田永芝，王亞麗，孫茹，趙婧，劉群，王晨曉，馬艷，蔡梅超

山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355

·中藥研究與開發(fā)·

響應面法優(yōu)化川楝子總黃酮的提取工藝

田永芝，王亞麗，孫茹，趙婧，劉群，王晨曉，馬艷，蔡梅超

山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355

目的 優(yōu)化川楝子總黃酮提取工藝。方法 以總黃酮提取率為響應值，考察料液比、提取時間、乙醇體積分數3個因素對川楝子總黃酮提取率的影響。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法中的Box-Behnken模式對川楝子總黃酮的提取工藝參數進行優(yōu)化分析。結果 川楝子總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶35、提取時間3.0 h、乙醇體積分數70%。在此條件下總黃酮的提取率為0.587 3%。結論 實測值與響應面法回歸模型高度擬合，使用該方法能合理優(yōu)化川楝子總黃酮的提取工藝。

川楝子；總黃酮；響應面法；提取工藝

川楝子為楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的干燥果實，具有舒肝、行氣止痛、驅蟲作用，常用于治療胸脅、脘腹脹痛、疝痛、蟲積腹痛等癥[1]。主要產于四川、貴州、陜西、湖北、湖南等地。有報道表明，川楝子含有黃酮類化合物[2]，而天然植物中的黃酮類化合物具有極為廣泛的生理活性。本試驗采用響應面法優(yōu)化川楝子總黃酮的提取工藝，為進一步開發(fā)川楝子藥用資源提供參考。

1 儀器與試藥

川楝子（購自四川，干燥，粉碎，過40目篩，備用），經馬艷老師鑒定為楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的果實。蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號10080-200707），無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純（天津市科密歐化學試劑有限公司），蒸餾水。UV9100B型紫外可見光光度計（萊伯泰科），賽多利斯BT25S型分析天平等。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

取干燥的蘆丁對照品11 mg，精密稱定，用適量70%乙醇，在超聲波下使其溶解，冷卻至室溫，轉至25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得0.44 g/L的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

將川楝子用石油醚回流脫脂2次，每次2 h，抽濾，將石油醚揮干，稱取一定量脫脂后的川楝子，按一定料液比加一定濃度的乙醇，回流提取一定時間，濾渣重復提取1次，合并提取液，旋蒸乙醇至近干，用70%乙醇溶液轉移至50 mL容量瓶，定容，抽濾，濾液旋干，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中，備用。

2.3 標準曲線的繪制

精密量取“2.1”項下對照品溶液0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 mL于10 mL比色管中，各加70%乙醇溶液，使之成為5.0 mL，先加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，最后加70%乙醇溶液至10.0 mL，放置15 min顯色。用分光光度計于510 nm波長分別測定吸光度[3]，經最小二乘法進行線性回歸，分析得回歸方程A＝11.325C＋0.000 3，r2＝0.998，表明在0.017 6～0.061 8 mg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.4 方法學考察

2.4.1 重復性試驗 取同一批供試品6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下方法顯色，測定，并計算總黃酮提取率（Y）。Y＝C×10÷V1× V÷1000 m×100%。式中：V1為吸取體積（mL），V為提取液體積（mL），m為川楝子樣品質量（g），C為顯色的總黃酮濃度（mg/mL）。結果RSD＝1.89%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，按“2.3”項下方法顯色，分別在0、1、2、3、4 h，測定并計算總黃酮提取率，結果RSD＝2.36%。

2.4.3 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液6份，分別加入已知量的對照品，按“2.3”項下方法顯色，測定，并計算回收率，結果平均回收率為98.75%，RSD＝2.85%。

2.5 單因素試驗

2.5.1 料液比 取5.0 g脫脂后的川楝子5份，精密稱定，按料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45，用70%乙醇溶液回流提取2.0 h，按“2.2”項下方法提取定容后，按“2.3”項下方法顯色測定吸光度并計算提取率，結果見圖1?？芍谝掖俭w積分數、提取時間一定的條件下，料液比為1∶25～1∶35時提取率逐漸上升，在1∶35時達到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢，故料液比以1∶35為宜。

2.5.2 乙醇體積分數 取5.0 g脫脂后的川楝子5份，精密稱定，按料液比1∶25，分別用60%、65%、70%、75%、80%乙醇回流提取2.0 h，按“2.2”項下方法提取定容后，按“2.3”項下方法顯色測定吸光度并計算提取率，結果見圖2?？芍?，在料液比和提取時間一定的條件下，隨著乙醇體積分數的增加，川楝子總黃酮提取量先增后減，當乙醇體積分數70%時黃酮提取量最大，故最佳乙醇體積分數為70%。

2.5.3 提取時間的選擇 取5.0 g脫脂后的川楝子5份，精密稱定，按料液比1∶25、70%乙醇溶液回流提取時間分別為1.5、2、2.5、3、3.5 h，按“2.2”項下方法提取定容后，按“2.3”項下方法顯色測定吸光度并計算提取率，結果見圖3?？芍谝掖俭w積分數和料液比一定的條件下，提取率隨提取時間的增加而增加，在提取時間為3.0 h時，川楝子總黃酮提取率最高，故提取時間以3.0 h為宜。

圖1 料液比對總黃酮提取率的影響

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.6 響應面法優(yōu)化試驗

2.6.1 模型建立及顯著性試驗 在單因素試驗的基礎上，以液料比（A）、乙醇體積分數（B）、提取時間（C）為自變量，以總黃酮提取率為響應值，通過Design Expert 8.0.3軟件設計3因素3水平的二次回歸分析，預測川楝子總黃酮提取的最佳工藝[4]。響應面分析因素與水平見表1，響應面分析設計及結果見表2，響應面回歸模型的方差分析見表3。

表1 響應面分析因素與水平

表2 響應面分析設計及結果

表3 響應面回歸模型的方差分析

采用響應面法分析試驗結果，得到以總黃酮提取率為響應值的回歸方程：總黃酮提取率＝0.61＋0.012A＋7.712E-003B－6.312E-003C＋0.014AB＋0.013AC＋2.075E-003BC－0.018A2－0.035B2－0.038C2。對二項式進行計算，得出川楝子總黃酮的最佳提取條件：料液比1∶37，乙醇體積分數70.95%，提取時間3.0 h。考慮到實際因素，提取條件為料液比1∶35、乙醇體積分數70%、提取時間3.0 h。

由方差分析可知，以總黃酮提取率為響應值時，模型P＝0.029 99＜0.05，表明該二次方程模型顯著。而失擬項P＝0.155 4表示失擬項不具顯著性[5]。

2.6.2 響應曲面分析 利用Design Expert軟件得到二次回歸方程的等高線及響應面圖（見圖4～圖6），根據二次模型得到的等高線及響應曲面可以評價試驗因素之間的交互強度，以確定因素最佳提取范圍。

由圖4可知，當提取時間和乙醇體積分數保持不變時，提取率隨料液比的增大而先緩慢增大后減小，這是因為當擴散達到平衡時，提取劑增量不會促進黃酮的提取，反而使之后的濃縮更為困難。等高線呈橢圓形說明料液比與乙醇體積分數交互作用明顯。

圖4 料液比和體積分數對總黃酮提取率影響的響應面和等高線圖

圖5 料液比和提取時間對總黃酮提取率影響的響應面和等高線圖

圖6 體積分數和提取時間對總黃酮提取率影響的響應面和等高線圖

由圖5可知，當料液比和乙醇體積分數保持不變時，提取率隨提取時間的增加先增后減。提取時間的延長則使大量水溶性物質溶出，提取液變黏稠而對黃酮產生吸附作用，導致黃酮不能快速擴散析出，在大約3 h時達到最大值，與單因素試驗結果相同，等高線呈橢圓形說明料液比與提取時間交互作用明顯。

由圖6可知，當提取時間和料液比不變時，提取率隨著乙醇體積分數的增大先增后減，由于乙醇體積分數較低時黃酮類物質溶解度較低，而蛋白質、糖類等易溶于水的物質會被提取出來，導致提取率降低，乙醇體積分數過高而產生較大滲透壓，使黃酮溶解性降低。曲線平滑說明提取時間對得率影響較小，等高線呈圓形說明乙醇體積分數與提取時間交互作用不明顯。

2.6.3 模型驗證 通過軟件分析計算得出理論最佳提取工藝：乙醇體積分數70.95%，料液比1∶37，提取時間3.0 h，在此條件下的黃酮提取率為0.611 0%。

2.7 樣品測定

精密量取待測液1.0 mL于10 mL比色管中按“2.3”項下方法顯色，測定，根據線性回歸方程計算得出總黃酮含量為0.587 3%，見表4。

表4 樣品含量測定結果

3 討論

本研究在單因素試驗基礎上，通過響應面法考察了料液比、乙醇體積分數、提取時間對川楝子總黃酮提取率的影響，建立了川楝子總黃酮提取率的多元回歸模型，模型擬合度良好。確定了黃酮最佳提取條件：料液比1∶35，乙醇體積分數70%，提取時間3.0 h。在此條件下，黃酮得率可達0.611%。單因素影響順序為料液比＞體積分數＞提取時間。黃酮提取率的實際值與預測值相差僅0.023%，說明運用響應面法優(yōu)化川楝子總黃酮提取工藝條件是有效的，具有實際應用價值，為川楝子總黃酮的提取提供了一定的參考。

響應面法雖然試驗次數相對較多，但能把各影響因素與響應值之間的關系函數化，建立連續(xù)變量曲面模型，考察因素不局限于所限制的水平，比傳統(tǒng)正交試驗方法更直觀、更精確。因此，該優(yōu)化提取方法可在川楝子黃酮提取工藝研究及生產中推廣應用。

[1] 江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典(上)[M].上海：上?？茖W技術出版社,1993：232-233.

[2] 李繁.中藥川楝子的研究進展[J].哈爾濱醫(yī)藥,2008,28(5)：54-55.

[3] 朱金霞.超聲波法優(yōu)選苦豆子中總黃酮的提取工藝研究[J].中國野生植物資源,2010,29(5)：35-38.

[4] 龔文瓊,劉睿.響應面法優(yōu)化微波輔助提取普洱茶中茶色素工藝研究[J].食品科學,2010,31(8)：137-142．

[5] 楊文鴿,謝果凰,顏偉華,等.響應面分析法優(yōu)化海鰻的濕腌工藝[J].中國食品學報,2010,10(1)：133-139.

Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Toosendan Fructus by Response

Surface Methodology

TIAN Yong-zhi, WANG Ya-li, SUN Ru, ZHAO Jing, LIU Qun, WANG Chen-xiao,

MA Yan, CAI Mei-chao (College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Objective To optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus. Methods Three parameters that significantly affect the extraction rate of flavonoids, ratio of material to water, extraction time and ethanol concentration, were taken into consideration for extraction ratio of flavonoids from Toosendan Fructus. Based on the results of single-factor experiment, the extraction parameters of flavonoids from Toosendan Fructus were optimized by Box-Behnken of response surface methodology (RSM). Results The optimum extraction conditions were as follow: material to water ratio was 1:35; extraction time should be 3 h; ethanol concentration was 70%. The extraction ratio was up to 0.587 3% in the optimum extraction conditions. Conclusion The actual value is highly matching the theoretically value of RSM model. The results indicated that this method can rationally optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus.

Toosendan Fructus; flavonoids; response surface methodology; extraction process

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.020

R284.2

A

1005-5304(2016)04-0076-04

2015-05-14）

（

2015-06-10；編輯：陳靜）

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（2011-016）；山東中醫(yī)藥大學SRT項目（2015125）

馬艷，E-mail：sdutcmyaohua@163.com