胡秀英, 方 琴, 王季石, 馬 丹, 蔣 麗

(1.貴州醫(yī)科大學附院 血液內科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽 550004)

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·基礎研究·

高表達ALDH2基因改善血管內皮細胞功能的初步研究*

胡秀英1, 方 琴2**, 王季石1, 馬 丹2, 蔣 麗2

(1.貴州醫(yī)科大學附院 血液內科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因導入人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)后對其增殖和抗氧化損傷的影響。方法:將培養(yǎng)的HUVECs分為轉染目的基因組(轉基因組)、轉染空載體組(空質粒對照組)和未轉染質粒組(陰性對照組)，轉基因組采用脂質體介導的方法將含人ALDH2基因的真核表達載體導入HUVECs中，采用RT-PCR和Western blot檢測各組ALDH2基因和蛋白的表達；采用不同濃度過氧化氫(H2O2)(0、50、75、100和125 μmol/L)孵育HUVECs 48 h后，檢測各組細胞增殖水平及氧化損傷程度，檢測各組細胞中血紅素氧合酶(HO-1)、 ROS及一氧化氮(NO)含量的變化。結果：轉基因組熒光強度和數(shù)量比陰性對照組顯著提高，提示導入的ALDH2基因在HUVECs細胞得到高表達；與空質粒對照組和陰性對照組比較，轉染72 h后，轉基因組細胞ALDH2 mRNA和蛋白表達增加(P<0.01)；不同濃度H2O2孵育48 h后，轉基因組HUVECs存活率明顯升高(P<0.05)；轉基因組可抑制一定濃度H2O2誘導的ROS水平的升高、 降低HO-1表達及增加NO的產生，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：ALDH2基因高表達可降低低氧自由基引起的HUVECs細胞的損傷，保護內皮細胞的生物學功能。

乙醛脫氫酶2； 轉染； 氧化損傷； 一氧化氮； 內皮細胞

骨髓造血微環(huán)境內有大量由血管內皮細胞(endothelial cells, ECs)構成的血竇存在，它與造血干細胞密切接觸，影響造血細胞的增殖與自我更新、遷移及定位[1]。然而，ECs在移植后，在機體病理狀態(tài)下易受到氧化應激、炎癥因子以及藥物等刺激因素引起的損傷，而氧化應激引起的損傷是內皮損傷發(fā)生發(fā)展過程中的共同機制之一[2]。研究ECs氧化損傷機制及其保護對策，對于維持ECs功能的完整性，保護血管微環(huán)境，促進造血重建具有積極的意義。乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是乙醛脫氫酶(ALDH)家族中醛類代謝活性最強的同工酶，參與了各種內源性和外源性脂肪族及芳香族醛類物質代謝或解毒的過程，具有脫氫酶和酯酶等多種酶功能[3]。由于ALDH2在保護細胞抗毒性、抗氧化損傷及抗凋亡等方面的作用明顯，被廣泛的應用于消化系統(tǒng)和心腦血管疾病等防治的研究中，但是在造血微環(huán)境的細胞內皮功能方面研究較少，其改善血管內皮功能作用機制有待進一步研究和和闡明[4-5]。本課題將ALDH2基因導入人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)探討其對HUVECs增殖和抗氧化損傷的影響，研究ALDH2基因改善血管內皮功能的作用，為下一步研究其改善造血微環(huán)境的功能提供體外的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)細胞株由貴州醫(yī)科大學免疫細胞室提供并鑒定。真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA+-ALDH2構建方法由本實驗室提供，經PCR、EcoR I及BamHI酶切及送金思特科技(南京)有限公司測序序列比對正確率100%[6-7]。THIzol、逆轉錄試劑盒、LipofectamineTM2000(脂質體)均為美國Invitrogen公司產品，胰蛋白酶為美國Amresco公司產品，MTT、DMSO為南京賽蘭博科技有限公司產品，L-DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，鼠抗人ALDH2一抗、羊抗鼠二抗購置中國臺灣Abnova公司，ALDH2、血紅素氧合酶1(HO-1)、β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。一氧化氮(NO)檢測試劑盒購置南京建成生物工程研究所，ECL發(fā)光試劑由美國Santa Cruz公司提供，活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUVECs細胞培養(yǎng)和ALDH2轉染細胞系的建立 HUVECs細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和0.03% L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，以5×104/mL細胞密度接種至50 mL培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)、傳代。實驗分為轉染目的基因組(轉基因組)、轉染空載體組(空質粒對照組)以及未轉染質粒組(陰性對照組)。 轉染前將待轉染人HUVECs細胞消化成懸浮狀態(tài)，以1×105/mL細胞密度接種于6孔板上，每孔3 000 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中備用；待6孔板中細胞生長至1.5×106/mL左右時，將含目的基因質粒和空載體質粒各2 μg與脂質體8 μL加入500μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基中，混勻后室溫放置15 min后分別對應加入轉基因組和空質粒對照組。陰性對照組只加500 μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基。將3組細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，向3組細胞中各加入5 mL預熱至37 ℃ 的DMEM 培養(yǎng)基(含血清及雙抗)繼續(xù)孵育。轉染48 h后的HUVECs細胞換用含500 mg/L G418的培養(yǎng)基，每3～5 d換液1次，篩選2周至抗性克隆形成后，換用250 mg/L G418繼續(xù)篩選1周得到轉染目的基因的細胞。

1.2.2 HUVECs細胞轉染情況 采用間接免疫熒光法觀察細胞轉染情況。將轉染24、48、72、 96和120 h后使各孔細胞貼附于玻片上，采用多聚甲醛固定10 min制成細胞爬片。pH7.4的0.01 mol/L PBS洗滌兩次，滴加含5%小牛血清的封閉液，37 ℃封閉30 min。PBS洗滌1次，每次5 min，滴加特異性ALDH2小鼠抗人一抗(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜。含0.5% Triton X-100的PBS洗滌3次，每次5 min，滴加熒光素標記二抗(羊抗小鼠FITC-IgG，1∶100)，37 ℃，避光孵育30 min。含0.5% Triton X-100 的PBS洗滌3次后，伊文斯蘭染色，滴加10%甘油磷酸緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察熒光強度，拍照，根據(jù)熒光強度判斷蛋白表達的強弱。

1.2.3ALDH2 mRNA和蛋白的表達檢測 采用逆轉錄PCR(RT- PCR)法檢測ALDH2 mRNA。收集各孔細胞，用TRIZOL試劑提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，并將逆轉錄的cDNA作為模板進行PCR反應，檢測ALDH2 基因mRNA的表達。β-actin1作為內對照,PCR引物如下：β-actin1上游5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′， 下游5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′(564 bp);ALDH2上游5′-GACACGGATCCATGTTGCGCGCTGCCGCCCGCTTCGG-3′，下游5′-GACACGAATTCTTATGAGTTCTTCTGAGGCACTTTGAC-3′(1 576 bp)。PCR 條件是94 ℃預變性5 min，然后35循環(huán)包括94℃變性50 s,65 ℃ 退火45 s；72℃延伸60 s，最后72 ℃延伸min。反應結束后，取反應液10 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳，照相記錄結果。使用Bandscan軟件分析條帶結果，計算得到目的基因的mRNA相對表達量。 采用Western blot檢測蛋白表達情況，將各孔細胞消化后，PBS洗2次，加入細胞裂解液100 μL在冰上裂解30 min，裂解過程反復劇烈振蕩。12 000 r/min離心15 min，吸取上清備用。BCA蛋白定量試劑盒測蛋白含量。上述方法得來的樣品處理液加入上樣Buffer，然后放在沸水(>95 ℃)浴中加熱5 min使蛋白變性，作為點樣用樣品。表達產物經過SDS-聚丙酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜上。經封閉液(5%脫脂奶粉，1×PBS，pH 7.4)封閉后加鼠抗人ALDH2一抗(1∶2 500)孵育2 h后洗滌，加入羊抗鼠二抗(1∶500)室溫孵育1 h，洗膜后用ECL試劑滴加在膜上，曝光顯影，洗出條帶。

1.2.4 過氧化氫(H2O2)細胞毒性 采用MTT法檢測H2O2細胞毒性。取各組細胞，調整細胞密度為1.5×105/mL，各取100 μL加入96孔板中，再分別加入不同濃度H2O2(0、50、75、100和125 μmol/L)孵育各組細胞24 h，每孔設6個復孔，以未加藥組為對照。37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，取出96孔板，每孔加MTT(5 g/L)液20 μL，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。1 500 r/min、37 ℃、離心5 min，吸棄上清。每孔加入二甲基亞砜100 μL,置搖床上搖10 min，使結晶充分溶解。選擇測定波長570 nm(490 nm為對照)，酶標儀上測定各孔吸光度，并記錄結果。按公式計算存活率：存活率(%)=A試驗組/A對照組×100% 。

1.2.5HO-1 mRNA檢測 經不同濃度H2O2的DMEM培養(yǎng)基孵育48 h之后，收集各孔細胞進行RT-PCR反應，檢測HO-1 mRNA的表達。以β-actin2作為內參, 反應條件如前面所述，HO-1上游 5′-CAGGCAGAGAATGCTGAGTTC -3′，下游5′-GATGTTGAGCAGGAACGCAGT- 3′(550 bp)；β-actin2上游5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′，下游5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′(353 bp)。如前所述計算得到目的基因的相對表達量。

1.2.6 ROS檢測 采用免疫熒光法檢測ROS，按照試劑盒說明書操作。取各組細胞，調整細胞密度為1.5×105/ mL，各取2.5 mL加入六孔板中，再加入2.5 mL含不同濃度H2O2的DMEM培養(yǎng)基(終濃度分別為0、50、75、100和125 μmol/L)，每組設三個復孔。培養(yǎng)48 h后收集細胞。加入稀釋好的DCFH-DA 500 μL，37 ℃孵育20 min。DCFH-DA本身沒有熒光，但進入細胞后，可被細胞內酶水解生成DCFH，ROS可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光DCF, 檢測DCF 的熒光可反映細胞內ROS的水平。用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗3次后，加入無血清培養(yǎng)液3 mL吹打均勻，在30 min時通過熒光分光光度計測定熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長535 nm。

1.2.7 NO含量檢測 采用硝酸還原酶法檢測NO的含量。按照NO檢測試劑盒說明，加入試劑混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調零，550 nm，0.5 cm光徑,采用可見分光光度法測各管吸光度值。NO含量計算公式：NO含量(μmol/L)=((測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度))×標準品濃度(100 μmol/L) ×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1ALDH2基因轉染情況

轉基因組熒光強度和數(shù)量比陰性對照組顯著提高，提示導入的ALDH2基因在HUVECs細胞得到高表達。24 h時，與陰性對照組相比，空質粒對照組的熒光強度沒有明顯差別，但是轉染ALDH2基因的細胞可見微弱熒光；72 h時，ALDH2蛋白在轉基因組中呈現(xiàn)較高的表達。以72 h轉基因組細胞熒光強度為對照，24 h呈現(xiàn)較弱表達，48 h表達的熒光與72 h的熒光強度均屬強表達，96 h之后逐漸減弱，并且轉基因組的熒光至少可以維持7 d以上。見圖1。

A:陰性對照組48 h B：空載體對照組48 h C:轉基因組48 h

2.2ALDH2 mRNA和ALDH2蛋白的表達

RT-PCR檢測3組細胞的在轉染72 h后 mRNA的表達,同時設立內參。RT-PCR結果顯示轉基因組ALDH2的表達明顯比空質粒對照組和陰性對照組高(P<0.01)(圖2)。Western Blot 結果顯示，轉染組在相對分子質量54×103處出現(xiàn)較亮的目的條帶，空質粒對照組和陰性對照組很弱，說明轉染基因ALDH2在蛋白水平得到表達(P<0.01)(圖3)。

2.3 HUVECs存活率

不同濃度H2O2孵育48 h后，轉基因組HUVECs存活率顯著高于空質粒對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，n=6)(圖4)，顯示ALDH2基因轉染之后內皮細胞對H2O2引起的氧化損傷耐受增加。

2.4 ROS、HO-1mRNA和內源性NO的表達

50、75、100和125 μmol/L H2O2孵育48 h, 各組HUVECs的ROS水平逐漸升高。與空質粒對照組比較，75、100和125 μmol/L H2O2濃度下，轉基因組HUVECs可抑制H2O2誘導的ROS水平的升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明在一定濃度范圍內，ALDH2轉染能顯著降低H2O2誘導的ROS水平的增高。 不同濃度的H2O2孵育各組HUVECs細胞48 h, 各組HUVECs的HO-1表達水平逐漸升高。與空質粒對照組及陰性對照組比較，在100、125 μmol/L H2O2濃度下，轉基因組HUVECs細胞HO-1mRNA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。0、75、100和125 μmol/L H2O2濃度下孵育各組HUVECs細胞48 h,NO隨著H2O2濃度增大而降低。與空質粒對照組比較，轉基因組HUVECs在100和125 μmol/L H2O2濃度下NO的表達明顯升高(P<0.05)。見表1。

注：A為 RT-PCR電泳圖， B為 相對灰度值；(1)與陰性對照組、空質粒對照組比較，P<0.01

注：A為 Western blot蛋白印跡圖，B為相對灰度值；(1)與陰性對照組、空質粒對照組比較，P<0.01

(1)與同濃度H2O2處理的轉基因組比較，P<0.05；(2)與

3 討論

造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)定居、增殖、分化和發(fā)育的場所，主要由基質細胞、基質細胞分泌的細胞因子及細胞外基質組成。而內皮細胞是基質細胞組成的重要成分之一。對腫瘤患者放或化療及移植前預處理是損傷造血微環(huán)境的重要因素。該處理可產生大量的氧自由基及炎性因子，使得造血微環(huán)境中ROS大量堆積，損傷造血微環(huán)境，造血微環(huán)境中的多種基質細胞結構和功能受到損傷，影響造血重建。防護氧化損傷，對造血微環(huán)境的保護具有積極的意義。ALDH2是乙醛脫氫酶(ALDH)家族中醛類代謝活性最強的同工酶，過去的研究表明，ALDH2具有一定的抗氧化損傷的作用[7]。本實驗中將構建的ALDH2真核表達載體導入HUVECs中，研究ALDH2過表達在該細胞中的生物學作用及是否具有改善內皮功能的作用，為下一步明確其是否具有改善造血微環(huán)境及促進造血重建的功能提供前期的實驗依據(jù)。

表1 不同濃度H2O2處理48 h后各組細胞HO-1 mRNA及ROS，NO水平(±s)Tab.1 HO-1 mRNA,ROS，NO levels in each cell group after treated with different concentrations of H2O2 for 48 h

本實驗中，將構建pcDNA3.1-ALDH2真核表達載體轉染進HUVECs中，并得到穩(wěn)定表達。HUVECs具有內皮細胞的大部分功能，所以我們選用該細胞系作為研究對象。為驗證ALDH2促細胞增殖和抗氧化應激引起的損傷的作用，我們選用了H2O2作為過氧化反應的誘導劑，因為H2O2是典型的O2還原生成H2O的過程中的代謝產物，它的重要的生物學意義在于產生高活性的羥基基團，它的半衰期比ROS長，在體外實驗中常被用于誘導氧化應激反應。本研究結果顯示，隨著H2O2濃度的增加，HUVECs明顯減少，而轉染ALDH2之后，細胞的損傷程度降低，細胞活性明顯比未轉基因組高。ALDH2可以保護HUVECs細胞對H2O2引起的損傷，促進細胞增殖，該過程伴隨著ROS水平的降低，顯示其可能與防護過氧化損傷有光。

本試驗中被激活的HO-1(也是一種熱休克蛋白)在轉染ALDH2之后隨著ROS的降低而降低。而在急性應激反應中，被激活的HO-1(也是一種熱休克蛋白)反應了機體對氧化應激的防護。HO-1在機體內是可誘導的，可以被強烈的誘導來對細胞應激和多種氧化刺激產生反應，熱休克、重金屬、血紅素、應激、低氧、內毒素、細胞因子及氧化劑等均可誘導HO-1的適應性表達[8]。HO-1通過分解血紅素要消耗3分子O2，可消耗大量的內源性ROS，減少組織的脂質過氧化來發(fā)揮抗氧化應激的作用。而且該過程伴隨著ROS水平的下降和可以在急性應激反應中被激活的HO-1(也是一種熱休克蛋白)的產生降低。ROS 和HO-1水平的下降可能是過氧化反應的終末產物4-HNE被ALDH2清除之后，與過氧化損傷相關的信號通路以及其他重要分子的作用沒有被級聯(lián)放大的結果。本實驗結果顯示，HO-1的表達隨著H2O2濃度的增加而增加，但是在轉染ALDH2之后，伴隨著ROS的減少也隨之降低，進一步說明在ALDH2轉染之后，細胞對氧化應激的防護能力得到了顯著地提高。

NO是內皮細胞釋放最為重要的內皮源性血管舒張因子，除了能引起血管舒張外，還具有抑制炎性細胞的聚集分化、白細胞黏附、血小板聚集、平滑肌細胞增生等多種功能，對于維持血管內皮功能具有重要的作用[9]。NO的水平高低也反映了內皮功能的情況。我們也發(fā)現(xiàn)經ALDH2基因轉染組細胞產生NO的能力明顯高于轉空載體組及未轉基因組。因此，ALDH2可能通過促進NO的產生發(fā)揮內皮功能的保護效應，但是ALDH2能否通過NO促進VEGF的產生，從而促進血管的生成，還值得我們進一步的研究。

本實驗中，高表達ALDH2基因促進HUVECs細胞的增殖并使HUVECs細胞對抗氧自由基引起的氧化損傷作用大大降低，該過程還伴隨著HO-1表達和ROS水平的降低以及NO的產生的增加，這對進一步研究該基因在內皮細胞功能的保護和造血微環(huán)境中扮演的生物學功能提供了實驗基礎。

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(2016-07-22收稿，2016-10-30修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉 華

A Preliminary Study of Improving the Function of Vascular Endothelial Cells with High Expression of ALDH2 Gene

HU Xiuying1， FANG Qin2， WANG Jishi1， MA Dan2， JIANG Li2

(1.DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofPharmacy,theAffiliatedBaiyunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) gene on the proliferation and anti-oxidative damage of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods: HUVECs were divided into 3 groups：transfected target gene group (transgenic group) transfected empty vector group(empty plasmid control group ) and non transfected plasmid group (negative control group). In the transgenic group, the eukaryotic expression vector containing human ALDH2 gene was introduced into HUVECs by liposome mediated method. Western blot RT-PCR were used to detect the expression of ALDH2 gene and protein in each group. Different concentration of H2O2(0, 50, 75, 100 and 125 μmol/L) were incubated with HUVECs. 48 hours later, the level of cell proliferation and the degree of oxidative damage were detected in the cells of each group and the changes of HO-1, ROS and NO level were detected in the cells of each group. Results: The fluorescence intensity and number of transgenic group were significantly higher than that of negative control group, suggesting that the ALDH2 gene was highly expressed in HUVECs cells. Compared with empty plasmid control group and negative control group, the expression of mRNA and protein of ALDH2 gene in the transgenic group were increased (P<0.01) 72 h after transfection. The survival rate of HUVECs cells in transgenic group was significantly increased (P<0.05) after 48 h incubation with different concentrations of H2O2. The transgenic group could inhibit the increase of ROS induced by a certain concentration of H2O2, reduce the expression of HO-1 and increase the production of NO, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: High expression of ALDH2 Gene can reduce the damage of HUVECs cells induced by low oxygen free radicals, and protect the biological function of endothelial cells.

aldehyde dehydrogenase 2; transfection; oxidation damage; nitric oxide; endothelial cell

國家自然科學基金資助項目(No.81360501); 貴州省科學技術基金資助項目[黔科合SY字(2012)3138]]； 貴州省科學技術基金資助項目[黔科合LH字(2014)7130]； 貴州省省長基金臨床應用課題專項研究資助項目[黔省專合字(2012)97]

E-mail:fq_fangqin@sina.com

時間：2016-11-15 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.019.html

R34-33； R361

A

1000-2707(2016)11-1263-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.006