達(dá)76.7%,40d不定芽平均生長量為2.90cm。最佳增殖培養(yǎng)基為MS＋6－BA4.0mg/L＋NAA1.0mg/L,平均增殖芽數(shù)為4.97個(gè)。培養(yǎng)基1/2MS＋I(xiàn)BA0.25mg/L有利于試管苗根系的生長,移栽成活率達(dá)100%。

組織培養(yǎng)；莖尖；萱草

萱草(Hemerocallis fulvaL.)屬百合科萱草屬,是一種多年生草本花卉,在我國有較長的栽培歷史,被譽(yù)為“母親花”。因其品種繁多,花色豐富,適應(yīng)性強(qiáng),栽培管理粗放等優(yōu)點(diǎn),常作為地被植物應(yīng)用于園林綠化。萱草良種‘大眼睛’是山東英才學(xué)院于2012年3月份從荷蘭引進(jìn)的大花系列品種之一。其株高35cm～40cm;葉片較寬,叢生;花葶高度為50cm～60cm,挺出葉面,粗壯;花瓣橙紅色反卷,邊緣和中間部分有紫暈?；ㄆ?月中旬至9月上旬,無病蟲害,耐寒性極強(qiáng),在山東地區(qū)綠期可持續(xù)到11月中旬,能露地越冬。該品種目前鮮見應(yīng)用于園林環(huán)境中。

萱草傳統(tǒng)的分株繁殖最佳時(shí)間一般在春季3月中旬左右,葉片露出土面部分明顯可見時(shí)為宜【1】,但繁殖系數(shù)低,再加上母株數(shù)量資源有限,在短時(shí)間內(nèi)不能獲得大量種苗,所以,本課題組采用組織培養(yǎng)技術(shù)建立‘大眼睛’的快速繁殖體系。經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn),關(guān)于萱草組織培養(yǎng)技術(shù)的研究較多,但主要集中在‘金娃娃’、‘紅運(yùn)’、‘紅寶石’、‘雙玫瑰’、‘奶油卷’等少數(shù)品種上,外植體多選用萱草的花莖、葉片、原生質(zhì)體等。雖然萱草的組織培養(yǎng)技術(shù)趨于成熟,但不同品種和外植體在啟動(dòng)培養(yǎng)效果、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基等方面存在較大差異。張潔茹等人(2014)選用4個(gè)萱草優(yōu)良單株的花莖做外植體,在啟動(dòng)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)中呈現(xiàn)出差異性。宋雪蓮(2011)對(duì)5個(gè)新品種多倍體萱草離體快繁技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn),不同萱草品種的增殖芽量、增值系數(shù)、生根狀況在同種植物生長調(diào)節(jié)劑處理組合上存在較大的差異。因此,萱草品種對(duì)其基因型的依賴性較強(qiáng),這就決定了每一個(gè)新品種的萱草屬植物對(duì)組織培養(yǎng)各環(huán)節(jié)的要求是不一樣的。課題組以萱草新品種‘大眼睛’幼嫩的莖尖為外植體,探討不同激素濃度組合對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代增殖、生根等環(huán)節(jié)的影響,旨在建立一套完善的工廠化快繁技術(shù)體系,為萱草分子育種等研究提供有力的技術(shù)支撐。同時(shí),又能滿足城市綠化對(duì)萱草新品種和數(shù)量的需求,推動(dòng)萱草等宿根花卉在山東省的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來源于山東英才學(xué)院園林工程學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地,選擇生長健壯,無病蟲害的一年生“大眼睛”植株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌材料的獲得 將從田間挖取的植株沖洗干凈泥土后帶回實(shí)驗(yàn)室,去掉根系,用鑷子將外層葉片剝?nèi)?放在燒杯中,加入2～3滴洗潔精,浸泡8～10min,將水倒掉,放在流水下沖洗1～2h。置于超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒20min,無菌水沖洗3次;轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液浸泡8min,無菌水沖洗3次,消除升汞殘留。用已經(jīng)消毒的鑷子和解剖刀再逐層剝?nèi)ネ鈱尤~片,將幼嫩的莖尖取出,長度約1cm,放在無菌濾紙上備用。

1.2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)階段

將消毒完全的莖尖接種于不同芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(表1)。以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的6－BA、NAA兩種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。每個(gè)處理接種10塊外植體,重復(fù)3次。4周后統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率,篩選出啟動(dòng)培養(yǎng)最佳配方。

表1 啟動(dòng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 采取兩因素完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),將初代培養(yǎng)獲得的生長健壯的不定芽分別轉(zhuǎn)接至繼代增殖培養(yǎng)基上,觀察比較6－BA(2.0、3.0、4.0mg/L)和NAA(0.5、1.0mg/L)不同濃度組合對(duì)芽增殖的影響。每個(gè)處理接種10個(gè)叢生芽,每個(gè)叢生芽有2～3個(gè)不定芽,重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后,統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù),觀察其生長狀況,確定增殖培養(yǎng)最佳配方。

1.2.4 生根培養(yǎng) 選取高度3～4cm左右的生長健壯的不定芽分別接種至兩種生根培養(yǎng)基上:①1/2MS＋0.25mg/LNAA＋30g/L蔗糖＋7.5g/L瓊脂;②1/2MS＋0.25mg/LIBA＋30g/L蔗糖＋7.5g/L瓊脂。每個(gè)處理接種10棵試管苗,3次重復(fù)。2周后統(tǒng)計(jì)生根數(shù),計(jì)算生根率。

1.2.5 馴化與煉苗移栽 在培養(yǎng)室內(nèi)打開瓶蓋,煉苗3～5d后,移置溫室取出已生根的健壯幼苗,洗凈根部的培養(yǎng)基,移栽至已消毒的基質(zhì)(泥炭土:蛭石:珍珠巖＝3:1:1)中,搭拱棚罩上塑料布和遮陰網(wǎng),保持濕度,避免幼苗水分流失。

1.2.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為25±1℃,光照強(qiáng)度為2000～3000lx,連續(xù)光照時(shí)間為12h/d;所有培養(yǎng)基均添加30g/L的蔗糖,7.5g/L瓊脂,PH5.8～6.0,并在121℃、1.1kg/㎡壓力下高溫高壓滅菌20min。

2 結(jié)果分析

2.1 6－BA和NAA對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

圖1 ‘大眼睛’莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織Fig．1 Callus induced from shoots of H．hybrida‘Big Eye’

將已消毒的外植體接種到培養(yǎng)基上,10d后莖尖基部開始萌動(dòng),逐漸膨大,產(chǎn)生淡黃色質(zhì)地密度均勻的愈傷組織(圖1)。25d后,愈傷組織上萌發(fā)出黃綠色的不定芽。40d后部分不定芽展開鮮綠色的嫩葉,每個(gè)外植體平均誘導(dǎo)出2～3個(gè)不定芽。

從表2可以看出,6－BA和NAA對(duì)萱草的芽分化率和生長量均有顯著影響。對(duì)萱草組培芽分化率的多重比較表明,6－BA濃度為2.0mg/L時(shí)不定芽分化率達(dá)到最高,其次是0.5mg/L和1.0mg/L。當(dāng)6－BA濃度為0.5mg/L時(shí),隨著NAA濃度的增加,芽分化率呈下降趨勢(shì),而芽平均生長量則成正比。在B9處理中發(fā)現(xiàn),40d后不定芽平均生長量為3.05cm,但后期生長過程中葉片出現(xiàn)水漬現(xiàn)象,這說明可能植物生長調(diào)節(jié)濃度過高。所以,綜合分析植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)率和生長狀況的影響,最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基是 MS＋6－BA2.0mg/L＋NAA0.5mg/L,芽分化率達(dá)到76.7%,40d不定芽平均生長量為2.90cm。

表2 6－BA、NAA對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

2.2 叢生芽的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)

繼代增殖培養(yǎng)是獲得萱草新品種大量種苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而增殖系數(shù)的多少是重要的衡量指標(biāo)。當(dāng)叢生芽生長高度為2～3cm時(shí),將其分離轉(zhuǎn)接到添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的繼代培養(yǎng)基中。10d左右叢生芽基部膨大產(chǎn)生芽點(diǎn),最多可增殖5～6個(gè)不定芽(圖2、圖3)。不定芽發(fā)生較為密集,但單株不定芽增殖系數(shù)較低,甚至不能增殖,這與宋雪蓮的研究結(jié)果一致。若增殖培養(yǎng)時(shí)間超過50d,會(huì)出現(xiàn)葉片卷曲、枯黃脫落的現(xiàn)象,應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)到壯苗培養(yǎng)基或生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

圖2 不定芽增殖Fig．2 Adventitious shoots germination of H．hybrida‘Big Eye’

圖3 愈傷誘導(dǎo)的不定芽Fig．3 Adventitious shoots induced from Callus of H．hybrida‘Big Eye’

表3 6－BA、NAA對(duì)組培苗增殖培養(yǎng)的影響

表3結(jié)果顯示:當(dāng)BA為4.0mg/L時(shí),增殖效果比較好,和BA為2.0mg/L處理有極顯著差異。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著BA濃度的加大,莖段底部愈傷組織增多,有利于莖芽的生長。在含有0.5mg/L BA和1.0mg/LNAA培養(yǎng)基上的平均芽數(shù)達(dá)到3～4個(gè),且生長狀態(tài)較好。因此,‘大眼睛’最佳增殖培養(yǎng)基為 MS＋6－BA4.0mg/L＋NAA1.0mg/L＋30g/L蔗糖＋7.5g/L瓊脂。

2.3 生根與移栽

圖4 ‘大眼睛’的生根苗Fig．4 Rooted plantlets of H．hybrida‘Big Eye

從叢生芽上切取生長健壯的單芽,接種于 1/2MS＋0.25mg/LNAA、 1/2MS＋0.25mg/LIBA兩種生根培養(yǎng)基上。培養(yǎng)10d左右,小芽基部膨大長出3～4條2.0～3.0cm長的不定根(圖4),根系健壯,部分長出側(cè)根,生根率均為92%以上。通過觀察發(fā)現(xiàn),兩種培養(yǎng)基也呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn):在1號(hào)培養(yǎng)基中不定根萌發(fā)較早,生長快,但須根較少,根系不發(fā)達(dá);2號(hào)培養(yǎng)基生長較緩慢,但須根較多,較發(fā)達(dá),葉片較大而伸展。所以,2號(hào)培養(yǎng)基是‘大眼睛’最佳的生根培養(yǎng)基。另外,隨著苗高的增加,葉片會(huì)出現(xiàn)彎曲、逐漸變黃導(dǎo)致生長勢(shì)減弱,影響后期的移栽成活率。選擇根系發(fā)達(dá)、須根較多的瓶苗經(jīng)馴化后移栽入草炭土:蛭石、珍珠巖＝3:1:1混合的基質(zhì)中,適當(dāng)遮蔭,成活率可達(dá)100%,說明萱草生根、移栽較粗放,成活率高,但移栽時(shí)避免根系過長,勿產(chǎn)生窩根、斷根的情況。

3 討論與結(jié)論

該研究是在校園土壤貧瘠、鹽堿化程度較嚴(yán)重的情況下,引進(jìn)‘大眼睛’等多個(gè)萱草新品種,建立了資源圃。為了能滿足市場對(duì)萱草種類和數(shù)量的需求,降低引種成本,促進(jìn)萱草屬植物在山東省的應(yīng)用和發(fā)展,課題組已建立萱草 ‘大眼睛’、‘紫桔’、‘沙克’等5～6個(gè)新品種的快繁技術(shù)體系,為規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

以高度為1cm左右的莖尖為外植體進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng),研究發(fā)現(xiàn),將莖尖基部靠近根部的組織切成薄片接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,但分化率較莖尖部分低很多,這可能由于靠近根部的組織較為成熟。另外,啟動(dòng)培養(yǎng)階段部分植物材料會(huì)發(fā)生褐化現(xiàn)象。褐化是培養(yǎng)材料在培養(yǎng)過程中不斷產(chǎn)生酚類或酶類化合物所造成的,嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致材料死亡,多發(fā)生在木本植物中。萱草在不斷的培養(yǎng)過程中也會(huì)發(fā)生褐化現(xiàn)象,①滅菌時(shí)間過長造成組織受損;②在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間過長,如不定芽在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間超過40d左右就會(huì)發(fā)生褐化現(xiàn)象,基部吸收營養(yǎng)不足,導(dǎo)致葉片枯黃,采取勤轉(zhuǎn)瓶,縮短培養(yǎng)時(shí)間等方法可以有效減少褐化的產(chǎn)生。

植物生長調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)技術(shù)中的關(guān)鍵因素,對(duì)誘導(dǎo)不定芽、繼代增殖等效果明顯。很多研究表明,在配合使用6－BA和NAA的情況下,不定芽誘導(dǎo)率要高于單獨(dú)使用6－BA。本次研究的大多數(shù)環(huán)節(jié)都應(yīng)用的6－BA和NAA兩種激素,而且效果明顯,萱草‘大眼睛’其最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基是 MS＋6－BA2.0mg/L＋NAA0.5mg/L,在 MS＋6－BA4.0mg/L＋NAA1.0mg/L培養(yǎng)基上增殖效果最好。因此沒有選用其他植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行試驗(yàn),后續(xù)試驗(yàn)可以嘗試更多的激素種類和濃度組合。但激素濃度過大,會(huì)引起組織的玻璃化或褐化。研究發(fā)現(xiàn),萱草新品種‘大眼睛’在6－BA、NAA兩種激素濃度分別為2.0mg/L和1.0mg/L時(shí),不定芽的葉片、莖段呈水漬狀態(tài),產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。而將玻璃化苗轉(zhuǎn)入不添加任何激素的MS培養(yǎng)基,葉片、莖段又能恢復(fù)正常。這說明,6－BA和NAA的濃度降低甚至是不添加任何激素的培養(yǎng)基,可有利于玻璃化苗轉(zhuǎn)化為正常苗。

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Research on Tissue culture technique ofHemerocallis hybrida‘Big Eye’

LI Dan1,LI Cunhua2,HU Shengke1,XU Hongfu1*

(1.Artisic Collage,Shandong Yingcai University,Jinan250001;2.Forestry Collage,Shandong Agriculture University)

The young shoots ofHemerocallis hybrida‘Big Eye’were used as explants in the study.Through the plant tissue culture techniques,the experiment studied the establishment ofH．hybrida‘Big Eye’rapid propagation system.Using MS as the basic medium supplemented with different concentrations of 6－BA and NAA plant growth regulating substances,in order to study the effect of different culture conditions onH．hybrida‘Big Eye’in vitro starting culture,proliferation and rooting culture.The results showed that the optimum initiation and multiplication medium was MS＋6－BA2.0mg/L＋NAA0.5mg/L,adventitious bud differentiation rate was 76.7%,and adventitious bud average growth was 2.90cm after 40d;the best multiplication culture medium was MS＋6－BA4.0mg/L＋NAA1.0mg/L,and proliferation bud number in 4.97 on average;the best rooting medium was 1/2 MS＋I(xiàn)BA0.25mg/L,the rate of survival was 100%.

tissue culture;shoots;Hemerocallis hybrida

SQ813.1＋2

A

1002－2724(2016)06－0032－04

2016－10－20

山東英才學(xué)院2013年度校級(jí)重點(diǎn)課題(13YCZDZR04)

李丹(1986－),女,山東濟(jì)南人,講師,研究生,碩士,現(xiàn)主要從事園林植物組織培養(yǎng)等研究工作。

*通訊作者:徐洪富(1962),男,山東臨朐人,教授,博士生導(dǎo)師,本科,研究方向是園林植物資源收集、病蟲害防治。