王 偉， 陳 雪， 鐘兆銘， 儲紅映， 胡澤東， 程 瑞， 孫傳政

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 頭頸外科， 云南 昆明 650118)

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pSUPER-IL-11-shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定*

王 偉， 陳 雪， 鐘兆銘， 儲紅映， 胡澤東， 程 瑞， 孫傳政**

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 頭頸外科， 云南 昆明 650118)

目的： 構(gòu)建及測序鑒定重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA，檢測其對甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)細(xì)胞株sw579 IL-11基因的沉默效應(yīng)。方法:根據(jù)Genebank中IL-11 cDNA序列，設(shè)計并合成3對兩端有酶切位點的特異編碼IL-11shRNA序列的寡核苷酸鏈，退火成互補雙鏈后與pSUPER.retro.puro質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH-5α菌株，挑取單個抗性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及測序分析，脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ATC細(xì)胞株sw579，real-time PCR及ELISA檢測其對靶基因IL-11的表達(dá)影響。結(jié)果:重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA酶切產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，3個樣本均為陽性重組質(zhì)粒，測序鑒定3種重組質(zhì)粒pSUPER -IL-11-shRNA序列正確，轉(zhuǎn)染3種重組質(zhì)粒后sw579細(xì)胞裂解液中IL-11 mRNA和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-11蛋白顯著降低。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA，為進(jìn)一步探索IL-11在ATC進(jìn)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

甲狀腺腫瘤； 白細(xì)胞介素-11； RNA，小分子干擾； 短發(fā)夾RNA； 質(zhì)粒

甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)是人類惡性程度最高的腫瘤之一，占全部甲狀腺癌的1%～5%，但致死率卻占全部甲狀腺癌的14%～50%，臨床研究表明雖然甲狀腺癌治療方案不斷改進(jìn)和完善，但其確診后中位生存期只有3～9個月，1年生存率約20%[1-3]，因此有必要探索新的治療手段。IL-11屬于IL-6家族，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和腫瘤形成[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)IL-11高表達(dá)與肝細(xì)胞癌、胃腺癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并促進(jìn)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、軟骨肉瘤等實體腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5-7]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，ATC患者IL-11水平與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，與ATC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)，推測IL-11在ATC進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，因此有必要探索IL-11作為 ATC分子治療靶點的價值[1]。RNA干擾是利用高度保守的雙鏈小分子干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)誘發(fā)的基因沉默，阻斷體內(nèi)特異基因表達(dá)，可用于探索基因功能和惡性腫瘤的基因治療[8-9]。本實驗擬設(shè)計靶向IL-11的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，構(gòu)建IL-11的shRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染ATC細(xì)胞系sw579細(xì)胞，real-timePCR和ELISA技術(shù)檢測其沉默效應(yīng)，為進(jìn)一步探索IL-11在ATC進(jìn)展中的作用及其作為治療ATC分子靶點的價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.2 方法

1.2.1IL-11 shRNA序列設(shè)計與合成 根據(jù)Genbank中目的基因IL-11序列，按shRNA的設(shè)計原則設(shè)計3個針對IL-11基因的shRNA序列[10]， Sh-IL11-1#-S序列為5′-GATCTCCGCATCTGTGCCTTATTTATTTCAAGAGAATAAATAAGGCACAGATGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-1#-AS序列為5′-AGCTTTTCCAAAAAGCATCTGTGCCTTATTTATTCTCTTGAAATAAATAAGGCACAGATGCGGA-3′；Sh-IL11-2#-S序列為5′-GATCTCCGCCTGGGCAGGAACATATATTCAAGAGATATATGTTCCTGCCCAGGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-2#-AS序列為5′-AGCTTTTCCAAAAAGCCTGGGCAGGAACATATATCTCTTGAATATATGTTCCTGCCCAGGCGGA-3′；Sh-IL11-3#-S序列為5′-GATCTCCGCTGGATGCTTGGGTAACTTTCAAGAGAAGTTACCCAAGCATCCAGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-3#-AS序列為5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTGGATGCTTGGGTAACTTCTCTTGAAAGTTACCCAAGCATCCAGCGGA-3′。行BLAST對比分析。構(gòu)建3′端酶切位點之前加入Pol Ⅲ聚合酶終止信號TTTTT，以Loop(TCTCTTGAA)相連。兩端分別加入酶切位點BamHI和Hind Ⅲ，交上海Invitrogen公司合成，同時做無關(guān)序列對照。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將已合成的3個shRNA寡核苷酸單鏈模板稀釋至大約3 g/L。配制總體積50 μL的NEB buffer 3退火體系，正向引物1 μL，反向引物1 μL，10×緩沖液5 μL，雙蒸水43 μL，混勻，離心后置于沸水中，緩慢退火至室溫。取退火產(chǎn)物1 μL與pSUPER.puro.retro以TaKaRa DNA Ligation Kit中的Solution I連接后，16 ℃反應(yīng)2 h，使退火產(chǎn)物與表達(dá)載體連接。取3種pSUPER-IL-11-shRNA連接產(chǎn)物42 ℃熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α菌株，涂板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，氨芐青霉素(100 mg/L)篩選后，各隨機挑選1個經(jīng)轉(zhuǎn)化后的孤立菌落(編號#1、#2、#3)培養(yǎng)用天根質(zhì)粒小提試劑盒少量提取純化質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，并送上海Invitrogen公司測序。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 ATC細(xì)胞株sw579置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%時按Lipofectamine 2000說明書，將重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA #1、#2、#3和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sw579細(xì)胞，48 h后更換有1.0 mg/L嘌呤霉素(puromycin)的培養(yǎng)基篩選7 d左右，挑取存活細(xì)胞形成的克隆并擴大培養(yǎng)成穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，分別編號為IL-11KD#1、IL-11KD#2、IL-11KD#3和NC。

1.2.4 檢測IL-11 mRNA及蛋白表達(dá)水平 收集上述4種細(xì)胞，用Trizol裂解液裂解細(xì)胞并提取總RNA，按TakaRa公司試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 以cDNA為模板進(jìn)行real-timePCR分析，以GAPDH作對照。 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按IL-11 ELISA檢測試劑盒(R&D)說明書檢測上清液中IL-11蛋白濃度，并檢測細(xì)胞總蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組質(zhì)粒對sw579細(xì)胞IL-11蛋白及mRNA表達(dá)的抑制效果用率表示,組間比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA的酶切鑒定

在作文教學(xué)中，“情”“理”“法”是寫好作文的三大關(guān)鍵點，教師在作文教學(xué)中引領(lǐng)學(xué)生把握好這三個關(guān)鍵點，就能逐步征服作文教學(xué)這片“海洋”。

根據(jù)pSUPER.puro.retro載體的圖譜，用EcoR I和Hind III對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，得到281 bp的小片段以及6 061 bp的大片段。陽性重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳顯示在281 bp及6 061 bp處有條帶。樣本#1、#2、#3均為陽性重組質(zhì)粒。見圖1。

注：1、2、3分別為樣本，#1、#2、#3，4為陽性對照

2.2 重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA測序

重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA測序結(jié)果顯示各樣品中插入序列與設(shè)計的3個IL-11 shRNA序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)堿基錯配及突變。說明構(gòu)建表達(dá)IL-11shRNA的pSUPER-IL-11-shRNA真核表達(dá)載體可用于下一步沉默實驗。見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA測序結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA 的sw579細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-11蛋白表達(dá)

IL-11KD#1、#2、#3 sw579細(xì)胞中IL-11蛋白表達(dá)量較NC組明顯降低。IL-11KD#1、#2、#3細(xì)胞相對于NC組的抑制率分別為61%、70%和52%。見圖3。

與NC組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01

2.4 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSUPER-IL-11-shRNA 的sw579細(xì)胞裂解液中IL-11 mRNA表達(dá)

Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)染各干擾載體后sw579細(xì)胞裂解液中IL-11 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示IL-11KD#1、#2、#3中IL-11 mRNA表達(dá)水平較NC組明顯下調(diào)，IL-11KD#1、#2、#3組相對于NC組的mRNA抑制率分別為86%、94%和70%，見圖4。

與NC組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01

3 討論

甲狀腺未分化癌診斷時大約有20%～50%的患者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，目前尚無公認(rèn)治療模式，因此積極探索ATC的發(fā)病和進(jìn)展機制，尋找治療ATC分子靶點對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要[1-3,11-13]。既往研究發(fā)現(xiàn)ATC患者血小板計數(shù)以及促進(jìn)血小板生成的IL-11水平均與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，且IL-11與ATC患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)，推測IL-11在ATC進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，因此探討IL-11作為ATC分子治療靶點具有重要意義[1]。

RNA干擾及基因沉默現(xiàn)象首先由Fire等[14]提出，其機制是雙鏈RNA被核酸酶切割成siRNA，后者與靶基因mRNA特異結(jié)合并降解，進(jìn)而抑制該基因的表達(dá)及功能[15]。制備siRNA的方法常用的有體外化學(xué)合成和DNA載體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA。前者是將化學(xué)合成的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，此法方便，無需構(gòu)建載體等繁瑣操作，但其表達(dá)隨細(xì)胞傳代而逐漸減弱，持續(xù)時間短，不適合長時間進(jìn)行細(xì)胞功能實驗。DNA載體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA為短發(fā)卡RNA表達(dá)載體法，通過DNA載體與靶序列重組后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞核；shRNA由一條RNA 單鏈自身折疊形成雙鏈的莖，加上一條單鏈Loop環(huán)構(gòu)成，在細(xì)胞內(nèi)會被自動加工成21～23 bp的雙鏈siRNA，它在細(xì)胞中可與靶基因的mRNA結(jié)合并降解靶基因mRNA，從而干擾其翻譯形成蛋白質(zhì)[16]，此法通過抗性基因的篩選從而獲得持續(xù)干擾目的基因的細(xì)胞株，為長期的細(xì)胞實驗提供基礎(chǔ)。

本文以IL-11為靶基因，根據(jù)siRNA設(shè)計原則[10]，通過RNA二級結(jié)構(gòu)分析，在其mRNA的不同靶位點設(shè)計了3條針對目的基因的shRNA序列，并成功克隆至pSUPER.retro.puro質(zhì)粒中，經(jīng)凝膠電泳和基因測序鑒定證實成功構(gòu)建了3個shRNA的表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的3個干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染sw579細(xì)胞后，ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染IL-11KD#1、#2、#3組的sw579細(xì)胞IL-11蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平均顯著降低，其抑制IL-11表達(dá)的效率都超過了50%，有效地沉默了IL-11基因的表達(dá)，該細(xì)胞模型的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步研究IL-11基因?qū)谞钕傥捶只┥飳W(xué)特性的影響及開展體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

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(2016-08-02收稿，2016-11-01修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

《貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報》更名啟事

經(jīng)國家新聞出版廣電總局(新廣出審〔2016〕267號文)批準(zhǔn)，原《貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報》更名為《貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》，國內(nèi)統(tǒng)一連續(xù)出版物號由CN52-5012/R更改為CN52-1164/R，主管、主辦單位變更為貴州醫(yī)科大學(xué)，出版單位變更為《貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部(為貴州醫(yī)科大學(xué)內(nèi)設(shè)機構(gòu))。其他登記項目不變。

特此公告

《貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部

Construction and Identification of pSUPER-IL-11-shRNA

WANG Wei, CHEN Xue, ZHONG Zhaoming, CHU Hongying, HU Zedong, CHEN Rui, SUN Chuanzheng

(DepartmentofHeadandNeckSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To construct and identify pSUPER-IL-11-shRNA and detect the silencing effect of IL-11 gene of sw579 cell line of anaplastic thyroid carcinoma (ATC). Methods: According to IL-11 cDNA gene sequence in the Gene bank, three pairs of oligonucleotides with specific coding IL-11shRNA sequence, each containing the sites of restriction endonuclease at both ends, were designed and synthesized. After annealing, the complementary double strands were connected with pSUPER.retro.puro plasmid vector, which was transfected into DH-5α bacterial strain. The single resistance clone was collected. The plasmid was extracted and the recombinants were identified by 1% agarose gel electrophoresis, sequenced and analyzed. Liposome mediated recombinant plasmid was transfected into sw579 cell line of ATC, and real-time PCR and ELISA were adopted to detect its effect on the expression of target gene IL-11. Results: The results gel electrophoresis for enzyme-digested product showed that the pSUPER IL-11shRNA was successfully constructed. 3 samples were all positive recombinant plasmids, and the sequences of 3 recombinant plasmids of pSUPER-IL-11-shRNA were identified by sequencing. IL-11 mRNA in sw579 cell lysis solution and IL-11protein in cell culture supernatant of sw579 cells were significantly decreased after transfection of 3 recombinant plasmids. Conclusion: pSUPER-IL-11shRNA expression vector has been successfully constructed, and makes it possible to further explore the role of IL-11 in ATC.

thyroid neoplasm; interleukin-11; RNA， small molecule interference; short hairpin RNA; plasmid

國家自然科學(xué)基金(81560470,81260402); 云南省高層次衛(wèi)生技術(shù)人員專項經(jīng)費(D-201243); 云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才專項經(jīng)費(2015HB086)

E-mail:scz008@126.com

時間：2016-11-15 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.014.html

R34-33； R736.1

A

1000-2707(2016)11-1269-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.007