郭俊峰 張慧宇 張綱 安洋 楊陽 王飛 譚穎徽

第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400037

降鈣素基因相關(guān)肽對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷的保護作用研究

郭俊峰 張慧宇 張綱 安洋 楊陽 王飛 譚穎徽

第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400037

目的 探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷的保護作用及其潛在機制。方法 1）構(gòu)建細胞氧化損傷模型，將實驗分為4組，H2O2組使用含不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol·L-1）H2O2的培養(yǎng)液，CGRP+H2O2組使用含不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol·L-1）CGRP的培養(yǎng)液預處理后再加入含

降鈣素基因相關(guān)肽； 成骨細胞； 氧化損傷； 超氧化物歧化酶； 活性氧

頜面部的創(chuàng)傷和骨折在現(xiàn)代社會中很常見[1]。骨創(chuàng)傷愈合本身是一個受多種因子、信號、激素等精密調(diào)控的復雜的生理過程。其中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生在骨折的發(fā)生及修復過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[2]。真核細胞在正常代謝中均能產(chǎn)生ROS[3]；但過剩的ROS所造成的氧化應激反而會導致許多疾病的發(fā)生。過氧化氫（H2O2）是主要的活性氧之一，能穿透生物膜導致細胞的膨脹破裂，損傷線粒體，造成細胞器和蛋白質(zhì)的功能異常，從而對宿主細胞造成廣泛性的傷害。研究[4]表明，骨折發(fā)生時不僅會釋放大量的炎癥介質(zhì)，同時組織內(nèi)的ROS水平也會顯著增高；骨細胞在這樣的環(huán)境下功能會受到損傷，這也將嚴重影響骨的修復與愈合。

研究[5]證實，神經(jīng)系統(tǒng)參與骨重塑。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）作為骨組織中分布最為廣泛的神經(jīng)肽，被認為是骨的天然活化劑，它的潛在治療作用越來越受到廣泛的關(guān)注。CGRP是由特定神經(jīng)元的可變剪接生成的37個氨基酸所組成的[6]，其受體屬于G蛋白偶聯(lián)家族成員。骨創(chuàng)傷后，在創(chuàng)傷周圍的末梢神經(jīng)會分泌大量CGRP顆粒，且與其他神經(jīng)肽類物質(zhì)參與損傷修復和組織重建[7]。在體外實驗中，CGRP不僅能夠促進成骨細胞的增殖和分化，同時還能抑制破骨細胞的增殖；體內(nèi)實驗中，CGRP能促進骨折或者其他外傷的愈合。此外，CGRP還能抑制成骨細胞的凋亡[8]。通過這些結(jié)果，筆者推測CGRP對成骨細胞具有潛在的保護作用，那么在成骨細胞受到氧化損傷的過程中，CGRP是否還能夠?qū)Τ晒羌毎纳飳W活性起到積極的作用呢？本實驗對此進行研究，觀察CGRP對H2O2刺激下MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響，以及CGRP對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷的保護作用，旨在進一步了解骨創(chuàng)傷愈合機制以及CGRP在其中扮演的重要角色，以期為今后治療頜骨骨創(chuàng)傷提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MC3T3-E1成骨細胞（中國科學院細胞庫）；MEMα培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），PBS緩沖液干粉（武漢博士德生物工程有限公司），30%過氧化氫（重慶川東化工集團有限公司）、CGRP（Sigma公司，美國）、CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、ROS測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6定量分析酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海巧伊生物科技有限公司）。

本實驗采用第3代MC3T3-E1 成骨細胞。

1.2 構(gòu)建細胞氧化損傷模型及CCK-8法檢測細胞增殖活性

取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1成骨細胞以5×103個·mL-1的密度接種于96孔板內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞充分貼壁后隨機分組處理。實驗分為4組：對照組，H2O2組，CGRP+H2O2組，空白組。每組設3個平行孔。H2O2組：又分為5個小組，分別加入含不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol·L-1）H2O2的培養(yǎng)液100 μL；CGRP+H2O2組：又分為5個小組，分別使用含不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol·L-1）CGRP的培養(yǎng)液100 μL預處理1 h，再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液100 μL；對照組：加入常規(guī)培養(yǎng)液100 μL；空白組：用于調(diào)零，不接種細胞，僅加入常規(guī)培養(yǎng)液100 μL。將96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后棄去上清液，每孔加入10 μL CCK-8溶液和90 μL PBS緩沖液，輕微振蕩混勻后繼續(xù)孵育1 h，測定450 nm波長下的吸光度值，重復實驗3次，篩選最佳建模濃度和CGRP對成骨細胞氧化損傷的最佳保護濃度。

1.3 SOD活性測定

將MC3T3-E1成骨細胞接種于6孔板中，細胞密度為每孔3×106個，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞充分貼壁。實驗分為4組，CGRP+ H2O2組使用含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液1 mL預處理1 h，然后再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液1 mL；H2O2組中加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液2 mL；CGRP組中加入含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液2 mL；對照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)48 h后，收集細胞，按SOD測定試劑盒說明書進行操作，重復實驗3次。

1.4 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平

將MC3T3-E1成骨細胞接種于6孔板中，細胞密度為每孔3×106個，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞充分貼壁。實驗分為4組，CGRP+H2O2組使用含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液1 mL預處理1 h，然后再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液1 mL；H2O2組中加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液2 mL；CGRP組中加入含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液2 mL；對照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)48 h后，收集細胞培養(yǎng)液上清，按小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6定量分析ELISA試劑盒說明書進行操作，重復實驗3次。

1.5 ROS含量的測定

將MC3T3-E1成骨細胞接種于6孔板中，細胞密度為每孔3×106個，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞充分貼壁。實驗分為4組，CGRP+H2O2組使用含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液1 mL預處理1 h，然后再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液1 mL；H2O2組中加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液2 mL；CGRP組中加入含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液2 mL；對照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)48 h后，按ROS測定試劑盒說明書進行操作，重復實驗3次。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和單因素方差分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖活性

各組的細胞增殖活性見圖1、2。

圖1 H2O2對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響Fig 1 Effects of H2O2on MC3T3-E1 osteoblasts proliferation

1）MC3T3-E1成骨細胞在不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol·L-1）H2O2下培養(yǎng)12～48 h，細胞增殖活性在10-4mol·L-1H2O2時開始出現(xiàn)抑制（P＜0.01），并隨著濃度的增加和時間的后移，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性（圖1）；2）MC3T3-E1成骨細胞在不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol·L-1）CGRP的培養(yǎng)液預處理后，10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液中細胞增殖活性最高，與只加入10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）（圖2），提示10-8mol·L-1CGRP具有明顯的抗氧化損傷的作用，對MC3T3-E1成骨細胞的氧化損傷具有一定的保護作用。

圖2 CGRP對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響Fig 2 Effects of CGRP on MC3T3-E1 osteoblasts proliferation

2.2 細胞SOD活性

與對照組相比，CGRP組、CGRP+H2O2組SOD活性升高（P＜0.05），H2O2組SOD活性降低（P＜0.05）。CGRP+H2O2組SOD活性高于H2O2組（P＜0.01）（圖3）。提示：CGRP在一定程度上可以降低H2O2對MC3T3-E1成骨細胞SOD活性的抑制作用。

圖3 各組成骨細胞SOD活性的影響Fig 3 Osteoblasts activity of SOD of every group

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-6的水平

各組的TNF-α、IL-1β、IL-6水平見圖4。H2O2組TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于對照組（P＜0.01）；CGRP+H2O2組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于H2O2組（P＜0.05）。提示：CGRP的抗炎效應在MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷中發(fā)揮了一定的保護作用。

圖4 各組TNF-α、IL-1β、IL-6的水平Fig 4 TNF-α、IL-1β、IL-6 level of every group

2.4 ROS含量

CGRP+H2O2組、H2O2組、CGRP組、對照組的ROS含量分別為22.2%、32.6%、3.5%、11.0%。H2O2組ROS含量高于對照組（P＜0.01），CGRP+H2O2組ROS含量低于H2O2組（P＜0.01）。提示：CGRP具有抗氧化作用，其能抑制H2O2對MC3T3-E1成骨細胞造成的氧化損傷。

3 討論

骨的生理功能主要依賴骨重建的動態(tài)平衡。骨的生理活動取決于成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收之間的平衡，任何影響或者破壞骨重建平衡的因素均會導致骨代謝性疾病。成骨細胞是骨重建的重要細胞，它的質(zhì)量與數(shù)量將決定基質(zhì)的分泌，影響破骨細胞的功能。氧化應激是由細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS或者是機體的抗氧化防御機制受損所引起，現(xiàn)已證實氧化應激對骨代謝有重要的影響[9-11]。骨折的過程中伴隨著ROS的升高，直接會影響到骨修復。此外，H2O2會對MC3T3-E1成骨細胞造成氧化損傷，不僅體現(xiàn)在細胞會失去原有的形態(tài)，成骨細胞增殖也會受到明顯的抑制。

CGRP作為重要的感覺神經(jīng)遞質(zhì)，被證明在頜骨創(chuàng)傷修復、骨重建過程中發(fā)揮著重要作用[12]。本課題前期研究[5]證實，CGRP在下頜骨骨折愈合中的修復作用，有一部分是通過促進成骨細胞增殖來實現(xiàn)的。筆者推測，在頜骨損傷的修復機制中是否也存在一部分是依賴于CGRP抗氧化損傷的保護機制來實現(xiàn)的呢？本實驗結(jié)果表明，CGRP可以逆轉(zhuǎn)H2O2對MC3T3-E1成骨細胞增殖的抑制，并篩選了最優(yōu)勢濃度。此外，本研究結(jié)果還表明，CGRP能夠恢復H2O2對MC3T3-E1成骨細胞SOD活性的抑制。分析CGRP這種發(fā)揮抗氧化作用所涉及的機制，筆者認為，可能是因為CGRP增強了MC3T3-E1成骨細胞在H2O2下被抑制的SOD活性，SOD本身能夠清除MC3T3-E1成骨細胞因氧化損傷所產(chǎn)生的過量的超氧化物如ROS；ROS量的減少又可以改善MC3T3-E1成骨細胞的細胞活性，從而促進骨折的愈合。

近來，也有研究報道CGRP還具有抗炎的潛能。CGRP能夠抑制在內(nèi)毒素刺激下炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放，通過減少炎癥反應，抑制成骨細胞凋亡和破骨細胞活化從而促進骨折愈合[8,13]，這些結(jié)果也是CGRP積極參與骨修復的有力證據(jù)。在H2O2作用下，成骨細胞產(chǎn)生的ROS增多，ROS通過刺激破骨細胞釋放TNF-α等炎癥因子間接影響到成骨細胞的活性與增殖，進而影響骨折的愈合。

不論如何，CGRP可以減輕H2O2對MC3T3-E1成骨細胞SOD的負性影響，改善MC3T3-E1成骨細胞的增殖活性，能對氧化損傷下的MC3T3-E1成骨細胞產(chǎn)生保護作用，這一點是比較明確的。相關(guān)的研究還在繼續(xù)，我們在下一步的實驗中將會進一步揭示這種保護作用所涉及的信號分子及機制，以期為CGRP促進頜面部骨創(chuàng)傷的愈合提供新的靶點和依據(jù)。

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（本文采編 李彩）

Protective effect of calcitonin gene-related peptide against oxidative damage in MC3T3-E1 osteoblasts

Guo Junfeng, Zhang Huiyu, Zhang Gang, An Yang, Yang Yang, Wang Fei, Tan Yinghui. (Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81371110). Correspondence: Tan Yinghui, E-mail: tanyhxqkq@163.com.

Objective This study aimed to observe the protective effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP), as well as its potential mechanism, against oxidative damage in MC3T3-E1 osteoblasts. Methods 1) MC3T3-E1 osteoblasts were treated with different hydrogen peroxide (H2O2) concentrations (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, and 10-5mol·L-1) for 12, 24, 36, and 48 h to build an oxidative damage model, to determine cell proliferation activity in each group by using CCK-8 assay, and to determine the optimal modeling concentration. MC3T3-E1 osteoblasts were pretreated for 1 h with different CGRP concentrations (10-6, 10-7, 10-8, 10-9, and 10-10mol·L-1) followed by treatment with H2O2(10-4mol·L-1). After 12, 24, 36, and 48 h, the CGRP expression and activity of osteoblasts were detected using the CCK-8 method to determine the optimal CGRP concentration that provides the best protective effect against oxidative damage. 2) Superoxide dismutase (SOD) activity, reactive oxygen species (ROS) content, and the levels of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6 of the groups treated with CGRP, H2O2, CGRP+H2O2were determined. Results 1) Compared with the control group, treatment with 10-4mol·L-1H2O2significantly started to inhibite the proliferation of osteoblasts (P＜0.01) in a dose- and timedependent manner. Compared with 10-4mol·L-1H2O2group, pretreatment with 10-8mol·L-1CGRP significantly increased the proliferation of osteoblasts (P＜0.01). 2) Compared with H2O2group, CGRP+H2O2group significantly increased theSOD activity (P＜0.01), ROS content significantly decreased (P＜0.01), TNF-α, IL-1β, and IL-6 secretion significantly decreased (P＜0.05). Conclusion H2O2can cause oxidative damage to MC3T3-E1 osteoblasts, whereas CGRP exerts protective effect against oxidative damage in MC3T3-E1 osteoblasts.

calcitonin gene-related peptide; osteoblasts; oxidative damage; superoxide dismutase; reactive oxygen species

R 782.4

A

10.7518/hxkq.2016.06.007

2016-02-16；

2016-06-10

國家自然科學基金資助（81371110）

郭俊峰，碩士，E-mail：guojfkq@163.com

譚穎徽，教授，博士，E-mail：tanyhxqkq@163.com

10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液，對照組為常規(guī)培養(yǎng)液，空白組不接種細胞。培養(yǎng)12、24、36、48 h后，CCK-8法檢測細胞增殖活性，篩選最佳建模濃度和CGRP對成骨細胞氧化損傷的最佳保護濃度。2）采用含10-4mol·L-1H2O2（H2O2組）、10-8mol·L-1CGRP（CGRP組）的培養(yǎng)液和10-8mol·L-1CGRP+10-4mol·L-1H2O2培養(yǎng)液（CGRP+H2O2組）、常規(guī)培養(yǎng)液（對照組）培養(yǎng)成骨細胞，測定超氧化物歧化酶（SOD）的活性、活性氧（ROS）的含量以及炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。結(jié)果 1）在10-4mol·L-1H2O2時細胞增殖開始出現(xiàn)抑制（P＜0.01），并呈濃度和時間依賴性；10-8mol·L-1CGRP預處理后細胞增殖活性最高，與只加入10-4mol·L-1H2O2有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。2）與H2O2組相比，CGRP+H2O2組SOD活性升高（P＜0.01），TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05），ROS含量降低（P＜0.01）。結(jié)論 H2O2會對MC3T3-E1成骨細胞造成氧化損傷，CGRP對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷具有保護作用。