高夢瑩 徐倩倩 張婷婷 陳玉秋 趙文鈞 齊甜銘 馬得瑩

(東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱150030)

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重組鵝β-防御素7蛋白的原核表達及其生物學特性分析

高夢瑩 徐倩倩 張婷婷 陳玉秋 趙文鈞 齊甜銘 馬得瑩*

(東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱150030)

為探討鵝β-防御素7(AvBD7)的生物學特性，將鵝AvBD7基因亞克隆到大腸桿菌原核表達載體pProEX HTa的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切位點上，構建重組表達質粒pProEX-AvBD7，將重組質粒轉化到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞中，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)對其菌液進行誘導表達。經N-三(羥甲基)甲基甘氨酸十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分析，該重組蛋白大小為10～15ku，與預期大小結果一致。重組鵝AvBD7蛋白純化后，通過菌落計數(shù)的方法測定其體外抗大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌等抑菌活性，鹽離子濃度對其抗菌活性的影響及其對雞紅細胞的溶血活性。結果顯示，重組鵝AvBD7蛋白對所測定的5種細菌均有顯著抗菌活性(P<0.05)，且其抑菌活性隨蛋白濃度的增加而增強。高濃度鹽離子(150mmol/L)顯著抑制重組鵝AvBD7蛋白的抗菌活性(P<0.05)。重組鵝AvBD7蛋白對雞紅細胞沒有溶血活性(P>0.05)。由此可見，重組鵝AvBD7蛋白具有廣譜抗菌活性，高濃度鹽離子顯著降低其抗菌活性，且該重組蛋白不具有溶血活性。

鵝β-防御素7；重組蛋白；抗菌活性

自抗生素被廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)以來，其對維持畜禽健康、提高生產性能方面發(fā)揮了巨大作用。然而隨著抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中大量使用，抗生素所產生的副作用越來越受到生產者和消費者的關注。迫切需要一種既有效又環(huán)保的新方法或新產品來控制畜禽疾病，改善畜禽產品品質。防御素為參與機體最初防御活動的小分子多肽，是一類極為重要的內源性抗菌肽[1-4]，其主要分子特征為含有由6個半胱氨酸殘基組成的3個二硫鍵。大量研究表明，禽β-防御素(avian β-defensins，AvBD)具有廣譜抗菌活性，且無論是重組表達、天然存在或是人工合成的，均對細菌、真菌、螺旋體、囊膜病毒(如艾滋病)等具有很強的殺傷活性[1-2,5-7]，在機體的先天性免疫及獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。然而，天然抗菌肽分子量小，在機體內含量極少，分離提純困難，故天然產量非常有限?；瘜W合成難以實現(xiàn)其分子結構的正確構象，因此，利用基因工程技術生產防御素具有現(xiàn)實意義[8]。目前，已從鵝體內分離出AvBD1～AvBD7、AvBD9、AvBD10、AvBD12和AvBD16共11種防御素[9-11]。其中，鵝AvBD7包括完整的開放閱讀框(ORF)，它的cDNA由201個堿基組成，編碼66個氨基酸。本研究在前期研究的基礎上，采用組氨酸(His)標簽蛋白原核表達系統(tǒng)，將鵝AvBD7基因亞克隆到pProEX HTa上，構建重組表達質粒，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導，實現(xiàn)鵝AvBD7重組蛋白在大腸桿菌中的高效表達。并在體外測定鵝AvBD7重組蛋白的抗菌活性及理化活性，為進一步開展鵝防御素的研究與應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及質粒

重組質粒pMD18-T-AvBD7[9]、pMD18-T-Simple Vector、表達載體pProEX HTa及表達菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)Rosetta、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 9193、金黃色葡萄球(Staphyloccocusaureus)ATCC 29213、四聯(lián)球菌(Micrococcustetragenus)ATCC 2835、雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum)C79-11-S11、大腸桿菌BL21均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

ExTaq DNA聚合酶、限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、Marker、IPTG購自日本TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；蛋白純化復性試劑盒購自Novagen公司；所使用的試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 原核表達重組質粒的構建

根據(jù)pProEX HTa和重組質粒pMD18-T-AvBD7酶切位點設計1對鵝AvBD7特異性表達引物P1: 5′ GAATTCATGCAGCACGTCTTCCCTAG 3′，P2: 5′ CTCGAGTCAGTGCCTCCACCCCCTC 3′。其中P1的5′端含有EcoRⅠ酶切位點，P2的5′端含有XhoⅠ酶切位點，以重組質粒pMD18-T-AvBD7為模板，用表達引物進行PCR擴增。PCR擴增體系(25μL)：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plus dye)12.5μL，重組質粒pMD18-T-AvBD70.5μL，上、下游引物各1μL，用滅菌雙蒸水補足25μL。PCR擴增程序如下：94℃預變性5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)；72℃延伸10min；最后4℃保溫10min。

將擴增產物用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后克隆到原核表達載體pProEX HTa上，構建重組表達質粒pProEX-AvBD7，利用質粒PCR和雙酶切方法篩選陽性克隆。PCR擴增體系(25μL)：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plus dye)12.5μL，重組表達質粒pProEX-AvBD70.5μL，上、下游引物各1μL，用滅菌雙蒸水補足25μL。PCR擴增程序同前。酶切體系(10μL)：重組表達質粒pProEX-AvBD73μL，ddH2O 5μL，EcoRⅠ 0.5μL，XhoⅠ 0.5μL，10×H Buffer 1μL，37℃水浴中反應2h進行雙酶切鑒定。將陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.2 重組鵝AvBD7蛋白的表達及純化

將重組表達質粒pProEX-AvBD7轉化到表達感受態(tài)細胞大腸桿菌Rosetta中，挑取單個菌落在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)，待吸光度(OD)600nm值達到0.6～0.8時，留取1mL菌液作為對照，將終濃度為0.6mmol/L的IPTG加到剩余菌液中，進行蛋白的誘導表達，分別在誘導2、4、6h各留取1mL菌樣。按照Novagen公司的蛋白純化復性試劑盒說明書進行包涵體的純化、復性和透析，并測定重組蛋白濃度。留取1mL超聲波破碎離心的上清液和少量沉淀，將沉淀用100μL磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)重新懸起。將誘導前對照菌樣、誘導后菌樣、上清液、沉淀樣和純化后的蛋白進行N-三(羥甲基)甲基甘氨酸十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分析，用薄層掃描儀觀察結果。

其次，要綜合考慮上下游營改增政策的實行狀況，對定價和收款的方法進行合理的調整。尤其是下游不動產企業(yè)，在其執(zhí)行營改增政策以后，要對雙方的納稅需求進行統(tǒng)籌分析，提前籌劃，有效節(jié)省稅制變動成本的支出。

1.2.3 重組鵝AvBD7蛋白抗菌活性的測定

采取菌落計數(shù)法測定重組鵝AvBD7蛋白的抗菌活性。將純化后的重組鵝AvBD7蛋白與His標簽蛋白，用pH 7.4的無菌PBS稀釋，使其終濃度分別為50、100、250、500μg/mL，各取250μL加入無菌管中。將1.1.1所述各株細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后用相應的液體培養(yǎng)基將細菌稀釋到2×106CFU/mL，分別向各管中加入10μL稀釋后的細菌培養(yǎng)物，設PBS為陰性對照，每組設置3個平行。37℃振蕩孵育4h后，每個稀釋度各取100μL接種在相應的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，觀察并記錄每個營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落數(shù)量。3個相同稀釋度的營養(yǎng)平板的菌落數(shù)平均值作為該稀釋度樣品的菌落數(shù)。按接種量和稀釋倍數(shù)計算每管原液中的細菌量，繪制細菌存活率和重組蛋白濃度關系圖。

細菌的存活率(%)=(鵝AvBD7重組蛋白存活細菌數(shù)/陰性對照存活細菌數(shù))×100。

1.2.4 不同鹽離子濃度對重組鵝AvBD7蛋白抗菌活性影響

選取大腸桿菌(革蘭氏陰性菌，G-)和四聯(lián)球菌(革蘭氏陽性菌，G+)為檢測菌，用PBS調整氯化鈉(NaCl)濃度，使其濃度分別為0、50、100、150mmol/L。然后將重組蛋白分別用上述不同濃度的NaCl溶液稀釋至終濃度為250μg/mL，各取250μL分別加入無菌離心管中，同時設相應NaCl濃度的溶液為陰性對照，分別向各管加入細菌培養(yǎng)物10μL，每組設3個平行，37℃振蕩孵育4h，具體操作方法同1.2.3。

1.2.5 重組鵝AvBD7蛋白對雞紅細胞溶血活性的測定

新采集的抗凝無特定病原(SPF)雞血紅細胞用無菌PBS(pH 7.4)清洗并稀釋為2%～3%；重組鵝AvBD7融合蛋白用PBS稀釋為100、250、500μg/mL。取20μL蛋白分別加入無菌離心管中，0.2% Triton X-100作為陽性對照，PBS作為陰性對照。分別向每管加入180μL稀釋的紅細胞。每組設3個平行對照，37℃孵育1h，1000r/min離心10min后取上清，用微量紫外分光光度計測OD560nm值。每個樣品做3個重復，取平均值。

溶血活性(%)=[(OD蛋白-ODPBS)/(ODTriton-ODPBS)]×100。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 重組鵝AvBD7蛋白的表達和純化

以重組質粒pMD18-T-AvBD7為模板進行PCR擴增，構建表達用重組質粒pMD18-T-S-AvBD7。將表達用重組質粒及表達載體pProEX HTa分別進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，將其轉化到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)中，構建重組表達質粒并進行雙酶切和PCR鑒定及測序。電泳結果表明，酶切產物大小與質粒PCR擴增得到的條帶大小一致(157bp)，如圖1所示。重組質粒測序結果表明將編碼鵝AvBD7成熟蛋白基因成功插入原核表達載體的目的位點。Tricine-SDS-PAGE結果顯示，誘導后與誘導前的菌體蛋白相比，有1條明顯的蛋白條帶，大小為10～15ku且誘導2、4、6h的蛋白表達量隨時間增加而變大。將誘導后的菌液經超聲波破碎后，分別取上清和沉淀Tricine-SDS-PAGE分析，可見大部分重組蛋白在沉淀中，表明重組蛋白于大腸桿菌中以包涵體的形式存在。采用Novagen蛋白質純化復性試劑盒對重組蛋白進行純化。對純化后的蛋白進行Tricine-SDS-PAGE分析，觀察結果顯示可見10～15ku大小的蛋白帶，與預期蛋白相符，如圖2所示。獲得的重組鵝AvBD7融合蛋白采用微量紫外分光光度儀測得的濃度為2200μg/mL。

C：質粒pProEX HTa-AvBD7PCR產物；D：質粒pProEX HTa-AvBD7雙酶切產物；M：100bp ladder DNA marker。C: plasmid pProEX HTa-AvBD7PCR product; D: product of plasmid pProEX HTa-AvBD7restriction enzyme digestion; M:100bp ladder DNA marker.

2.2 重組鵝AvBD7蛋白抗菌活性的測定

采用菌落計數(shù)法測定重組鵝AvBD7蛋白對5種菌的抗菌活性。由圖3可知，與對照相比，重組鵝AvBD7蛋白對所測定的細菌具有顯著抑菌作用(P<0.05)。且隨著蛋白濃度的增加，抗菌活性增加。重組鵝AvBD7蛋白對四聯(lián)球菌的抗菌活性最強，在蛋白濃度為50～500μg/mL時都有極顯著作用(P<0.01)。對金黃色葡萄球菌抗菌活性較強，在蛋白濃度為100～500μg/mL時具有顯著或極顯著的抗菌作用(P<0.05或P<0.01)，對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌和枯草芽孢桿菌抗菌活性較低，只有在蛋白濃度為250～500μg/mL時，才有顯著或極顯著抗菌作用(P<0.05或P<0.01)。

2.3 不同鹽離子濃度對重組鵝AvBD7蛋白抗菌活性的影響

采用菌落計數(shù)法測定重組鵝AvBD7蛋白在不同鹽離子濃度下的抗菌活性。由圖4可知，無論是以革蘭氏陽性菌(四鏈球菌)還是革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)為檢測菌，當重組鵝AvBD7蛋白濃度為250μg/mL時，隨著鹽離子濃度的升高，細菌存活率上升，即抗菌活性下降。當鹽濃度達到100mmol/L時，重組鵝AvBD7蛋白對大腸桿菌的抗菌活性與對照(鹽濃度為0mmol/L)相比顯著下降(P<0.05)，當鹽濃度達到150mmol/L時，重組鵝AvBD7蛋白對四聯(lián)球菌的抗菌活性與對照(鹽濃度為0mmol/L)相比顯著下降(P<0.05)。

1：上清：2：包涵體：3：無IPTG誘導：4～6：IPTG誘導2、4、6h后融合蛋白表達；7：純化蛋白；M：蛋白質Marker (ku)。1: supernatant; 2: inclusion body; 3: without IPTG induction;4to 6: fusion protein expression on 2, 4and 6h after induction with IPTG; 7: purified protein; M: protein marker (ku).

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。* mean significant difference (P<0.05), ** mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.4 重組鵝AvBD7蛋白對雞紅細胞溶血活性的測定

本試驗以不同濃度的重組鵝AvBD7蛋白作為檢測對象，結果如圖5所示。不同濃度(100、250、500μg/mL)的重組鵝AvBD7蛋白對雞血紅細胞的溶血活性極低，與PBS陰性對照相比，差異不顯著(P>0.05)，表明該重組蛋白不具有溶血活性。

3 討 論

在過去的20多年中，有關雞、鴨、火雞、企鵝和駝鳥等AvBD的研究有了突破性進展。但是，對鵝抗菌肽的報道相對較少。大量研究表明，禽防御素對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有廣譜抗菌活性，在體外，對真菌同樣有殺傷作用[12-13]。然而天然抗菌肽在機體內含量極少，分離提純困難，化學合成難以實現(xiàn)其分子結構的正確構象，所以通過基因工程技術獲得防御素。由于抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，對宿主大腸桿菌有很強的殺傷力，不能在大腸桿菌中直接表達，以融合蛋白形式表達可解決問題。

圖4 NaCl濃度對重組鵝AvBD7蛋白抗菌活性的影響Fig.4 Effects of NaCl concentration on the antimicrobial activity of recombinant goose AVBD7protein

陽性對照：0.2% TritonX-100。Positive control：0.2% TritonX-100.

目前為止，谷胱甘肽硫轉移酶(GST)融合表達與His融合表達系統(tǒng)是原核表達最常用的2種表達系統(tǒng)。至今，已經有很多防御素通過GST融合表達系統(tǒng)大量表達，并且獲得良好效果[6-7,10,14-17]。但是由于GST的分子量相對于防御素很大，對其活性會產生影響，因此本試驗采用His融合表達系統(tǒng)表達重組鵝AvBD7蛋白。經Tricine-SDS-PAGE分析，大部分蛋白存在于包涵體中，由于目的蛋白形成包涵體后不具有生物活性，進一步用Novagen公司的Protein Refolding Kit試劑盒對包涵體進行復性，最后得到具有活性的重組蛋白。經抗菌活性測定，該重組蛋白對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌均有顯著抑菌作用，本研究結果與前人研究結果一致[1,18-19]，表明禽AvBDs具有廣譜抗菌活性。另有研究表明，不同種類防御素的抑菌種類有所不同。例如，雞AvBD1與AvBD2對白色念球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌等有抑制作用，而重組雞AvBD6對沙門氏菌的抗菌活性則較弱[20-21]；企鵝AvBD103a和AvBD103b則對枯草芽胞桿菌、煙曲霉菌和白色葡萄球菌有抑制作用[22]；鴨AvBD10對多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌等有抑制作用[23]。為探究His標簽對重組蛋白抗菌活性的影響，李妍妍[24]測定了His標簽蛋白對本試驗所用5種菌的抗菌活性，結果表明，His標簽蛋白不具有抗菌活性，說明該重組蛋白抗菌活性不受His標簽蛋白的影響。本研究進一步證實其結果。多種抗菌活性研究表明,AvBDs在高鹽條件下即失去抗菌活性[25]，這與前人報道一致[26-30]。本研究結果顯示，高濃度鹽離子(150mmol/L)顯著抑制重組鵝AvBD7蛋白對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抗菌活性。不僅是NaCl濃度對蛋白活性有影響，其他離子濃度或者沒有特定的離子也會對蛋白的抗菌活性產生影響[31]。這可能是因為高濃度離子破壞細菌外膜的陰離子和抗菌肽正電荷的相互作用而影響防御素的抗菌活性[26]。為了更深一步研究鵝防御素的性質，我們對該重組蛋白進行溶血活性的試驗，表明即使在最高濃度(500μg/mL)時溶血活性仍然非常低，這與禽源防御素和人源防御素溶血活性結果相一致[27-28]。上述表明，至今未發(fā)現(xiàn)防御素對動物細胞具有毒性?？赡苁怯捎趧游锛毎砻娲嬖谳^高水平的膽固醇以及缺少帶負電荷的磷脂，使其抑制了抗菌肽與之發(fā)生作用[32-33]。以上研究結果為日后AvBDs重組蛋白作為一種高效的肽類抗生素和禽類飼料添加劑等應用的可能性提供了理論基礎。

4 結 論

本研究應用原核表達載體pProEX HTa成功表達了重組鵝AvBD7蛋白，其大小在10～15ku，且表達的重組蛋白以包涵體的形式存在。該重組蛋白對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球、四聯(lián)球菌、雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌均有抗菌活性。在150mmol/L高濃度鹽離子下，重組蛋白對大腸桿菌和四聯(lián)球菌的抗菌活性顯著降低。此外，該重組蛋白對雞紅細胞的溶血活性極低。

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(責任編輯 武海龍)

Recombinant Expression and Biological Property Analysis of Goose Avian β-Defensin 7Protein

GAO Mengying XU Qianqian ZHANG Tingting CHEN Yuqiu ZHAO Wenjun QI Tianming MA Deying*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

The objective of the study was to investigate the biological property of goose avian β-defensin (AvBD) 7. The gene ofAvBD7was cloned into EcoRⅠ and XhoⅠ sites of pProEX HTa vector to construct recombinant plasmid pProEX-AvBD7. The recombinant plasmid was transformed intoEscherichiacoliRosetta and the bacteria was induced with isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG). It was analyzed by tricine sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE) that the recombinant protein size was 10to 15ku, which was the same as the expected size. Antimicrobial activity of the recombinant fusion protein againstEscherichiacoli,Salmonellapullorum,Staphylococcusaureus,MicrococcustetragenusandBacillussubtiliswas measuredinvitro. In addition, the effect of ionic strength on the antibacterial activity and hemolytic activity of the recombinant fusion protein were investigated. The results showed that the recombinant goose AvBD7protein exhibited significant antimicrobial activity against the five bacteria investigated (P<0.05), and antibacterial activity enhanced with the increasing of protein concentration. The antibacterial activity of recombinant goose AvBD7protein was significantly inhibited by high salt concentration (150mmol/L) (P<0.05). In addition, recombinant goose AvBD7protein showed little hemolytic activity against chicken erythrocytes (P>0.05). In conclusion, recombinant goose AvBD7protein exhibits extensive antimicrobial activity. High salt concentration significantly decrease its antibacterial activity. In addition, the recombinant goose AvBD7protein shows little hemolytic activity.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(4)：1114-1121]

goose β-defensin 7; recombinant protein; antimicrobial activity

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.04.020

2015-11-10

教育部博士點基金項目(20122325110016)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目(2013RFXXJ019)；黑龍江省應用技術研究與開發(fā)計劃項目(PC13S02)

高夢瑩(1990—)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。E-mail： 565462426@qq.com

*通信作者：馬得瑩，教授，博士生導師，E-mail： madeying@neau.edu.cn

S811.3

A

1006-267X(2016)04-1114-08

*Corresponding author, professor, E-mail: madeying@neau.edu.cn