楊帥 李雪 高潔 蔡毅志 李榮慧 王明國(guó)

1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053；2.濰坊口腔醫(yī)院口腔科，濰坊 261000；3.中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院口腔科，青島 266071；4.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012；5.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院口腔科，濟(jì)南 250013

·髁突軟骨專欄·

下頜持續(xù)前導(dǎo)對(duì)成年大鼠髁突軟骨骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響

楊帥1李雪2高潔3蔡毅志4李榮慧4王明國(guó)5

1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053；2.濰坊口腔醫(yī)院口腔科，濰坊 261000；3.中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院口腔科，青島 266071；4.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012；5.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院口腔科，濟(jì)南 250013

目的 觀察成年期大鼠在下頜持續(xù)前導(dǎo)作用下髁突軟骨的改建以及超微結(jié)構(gòu)的變化。方法 將30只9周齡SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組佩戴上頜斜面導(dǎo)板，對(duì)照組不做任何處理，分別在第3、7、14、21、30 天處死動(dòng)物并取材，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）在髁突中的表達(dá)及分布，透射電鏡觀察髁突軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，Micro CT分析髁突骨質(zhì)的變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組髁突中部和后部軟骨增生明顯，軟骨細(xì)胞BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率及灰度值在第7天開(kāi)始增多，隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，髁突軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，核周微絲變少、脂滴變小、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔隙腫脹、細(xì)胞外基質(zhì)增寬變多等。Micro-CT顯示實(shí)驗(yàn)組的新生骨和骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量和分離度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。結(jié)論 在下頜持續(xù)前導(dǎo)下，成年期大鼠髁突軟骨出現(xiàn)增生性改建，并存在BMP-2的高表達(dá)。

髁； 軟骨； 超微結(jié)構(gòu)； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

同源性9周齡成年SD大鼠30只，均為雄性，質(zhì)量250～300 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0017。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)自然光照，自然通風(fēng)，溫度20～25 ℃。

格魯瑪齒科酸蝕劑（Heraeus Kulzer Dental）（賀利氏古莎齒科有限公司，德國(guó)），可樂(lè)麗菲露光固化復(fù)合樹(shù)脂（可樂(lè)麗公司，日本），BMPs單克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)（BX51TPHD-J11型，奧林巴斯公司，日本），多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)（Image-Pro Plus型，Media Cybernetics公司，美國(guó)），透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）（JEM-100CX型，Delong公司，美國(guó)），Micro CT（SkyScan 1176 型，Bruker公司，比利時(shí)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

本實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，于2014年3月—2015年8月在山東大學(xué)口腔醫(yī)院山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。30只成年SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組佩戴自制上頜斜面導(dǎo)板，對(duì)照組不做任何處理，在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，在佩戴導(dǎo)板后的第3、7、14、21、30天分別處死6只動(dòng)物，切取髁突，一側(cè)髁突切取切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）和免疫組織化學(xué)染色，另一側(cè)進(jìn)行Micro CT檢測(cè)和透射電鏡觀察。

1.2.1 上頜斜面導(dǎo)板動(dòng)物模型的制備和取材 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，1 mL·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，牽拉大鼠下頜使口持續(xù)張開(kāi)以保證良好的視角，清潔大鼠上前牙，酸蝕，樹(shù)脂粘接，在舌側(cè)面形成2 mm的導(dǎo)板，使下頜產(chǎn)生向前3.5 mm和向下3 mm的前伸位移，并且保證斜面導(dǎo)板與上頜咬合平面呈20°～25°。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)SD大鼠的下頜前伸矯治器的配戴適應(yīng)情況進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)控，一旦發(fā)現(xiàn)有損壞和脫落，及時(shí)修理和安裝，使其不影響下頜持續(xù)性前伸的矯治效果。按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（3、7、14、21、30 d）處死大鼠，獲取標(biāo)本。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)BMP-2的表達(dá) 多聚甲醛固定后的髁突軟骨常規(guī)脫水石蠟包埋，髁突矢狀面低溫連續(xù)切片，BMP-2免疫組織化學(xué)染色（SABC法），在顯微鏡下應(yīng)用多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)Image-Pro Plus對(duì)樣本的BMP-2染色結(jié)果進(jìn)行圖像分析，每個(gè)樣本分別選取各組髁突軟骨前、中、后部3個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析，計(jì)算BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率以及所有陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值之和。

1.2.3 TEM觀察髁突軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 將取下來(lái)的標(biāo)本于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛在4 ℃的環(huán)境中固定2 h，然后用緩沖液多次清洗，再用體積分?jǐn)?shù)1%的鋨酸與4 ℃的環(huán)境中固定 2 h，切取1 mm切片行HE染色，為T(mén)EM行超微定位，然后制成超薄切片，JEM-100CXTEM觀察髁突軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。1.2.4 Micro CT分析髁突骨質(zhì)的變化 將標(biāo)本固定于SkyScan 1176 Micro-CT的特制的樣本床內(nèi)，設(shè)置掃描條件為50 kV、500 μA，空間分辨率設(shè)定為18 μm，像素1 336×2 000，曝光時(shí)間為225 ms，角度增益為0.7°，掃描后采用NRecon（Version:1.6.3.3）軟件重建CT圖。CTAn（Version:1.10.11.0）分析軟件對(duì)樣品校準(zhǔn)霍氏值（Holzknecht’s unit，HU）和密度，檢測(cè)其骨痂總體積（total callus volume，TV）、礦化骨總體積（mineralized callus volume，BV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp），并重建ROI三維圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組間比較用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

30只實(shí)驗(yàn)大鼠均健康存活，無(wú)死亡和感染情況發(fā)生。

2.1 成年大鼠髁突軟骨的組織形態(tài)學(xué)變化及軟骨厚度變化

實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的髁突軟骨解剖取出后，可見(jiàn)其表面粗糙不光滑，與對(duì)照組軟骨組織表面有明顯的差別。與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組的髁突中部和后部軟骨增生明顯（P<0.05），前部軟骨厚度無(wú)明顯差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組髁突總體積隨改建時(shí)間呈增大趨勢(shì)。髁突軟骨的中后部組織中的纖維層未發(fā)現(xiàn)明顯差異；實(shí)驗(yàn)組增殖層的細(xì)胞層數(shù)顯著增加且細(xì)胞核體積增大，鈣化軟骨層細(xì)胞的體積變大，肥大層細(xì)胞層數(shù)增加且細(xì)胞外基質(zhì)也增加（圖1）。各時(shí)間點(diǎn)髁突軟骨厚度的比較見(jiàn)表1。

圖1 大鼠髁突軟骨組織的改變 HE × 10Fig 1 Variations of condylar cartilage of rats HE × 10

表1 大鼠髁突軟骨厚度的變化Tab 1 Variations of condylar cartilage thickness of rats μm

2.2 BMP在大鼠髁突軟骨中的表達(dá)

BMP在大鼠髁突軟骨中表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞率和灰度值結(jié)果見(jiàn)表2、表3。在鏡下，BMP陽(yáng)性染色結(jié)果表現(xiàn)為深染的棕色顆粒。對(duì)照組中，髁突軟骨組織內(nèi)BMP陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于過(guò)渡層和肥大層，以肥大層表達(dá)最強(qiáng)，增殖層、鈣化軟骨層中的軟骨細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞也偶可見(jiàn)BMP表達(dá)，纖維層為陰性表達(dá)。對(duì)照組各時(shí)間段髁突軟骨內(nèi)BMP的陽(yáng)性細(xì)胞率和陽(yáng)性細(xì)胞灰度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組中，第3天BMP染色較弱，肥大層、過(guò)渡層有BMP陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，與對(duì)照組相比，其陽(yáng)性細(xì)胞率和灰度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；第7天時(shí)BMP染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，灰度值高于對(duì)照組（P<0.05），而陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；第14天開(kāi)始，BMP陽(yáng)性細(xì)胞率和灰度值均高于對(duì)照組（P< 0.05），第14天后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞率和灰度值呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，大量深染的陽(yáng)性細(xì)胞不僅存在于過(guò)渡層和肥大層內(nèi)，也出現(xiàn)在增殖層和鈣化軟骨層中，纖維層中偶可發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。21 d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞率與灰度值比14 d時(shí)進(jìn)一步增加（P<0.05），與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布在過(guò)渡層與肥大層，對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞在肥大層散在分布。30 d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞率和灰度值達(dá)到最高峰，高于對(duì)照組（P<0.05）。

表2 成年大鼠髁突軟骨細(xì)胞內(nèi)BMPs陽(yáng)性細(xì)胞率Tab 2 The rate of BMPs positive cells in condylar cartilage %

表3 成年大鼠髁突軟骨內(nèi)BMPs灰度值Tab 3 Gray value of BMPs in condylar cartilage

2.3 髁突軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

圖2 髁突軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 TEM × 15 000 Fig 2 Ultrastructural changes of condylar cartilage cells TEM × 15 000

髁突軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化見(jiàn)圖2。對(duì)照組大鼠的髁突軟骨肥大層細(xì)胞呈現(xiàn)典型透明軟骨細(xì)胞的特征，細(xì)胞形態(tài)為卵圓形，細(xì)胞膜表面有微絨毛突起，糖原顆粒含量較少，細(xì)胞質(zhì)含有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞外基質(zhì)含有大量的蛋白多糖顆粒及細(xì)小纖維，與細(xì)胞外基質(zhì)纖維相連接。與對(duì)照組相比，3、7 d時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比改變不明顯，14 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠的髁突軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，包括髁突軟骨細(xì)胞體積變大，細(xì)胞核固縮，21 d時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔隙腫脹，脂滴變小甚至消失，核周微絲顯著變少且不規(guī)則，30 d時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)增寬變多，并在細(xì)胞外間隙出現(xiàn)了大片空白區(qū)域。

2.4 下頜骨髁突骨質(zhì)參數(shù)的變化

Micro-CT觀察成年大鼠髁突變化見(jiàn)圖3。

2.4.1 TV與3 d組相比較，對(duì)照組TV值隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組TV值隨時(shí)間延長(zhǎng)TV值增加（P<0.01）（表4）。

2.4.2 BV與3 d組相比較，對(duì)照組BV隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組BV隨時(shí)間延長(zhǎng)先降低然后升高（P<0.05）（表5）。

2.4.3 Tb.Th與3 d組相比較，對(duì)照組Tb.Th隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組Tb.Th在14、30 d時(shí)變化明顯，其中30 d時(shí)顯著增加（P<0.01）（表6）。

2.4.4 Tb.N與3 d組相比較，對(duì)照組Tb.N隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間延長(zhǎng)先降低然后升高（P<0.05）（表7）。

2.4.5 Tb.Sp與3 d組相比較，對(duì)照組Tb.Sp隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組Tb.Sp在7、14、21 d時(shí)升高（P<0.05）（表8）。

圖3 Micro-CT下成年大鼠髁突變化Fig 3 Condylar changes of Micro-CT in adult rats

表4 成年大鼠TV的變化Tab 4 Changes of TV in adult rats mm3

表5 成年大鼠BV的變化Tab 5 Changes of BV in adult rats mm3

表6 成年大鼠Tb.Th的變化Tab 6 Changes of Tb.Th in adult rats μm

表7 成年大鼠Tb.N的變化Tab 7 Changes of Tb.N in adult rats

表8 成年大鼠Tb.Sp的變化Tab 8 Changes of Tb.Sp in adult rats μm

3 討論

顳下頜關(guān)節(jié)是人體中最復(fù)雜的關(guān)節(jié)之一。人的一生中，下頜骨髁突的關(guān)節(jié)面是可以因?yàn)槠涔δ茏兓l(fā)生改建的[8]。顳下頜關(guān)節(jié)不同于其他關(guān)節(jié)，還體現(xiàn)在其具有較強(qiáng)的終身改建的能力，尤其是在青少年時(shí)期這種改建能力表現(xiàn)的更為突出[9]，因而青少年的下頜后縮患者可以通過(guò)功能性矯治器前導(dǎo)下頜得以治療，但對(duì)于錯(cuò)過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育高峰的成年患者來(lái)說(shuō)，顳下頜關(guān)節(jié)能否改建以及如何改建尚不明確，本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠作為研究對(duì)象，大鼠屬嚙齒類動(dòng)物，其顳下頜關(guān)節(jié)與人在組織結(jié)構(gòu)上比較相似，在個(gè)體之間基因變異影響較少，同時(shí)較容易獲得樣本量，有利于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，是研究人顳下頜關(guān)節(jié)改建的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中使用的9周齡SD大鼠已經(jīng)處于大鼠成年期，大鼠髁突與關(guān)節(jié)窩以及翼外肌都處于穩(wěn)定的狀態(tài)，這與成年患者臨床Ⅱ類矯治的最佳時(shí)機(jī)相吻合。

顳下頜關(guān)節(jié)不同于其他關(guān)節(jié)，具有很強(qiáng)的改建能力，其原因可能是生物組織以改建的形式對(duì)所承受的負(fù)荷作出生物學(xué)反應(yīng)，最終可導(dǎo)致解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在機(jī)械應(yīng)力的作用下，髁突軟骨內(nèi)產(chǎn)生的機(jī)械化學(xué)信號(hào)調(diào)控著軟骨的合成和分解代謝，用適當(dāng)?shù)墓δ艹C治器可引起繼發(fā)性軟骨的生長(zhǎng)量和方向的改變[10]。髁突是下頜骨生長(zhǎng)發(fā)育的中心之一，具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)改建能力。髁突軟骨是覆蓋于髁突關(guān)節(jié)面表面的一層結(jié)締組織，髁突軟骨包括軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，從表層到深層可分為5層：纖維層、增殖層、過(guò)渡層、肥大層、鈣化軟骨層[11]。軟骨的分層結(jié)構(gòu)不僅反映了髁突軟骨細(xì)胞從幼稚到成熟的分化過(guò)程，更反映了髁突軟骨生長(zhǎng)改建的發(fā)展過(guò)程，即關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)各細(xì)胞層的變化是反映整個(gè)髁突適應(yīng)性改建的重要指標(biāo)[12]。本研究中切取大鼠的髁突進(jìn)行研究并沿髁突縱切面進(jìn)行分析，可以有效地觀測(cè)髁突軟骨各層的改建情況。

3.1 下頜前導(dǎo)后髁突軟骨的改建

下頜前伸可增加髁突軟骨后部新骨形成[13]。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下頜前導(dǎo)后，成年大鼠的髁突軟骨也發(fā)生改建，與對(duì)照組相比，髁突軟骨有明顯的增生。這與下頜前導(dǎo)在青年大鼠所獲得的研究結(jié)果相一致。這表明在下頜前導(dǎo)的負(fù)荷下，成年大鼠髁突也有明顯的改建過(guò)程。髁突軟骨屬于繼發(fā)性軟骨，繼發(fā)性軟骨生長(zhǎng)以及軟骨形成很大程度上取決于外部環(huán)境的改變[14]。髁突軟骨具有特殊的生長(zhǎng)及改建的多向分化能力，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨形成和后來(lái)的軟骨內(nèi)骨化過(guò)程來(lái)適應(yīng)外部環(huán)境的改變。

3.2 BMP-2與髁突軟骨適應(yīng)性改建的關(guān)系

髁突軟骨的改建成骨是由多種細(xì)胞因子調(diào)控的，其中 BMP-2是一種多功能生長(zhǎng)因子，對(duì)骨骼胚胎發(fā)育和出生后的成骨有重要作用[15]。其能引起多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，參與組織的再生和修復(fù)，尤其是骨和軟骨的修復(fù)，與骨組織的形成和改建有著密切的關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中，成年期大鼠下頜前導(dǎo)后BMPs在髁突軟骨的表達(dá)增強(qiáng)，特別是在增殖層，提示BMP-2能夠促進(jìn)未分化的細(xì)胞分化為前軟骨細(xì)胞。在下頜前導(dǎo)后可見(jiàn)大量的未分化細(xì)胞分化成前軟骨細(xì)胞，從而為軟骨成熟提供足夠的細(xì)胞來(lái)源[16]。BMP-2在過(guò)渡層和肥大層表達(dá)的增強(qiáng)說(shuō)明下頜前導(dǎo)加快了成年期大鼠髁突軟骨細(xì)胞的成熟，促進(jìn)了軟骨的增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下頜前導(dǎo)后，實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)髁突軟骨細(xì)胞BMP的表達(dá)高于對(duì)照組，說(shuō)明下頜前導(dǎo)后關(guān)節(jié)內(nèi)的生物力學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，髁突軟骨細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生適應(yīng)性改建；隨后BMP-2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組21、30 d時(shí)髁突軟骨細(xì)胞BMP-2的表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，說(shuō)明前導(dǎo)成年大鼠下頜后刺激了軟骨細(xì)胞，加快了軟骨細(xì)胞的分化成熟，促進(jìn)了髁突軟骨細(xì)胞的適應(yīng)性生長(zhǎng)改建，最終髁突軟骨建立新的結(jié)構(gòu)平衡來(lái)維持關(guān)節(jié)的功能。

3.3 超微結(jié)構(gòu)下觀察髁突軟骨改建的變化

軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)過(guò)程可以分成兩個(gè)明顯的階段，即成熟和礦化[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下頜前導(dǎo)后成年期大鼠的髁突組織的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著改變。在電鏡下，14 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組成年期大鼠髁突軟骨覆蓋的成纖維組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大破裂，胞漿外流，發(fā)生玻璃樣變，14～21 d時(shí)細(xì)胞體積隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核增大，說(shuō)明軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟并繼續(xù)分化成為肥大層軟骨細(xì)胞，而后發(fā)生核固縮，細(xì)胞電子密度增高，30 d時(shí)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔隙腫脹，細(xì)胞外基質(zhì)增多變寬。軟骨肥大層不連續(xù)，局部組織纖維化；增殖層未成熟細(xì)胞比例增加。說(shuō)明從細(xì)胞微觀層面證實(shí)肥大軟骨細(xì)胞死亡降解形成新骨，鈣化軟骨層厚度增加。從超微結(jié)構(gòu)觀察證實(shí)了經(jīng)過(guò)一定時(shí)間下頜前導(dǎo)后，髁突和下頜骨會(huì)出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)改建[18]。

3.4 Micro-CT觀察髁突軟骨的改建

Micro-CT能夠以很高的分辨率測(cè)定骨骼各種結(jié)構(gòu)，近年來(lái)已經(jīng)取代了原始的計(jì)量學(xué)方法。Micro-CT可以從3D的整體結(jié)構(gòu)出發(fā)對(duì)下頜骨髁突的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性的變化情況進(jìn)行研究。在本實(shí)驗(yàn)中成年期大鼠實(shí)驗(yàn)組TV隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高，30 d時(shí)最高。同樣，BV、Tb.N、Tb.Th在30 d時(shí)也顯著增加（P＜0.05）。說(shuō)明在外力作用下，成年期大鼠髁突也會(huì)有新骨形成發(fā)生，發(fā)生最顯著變化的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)至觀察期的30 d，說(shuō)明在外力作用下，成年期大鼠髁突也會(huì)有新骨形成發(fā)生適應(yīng)性改建[19]。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織學(xué)與影像學(xué)相結(jié)合的研究方法，從不同角度證實(shí)了成年大鼠在下頜持續(xù)前導(dǎo)作用下，髁突發(fā)生了改建：Micro-CT測(cè)得髁突后部在下頜前導(dǎo)后新骨生成；免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中BMP-2作為軟骨成骨與軟骨修復(fù)重要細(xì)胞因子出現(xiàn)了高表達(dá)，提示在髁突改建過(guò)程中存在改建中的新骨生成與改建后的軟骨修復(fù)現(xiàn)象，BMP-2促進(jìn)軟骨修復(fù)使髁突軟骨建立新的平衡來(lái)維持改建后關(guān)節(jié)的功能；通過(guò)透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)，證實(shí)了軟骨細(xì)胞在改建中存在增生分化現(xiàn)象，且出現(xiàn)時(shí)間與BMP-2出現(xiàn)高表達(dá)時(shí)間一致，提示BMP-2可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路參與了軟骨細(xì)胞增生分化。已有研究[20]證實(shí)，不同作用方式和作用時(shí)間下可以差異性調(diào)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞的改建。在下頜前導(dǎo)外力作用下，成年期大鼠的髁突軟骨也會(huì)發(fā)生明顯的形態(tài)組織學(xué)改建，使顳頜關(guān)節(jié)的位置發(fā)生改變，促進(jìn)口頜系統(tǒng)傾向于穩(wěn)定狀態(tài)。這為成人正畸治療錯(cuò)畸形提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于本研究中觀察對(duì)象的研究時(shí)間較短，只能提示前導(dǎo)下頜的負(fù)荷可促進(jìn)髁突軟骨的改建，但最終改建的效果以及達(dá)到口頜系統(tǒng)穩(wěn)定的時(shí)間本研究尚不能提供結(jié)論。

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（本文編輯 李彩）

Changes in ultrastructure and bone morphogenetic protein expression in reconstructed mandibular condylar cartilage under continuous mandibular advancement in adult rats

Yang Shuai1, Li Xue2, Gao Jie3, Cai Yizhi4, Li Ronghui4, Wang Mingguo5. (1. School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2. Dept. of Stomatology, Weifang Oral Hospital, Weifang 261000, China; 3. Dept. of Stomatology, The 401st Hospital of PLA, Qingdao 266071, China; 4. School of Stomatology, Shandong University, Jinan 250012, China; 5. Dept. of Stomatology, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China)

Supported by: The Science and Technology Development Program of Shandong Province (2014GSF11804). Correspondence: Wang Mingguo, E-mail: wmgsh@163.com.

Objective This study investigated the reconstructed mandibular condylar cartilage and the ultrastructural variations in mandibular condylar cartilage in adult rats as a result of mandibular advancement. Methods Thirty 9-week-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into experimental and control groups. Rats in the experimental group were subjected to mandibular advancement. Rats were sacrificed on days 3, 7, 14, 21, 30. Sections were cut from condyles, and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) expression in condylar cartilage was examined through immunohistochemical analysis. Condylar cartilage samples were harvested, and ultrastructural changes in these samples were observed under Micro-CT and transmission electron microscope. Results Compared with the control group, the experimental group obviously displayed cartilage hyperplasia in the middle and rear of the condyle. Moreover, the number of BMP-2-positive cells in condylar cartilage and the gray value gradually increased in the experimental group on day 7 of the intervention. Ultrastructural changes, such as karyopyknosis, reduced microfilaments around the nucleus, reduction in size or even disappearance of lipid droplets, swelling of endoplasmic reticulum compartments, broadened and increased extracellular matrix, were observed in the condylar hypertrophic chondrocytes. Micro-CT revealed that the trabecula and the newly formed bone gradually thickened.Conclusion Hypertrophic remodeling of the condylar cartilage and high BMP-2 expression are observed in adult rats as a result of continuous mandibular advancement.

condyle; cartilage; ultrastructure; bone morphogenetic protein

R 783.5

A

10.7518/hxkq.2016.06.016

2016-01-15；

2016-07-10

山東省科技發(fā)展項(xiàng)目（2014GSF11804）

楊帥，碩士，E-mail：907445117@qq.com

王明國(guó)，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：wmgsh@163.com