王璇，朱瑩，鄒君君

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005

潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清及結(jié)腸組織促炎因子與抗炎因子的影響

王璇，朱瑩，鄒君君

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005

目的 觀察潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠血清及結(jié)腸組織促炎因子干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-12與抗炎因子IL-4、IL-10的影響，探討其治療脾腎陽(yáng)虛型UC的作用機(jī)制。方法 采用番瀉葉溶液灌胃、噴冰水刺激和三硝基苯磺酸（TNBS）乙醇法制作脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠病證結(jié)合模型。將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、敷貼組、柳氮磺胺吡啶（SASP）組，每組10只，空白組和模型組予無(wú)藥物的巴布劑基質(zhì)穴位敷貼加生理鹽水灌胃，敷貼組予潰結(jié)寧膏穴位敷貼加生理鹽水灌胃，SASP組予無(wú)藥物的巴布劑基質(zhì)穴位敷貼加SASP灌胃，療程均為28 d。治療期間觀察各組大鼠一般狀況，治療后肉眼觀察結(jié)腸組織大體形態(tài)，HE染色鏡下觀察病理形態(tài)并評(píng)分，ELISA檢測(cè)各組大鼠血清及結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10水平。結(jié)果 敷貼組和SASP組UC大鼠一般狀況、結(jié)腸組織肉眼大體形態(tài)、病理形態(tài)均較模型組好轉(zhuǎn)且評(píng)分降低；與模型組比較，敷貼組、SASP組血清和結(jié)腸組織IL-4、IL-10水平明顯升高，IFN-γ、IL-12水平明顯降低（P＜0.01）；同時(shí)，敷貼組IL-4、IL-10下降水平低于SASP組，IFN-γ、IL-12上升水平高于SASP組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 潰結(jié)寧膏可能通過(guò)部分恢復(fù)大鼠血清及結(jié)腸組織促炎因子與抗炎因子的平衡來(lái)發(fā)揮其治療脾腎陽(yáng)虛型UC的作用。

潰瘍性結(jié)腸炎；潰結(jié)寧膏；穴位敷貼；干擾素-γ；白細(xì)胞介素-12；白細(xì)胞介素-4；白細(xì)胞介素-10；大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種反復(fù)發(fā)作的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床癥狀。研究表明，其具有一定的癌變傾向，目前尚未明確該病發(fā)病原因及機(jī)制，且缺乏確切的治療手段，已被列為現(xiàn)代難治病之一[1]。我們前期研究表明，潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)脾腎陽(yáng)虛型UC患者腸黏膜炎癥有較好的改善作用[2-7]。本實(shí)驗(yàn)觀察潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠血清及結(jié)腸組織促炎因子干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-12與抗炎因子IL-4、IL-10的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠43只，2～3月齡，體質(zhì)量180～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。室溫（20±0.5）℃，相對(duì)濕度50％，自由飲食飲水，晝夜光照節(jié)律，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

潰結(jié)寧膏由炮附片、細(xì)辛、丁香、芥子、赤芍、延胡索、生姜等組成，本院藥劑科提供并制成巴布劑；番瀉葉，本院藥劑科提供；無(wú)藥物巴布劑基質(zhì)由聚丙烯酸鈉、明膠、高嶺土、甘羥鋁、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇制成，本院藥劑科提供；柳氮磺胺吡啶片，0.25 g/片，上海三維制藥有限公司，批號(hào)20120615。1.3 主要試劑與儀器

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），美國(guó)Sigma公司，批號(hào)107K5008；IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12 ELISA試劑盒，美國(guó)RD公司，批號(hào)201307；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀TGL-16；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，匯松PW-812；酶標(biāo)儀，匯松MB-530；電熱恒溫干燥箱，光都DHG-900Z-0；電子天平，江蘇省武進(jìn)市衡器廠RTZ-IOA-RT；S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；AO切片機(jī)，LEICA公司RM2235；光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS公司BX50。

1.4 分組及造模

將43只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、敷貼組、柳氮磺胺吡啶組（SASP組），空白組10只，模型組、敷貼組、SASP組各11只。2 mL/kg 100％番瀉葉溶液灌胃，1次/d，灌胃30 min后用噴霧器給大鼠全身均勻噴灑4 ℃冰水50 mL，濕潤(rùn)皮毛，然后將大鼠置于電風(fēng)扇前吹干，復(fù)制大鼠脾腎陽(yáng)虛證[8]。28 d后，將禁食12 h SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛4 mL/kg麻醉，將一直徑2 mm、長(zhǎng)12 cm的橡膠輸液管插入肛門深約8 cm，將100 mg/kg TNBS乙醇溶液0.5 mL注入肛管，留置數(shù)分鐘，讓大鼠保持平躺狀態(tài)，自然清醒，復(fù)制大鼠UC模型。第2日，在造模組中隨機(jī)抽取1只處死，距肛門8 cm處取結(jié)腸組織，鏡下觀察組織病理形態(tài)，驗(yàn)證造模是否成功。

1.5 選穴與給藥

選取“中脘”“氣?！奔半p側(cè)“足三里”“天樞”，定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]常用動(dòng)物穴位定位法及擬人比照法。敷貼位置先用剪刀將毛剪短，再用剃毛器將毛剃凈，每次剃毛4 cm2，貼藥后予鼠夾固定?？瞻捉M和模型組均予無(wú)藥物巴布劑基質(zhì)穴位敷貼加生理鹽水灌胃，敷貼組予潰結(jié)寧膏穴位敷貼加生理鹽水灌胃，SASP組予無(wú)藥物巴布劑基質(zhì)穴位敷貼加SASP灌胃。各組于造模后第3日開(kāi)始，予潰結(jié)寧膏敷貼或巴布劑基質(zhì)處理，每日1次，每次1～1.5 h，后三里、天樞每次貼一側(cè)，左右交替。SASP組用生理鹽水配成10 mg/mL溶液，給藥劑量為50 mg/（kg·d），給藥體積為1 mL/d，空白組予等量生理鹽水。每日1次，療程為28 d。

1.6 取材

治療28 d后大鼠禁食12 h，10％水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)腹暴露腹主動(dòng)脈，腹主動(dòng)脈采血5 mL，3000 r/min離心15 min，吸取上清液，檢測(cè)血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10。距肛門6～l0 cm取腸段，冰生理鹽水清洗，觀察結(jié)腸組織有無(wú)充血、水腫，放入4％多聚甲醛，固定待做病理切片。取1 g結(jié)腸段，加PBS，用玻璃勻漿器研磨制成10％組織勻漿液，3000 r/min離心15 min，吸取其上清液，檢測(cè)結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10。

1.7 一般狀況觀察

2016年完成“抽油井工況分析表”發(fā)布，系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了泵效偏差、沉沒(méi)率偏差計(jì)算結(jié)果的數(shù)字化和量化排序，從而及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛力井，如圖7所示。

實(shí)驗(yàn)期間每日觀察大鼠飲水飲食、大便形狀、腹瀉和血便程度、懶動(dòng)、拱背、嗜睡、背毛光澤、精神狀態(tài)及活動(dòng)等。

1.8 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察及評(píng)分

大鼠腸段于4％多聚甲醛固定后常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變并進(jìn)行雙盲評(píng)分。按Sasaki等[10]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)加以調(diào)整，炎癥嚴(yán)重程度以炎性細(xì)胞滲透程度進(jìn)行半定量評(píng)分[11]。詳見(jiàn)表1。

表1　結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.9 血清和結(jié)腸組織干擾素-γ、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-10水平檢測(cè)

ELISA檢測(cè)血清和結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10水平，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合者組間比較采用方差分析，不符合者采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

番瀉葉灌胃3 d后大鼠均出現(xiàn)程度不同的血便，伴有大便稀溏、飲水飲食減少、消瘦、神態(tài)萎靡、毛色無(wú)光澤、懶動(dòng)、扎堆等癥狀，說(shuō)明脾腎陽(yáng)虛證模型建立；TNBS乙醇溶液灌腸后麻醉處死3只大鼠，剖腹，分離結(jié)腸，腸系膜剪開(kāi)腸腔，冰生理鹽水沖洗，距肛門7～8 cm處均肉眼可見(jiàn)潰瘍面，病理檢查確認(rèn)有充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體破壞及典型的潰瘍形成，說(shuō)明UC模型復(fù)制。二者結(jié)合表明脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠模型造模成功。

2.2 一般狀況觀察結(jié)果

空白組大鼠一般情況基本正常，其余大鼠灌腸后24 h均出現(xiàn)不同程度的腹瀉、血便、拱背、懶動(dòng)、厭食；模型組大鼠均出現(xiàn)肉眼血便；敷貼組、SASP組大鼠在治療第4日癥狀開(kāi)始減輕，體質(zhì)量逐漸增長(zhǎng)；治療第10日，敷貼組及SASP組大鼠癥狀明顯改善，精神好轉(zhuǎn)，飲食飲水增加，未見(jiàn)黏液血便，偶有稀便。

2.3 結(jié)腸大體形態(tài)

肉眼下空白組大鼠結(jié)腸黏膜未可見(jiàn)潰瘍形成，模型組大鼠結(jié)腸壁可見(jiàn)明顯充血、水腫，剪開(kāi)腸壁可見(jiàn)腸壁黏膜有散在的潰瘍點(diǎn)及糜爛，遠(yuǎn)端結(jié)腸為甚，直腸病變最為嚴(yán)重。敷貼組和SASP組大鼠腸黏膜病變較模型組明顯好轉(zhuǎn)。

2.4 病理觀察結(jié)果

空白組大鼠腸黏膜未見(jiàn)潰瘍形成，模型組大鼠腸黏膜可見(jiàn)潰瘍形成，病變主要局限于黏膜層和黏膜下層，病變部位有大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；敷貼組大鼠腸黏膜未見(jiàn)明顯糜爛和潰瘍，但仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；SASP組大鼠結(jié)腸病變有明顯改善，腸黏膜無(wú)糜爛和潰瘍，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2　各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分比較（±s）

表2　各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù) 評(píng)分空白組 10 1.400±1.265模型組 10 5.100±1.197**敷貼組 10 2.400±1.350**△△SASP組 10 2.100±1.337**△△

圖1　各組大鼠結(jié)腸組織病理改變（HE染色，×100）

2.5潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清干擾素-γ、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-10水平的影響

與空白組比較，模型組、敷貼組、SASP組大鼠血清IFN-γ、IL-12水平升高，IL-4、IL-10水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，敷貼組、SASP組大鼠血清IFN-γ、IL-12水平降低，L-4、IL-10水平升高（P＜0.05，P＜0.01），敷貼組、SASP組2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織干擾素-γ、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-10水平的影響

與空白組比較，模型組、敷貼組、SASP組大鼠結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12水平升高，IL-4、IL-10水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，敷貼組、SASP組大鼠結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12水平降低，IL-4、IL-10水平升高（P＜0.05，P＜0.01），敷貼組、SASP組2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　各組大鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比較（±s，pg/mL）

表3　各組大鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 只數(shù) IFN-γ IL-12 IL-4 IL-10空白組 10 14.256±1.029 9.902±2.013 78.716±11.871 52.619±11.234模型組 10 24.119±1.308**27.840±2.386**42.819±17.695**17.629± 5.279**敷貼組 10 14.621±1.191**△17.290±1.658**△△76.393±11.423**△28.308± 6.012**△△SASP組 10 14.407±1.490**△△17.130±2.013**△△76.405±11.425**△△28.686± 6.062**△△

表4　各組大鼠結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比較（±s，pg/mL）

表4　各組大鼠結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 只數(shù) IFN-γ IL-12 IL-4 IL-10空白組 10 16.311±1.176 12.729±2.287 82.391±12.362 57.129±11.965模型組 10 25.207±1.093**29.597±1.948**46.946±17.716**21.695± 5.293**敷貼組 10 15.700±1.229**△△20.374±2.899**△△80.453±10.885**△32.339± 6.071**△△SASP組 10 12.575±0.964**△△19.457±2.353**△△80.492±10.892**△△31.367± 6.528**△△

3 討論

目前認(rèn)為UC主要與自身免疫紊亂、感染、遺傳、神經(jīng)精神等因素相關(guān)，并由其相互作用，導(dǎo)致腸黏膜的炎癥、屏障破壞，形成潰瘍。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)UC發(fā)病機(jī)理的研究中較為公認(rèn)的是免疫系統(tǒng)的紊亂——抗炎因子與促炎因子的失衡。

正常狀態(tài)下，人體腸黏膜自發(fā)分泌抗炎因子及促炎因子并保持其動(dòng)態(tài)平衡，以維持腸道正常免疫，當(dāng)受到病原體刺激時(shí)，該平衡即遭到破壞，抗炎因子水平降低，促炎因子水平升高，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，體內(nèi)存在Th1和Th2細(xì)胞兩類亞群，總體來(lái)說(shuō)，具有促炎作用的是Th1細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎效應(yīng)的是Th2細(xì)胞因子，它們共同發(fā)揮效應(yīng)，并具有相互拮抗作用。Th1細(xì)胞主要表達(dá)IFN-γ、IL-12及IL-2驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)，而Th2細(xì)胞主要表達(dá)IL-4、IL-10、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13抑制炎癥反應(yīng)。IFN-γ的主要功能是免疫調(diào)節(jié)作用，是強(qiáng)有力的吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活物，促進(jìn)T、B細(xì)胞分化，是IL-4的拮抗因子。IL-12能誘導(dǎo)早期輔助性T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，并促進(jìn)Th1細(xì)胞的發(fā)育和增殖。IL-4可刺激T、B細(xì)胞增殖，并抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和移動(dòng)，且可抑制IL-1β、腫瘤壞死因子-α、IL-6、IL-8和一氧化氮的產(chǎn)生，在抑制和消除炎癥中起重要作用。IL-10能抑制活化的T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，尤其在抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ方面作用明顯，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答。既往研究表明，在UC患者中，IL-4減少非常明顯，且其基因表達(dá)受到抑制[7]。同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)顯示，UC大鼠血清IL-4、IL-10含量明顯降低，而血清IFN-γ、IL-12含量則明顯升高[12-13]。

根據(jù)其臨床表現(xiàn)，UC可歸屬中醫(yī)“痢疾”“泄瀉”“腸澼”等范疇，病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)主要集中在飲食不節(jié)、情志失調(diào)、濕熱、脾虛或脾腎兩虛等方面。朱瑩教授認(rèn)為，本病發(fā)作期以濕熱、瘀血、積滯標(biāo)實(shí)為主，靜止期或慢性持續(xù)活動(dòng)期則多以脾腎陽(yáng)虛本虛為主，兼見(jiàn)濕熱、瘀血、積滯等余邪，其病位在腸，與脾、腎密切相關(guān)，并據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制出潰結(jié)寧膏，具有溫腎暖脾、活血化瘀之效，膏劑通過(guò)藥物的透皮作用結(jié)合穴位治療達(dá)到治療的功效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敷貼組和SASP組UC大鼠一般狀況、結(jié)腸組織肉眼大體形態(tài)、鏡下病理形態(tài)均較模型組好轉(zhuǎn)。同時(shí)，敷貼組血清及結(jié)腸組織IL-4、IL-10水平明顯升高，IFN-γ、IL-12水平明顯降低，與SASP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明潰結(jié)寧膏穴位敷貼是通過(guò)上調(diào)抗炎因子IL-4、IL-10并下調(diào)促炎因子IFN-γ、IL-12的水平，恢復(fù)腸道免疫平衡，達(dá)到治療UC的目的。

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Effects of Kuijiening Plaster Point Application on Pro- and Anti-inflammatory Cytokines in Serum and Colonic Tissue of Ulcerative Colitis Rats with Spleen-kidney Yang Deficiency

WANG Xuan, ZHU Ying, ZOU Jun-jun

(The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM, Changsha 410005, China)

Objective To observe the effects of Kuijiening Plaster point application on the levels of pro-inflammatory cytokines IFN-γ, IL-12 and anti-inflammatory cytokines IL-4, IL-10 in serum and colonic tissue of ulcerative colitis (UC) rats with spleen-kidney yang deficiency; To investigate the possible mechanism of Kuijiening for the treatment of UC with spleen-kidney yang deficiency. Methods Sennae Folium solution gavage, ice water stimulation and trinitrobenzene-sulfonic acid ethanol combinative methods were applied to establish the models of UC rats with spleen-kidney yang deficiency. Rat models were randomly divided into control group, model group, application group and SASP group, 10 in each group. The control group and model group were given medicine-free cataplasm matrix point application and perfused with NS. The application group was given Kuijiening Plaster point application and perfused with NS. SASP group was given medicine-free cataplasm matrix point application and perfused with SASP. The courses were 28 days. General conditions of rats in each group were observed during treatment. The general morphology and pathological form of colonic tissue were observed with naked eye and light microscopy through HE staining respectively in each group post-treatment. Pathological features were observed and scored by HE dyeing. Levels of IFN-γ, IL-12, IL-4 and IL-10 in serum and colonic tissue of rats in each group weredetected with ELISA. Results The general conditions, gross morphology and optical microscope pathological morphology of colonic tissue improved and scores decreased in application group and SASP group. Compared with the model group, levels of IL-4 and IL-10 significantly increased, while the levels of IFN-γ and IL-12 decreased in serum and colonic tissue in application group and SASP group, with statistical significance (P<0.01). Moreover, levels of IL-4 and IL-10 in application group decreased not as much as those in SASP group, while IFN-γ and IL-12 concentration increased higher than SASP group, without statistical significance (P>0.05). Conclusion Kuijiening Plaster point application can play a role in treating UC with spleen-kidney yang deficiency through partially restoring the balance between pro- and anti-inflammatory cytokines in serum and colon tissue of rats.

ulcerative colitis; Kuijiening Plaster; point application; IFN-γ; IL-12; IL-4; IL-10; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.012

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0042-05

湖南省教育廳重點(diǎn)課題（13A069）；湖南省科技廳課題（2013SK3080）；長(zhǎng)沙市科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目（k1403023-31）

朱瑩,E-mail：zhuying089@126.com

（2015-04-21）

（2015-06-18；編輯：華強(qiáng)）