尹柏雙 ， 宋永利 ， 呼顯生 ， 沙萬(wàn)里 ， 石星星 ， 高 利 ， 付連軍

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林吉林132101；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

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強(qiáng)痛寧對(duì)大鼠中樞腦區(qū)NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響

尹柏雙1， 宋永利1， 呼顯生1， 沙萬(wàn)里1， 石星星2， 高 利2， 付連軍1

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林吉林132101；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

為了研究強(qiáng)痛寧麻醉下大鼠中樞腦區(qū)一氧化碳合酶(NOS)活性、NO和環(huán)烏苷酸(cGMP)濃度變化，探討強(qiáng)痛寧麻醉鎮(zhèn)痛的中樞作用機(jī)理。將24只SD大鼠隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、誘導(dǎo)期、麻醉期和催醒期組，于不同時(shí)期采集大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、腦干、海馬和丘腦。采用比色法測(cè)定NOS 活性和NO含量，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定cGMP濃度。結(jié)果表明，腹腔注射強(qiáng)痛寧6 mg/kg體重后，麻醉期各腦區(qū)NOS活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)；NO產(chǎn)量與對(duì)照組比較降低極顯著(P<0.01)；cGMP濃度降低顯著(P<0.05 或P<0.01)。結(jié)果提示，強(qiáng)痛寧抑制大鼠中樞腦區(qū)NOS活性，阻斷NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是其產(chǎn)生全麻作用的重要機(jī)理之一。

強(qiáng)痛寧 ； 一氧化氮合酶 ； 一氧化氮/環(huán)鳥(niǎo)苷酸 ； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，參與肌肉收縮、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等生理過(guò)程[1]，是胞內(nèi)重要的信號(hào)通路之一[2]。其通路中的氣體信號(hào)分子一氧化氮(NO)，具有激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，提高環(huán)鳥(niǎo)苷酸含量，維持細(xì)胞間信號(hào)傳遞功能[3]。環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)起到傳遞細(xì)胞內(nèi)信息作用[4]，一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的關(guān)鍵酶[5]。研究發(fā)現(xiàn)，NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了麻醉藥對(duì)神經(jīng)突觸作用，產(chǎn)生麻醉鎮(zhèn)痛現(xiàn)象[6-7]。強(qiáng)痛寧是一種麻醉性鎮(zhèn)痛劑，由延胡索乙素、三七、高烏甲素、蟾蜍、冰片等成分組成的復(fù)方中藥制劑，具有無(wú)依賴(lài)性、成癮性和耐受性?xún)?yōu)點(diǎn)，對(duì)呼吸功能產(chǎn)生輕度抑制，在人類(lèi)疼痛性疾病的強(qiáng)烈疼痛期有所應(yīng)用[8-9]。在動(dòng)物臨床麻醉中，強(qiáng)痛寧作為復(fù)合麻醉或復(fù)合麻醉劑的組成部分，被廣泛應(yīng)用于犬、貓等寵物的臨床麻醉[10]。而強(qiáng)痛寧產(chǎn)生麻醉鎮(zhèn)痛作用機(jī)理無(wú)人報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探討強(qiáng)痛寧麻醉下大鼠中樞腦區(qū)NOS活性、NO和cGMP含量變化，擬從NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路揭示強(qiáng)痛寧麻醉鎮(zhèn)痛作用分子學(xué)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品及主要試劑 強(qiáng)痛寧(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，批號(hào)130719)；NOS測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130815)；NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130812)；考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130816)；Rat cGMP Elisa Kit(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130915)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SD純種大鼠24只，體重200±20 g，雌雄兼?zhèn)?，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，同一條件下飼養(yǎng)2 周后進(jìn)行試驗(yàn)。隨機(jī)取6只作為生理鹽水對(duì)照組(腹腔注射1.2 mL/kg體重生理鹽水)，其余大鼠為試驗(yàn)組(腹腔注射6 mg/kg體重強(qiáng)痛寧溶液)。

1.3 樣品采集和處理 對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水后3 min斷頭取腦，試驗(yàn)組大鼠腹腔注射強(qiáng)痛寧后分別于誘導(dǎo)期(注藥后5 min即可)、麻醉期(翻正反射消失即可)、催醒期(翻正反射恢復(fù)即可)斷頭取腦，在生理鹽水冰面上迅速分離大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干，分別稱(chēng)重，裝入凍存管后投入液氮中保存。分別將腦組織取出置入冰冷的蔗糖緩沖液(0.32 mol/L，1/10，W/V)介質(zhì)中勻漿，2 500 r/min離心10 min制備成10%腦組織勻漿液，待測(cè)。

1.4 檢測(cè)方法 采用比色法測(cè)定NOS酶活性和NO產(chǎn)量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定cGMP濃度，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。檢測(cè)具體方法參照各檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 強(qiáng)痛寧對(duì)大鼠中樞腦區(qū)NOS活性的影響結(jié)果如圖1所示，強(qiáng)痛寧給藥后抑制了大鼠中樞腦區(qū)NOS活性，麻醉全程大鼠大腦、小腦、腦干、海馬及丘腦腦區(qū)NOS活性與對(duì)照組比較降低顯著(P<0.01或P<0.05)；催醒期僅丘腦NOS活性恢復(fù)到麻前水平(P>0.05)。

圖1 強(qiáng)痛寧作用下大鼠中樞腦區(qū)NOS活性變化

2.2 強(qiáng)痛寧對(duì)大鼠中樞腦區(qū)NO含量的影響由圖2可見(jiàn)，強(qiáng)痛寧作用下引起大鼠中樞腦區(qū)NO產(chǎn)量減少，麻醉全程大鼠小腦、腦干、海馬及丘腦腦區(qū)NO含量與對(duì)照組比較降低顯著(P<0.01 或P<0.05)；催醒期小腦NO 含量仍低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 強(qiáng)痛寧作用下大鼠中樞腦區(qū)NO含量變化

2.3 強(qiáng)痛寧對(duì)大鼠中樞腦區(qū)cGMP濃度的影響 按照cGMP 試劑盒操作步驟繪制吸光值與cGMP濃度的直線(xiàn)回歸方程為y=0.341 7+0.059 4x(R2=0.990 2)，相關(guān)系數(shù)較高，線(xiàn)性回歸良好。cGMP濃度變化見(jiàn)圖3，強(qiáng)痛寧引起大鼠麻醉期中樞各腦區(qū)內(nèi)cGMP濃度降低，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)；崔醒期大鼠大腦、海馬、丘腦和腦干cGMP濃度恢復(fù)到麻前水平(P>0.05)。

圖3 強(qiáng)痛寧作用下大鼠中樞腦區(qū)cGMP濃度變化

3 討論

NO與cGMP構(gòu)成NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NO參與機(jī)體生理機(jī)能的調(diào)節(jié)，在維持清醒狀態(tài)和促進(jìn)cGMP合成起著重要作用[11]。中樞神經(jīng)通路的興奮性和抑制性與NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)通過(guò)調(diào)節(jié)中樞NO/cGMP通路使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cGMP含量升高引起興奮性，cGMP含量下降引起中樞抑制[12]。

過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)麻醉藥產(chǎn)生麻醉鎮(zhèn)痛作用均與NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制相關(guān)。王洪斌等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噻環(huán)乙胺麻醉下大鼠大腦皮層、海馬和丘腦NOS活性被抑制，導(dǎo)致NO和cGMP含量下降，提示噻環(huán)乙胺麻醉與NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制相關(guān)[7]；劉煥奇等研究表明，NO-NOS-cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了賽拉唑產(chǎn)生全麻作用[13]；胡興國(guó)等研究表明，異丙酚抑制大鼠小腦、海馬和大腦皮層NOS活性，減少腦區(qū)NO產(chǎn)量和cGMP含量，提示NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在異丙酚全麻分子機(jī)理中發(fā)揮重要作用[14]。本研究結(jié)果表明，腹腔注射強(qiáng)痛寧6 mg/kg體重后，引起麻醉期中樞腦區(qū)NOS 活性顯著降低，NO產(chǎn)量和cGMP含量降低，提示NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了強(qiáng)痛寧全麻分子機(jī)理調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，強(qiáng)痛寧抑制大鼠中樞腦區(qū)NOS活性，降低NO產(chǎn)量和cGMP含量，阻斷NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是其產(chǎn)生全麻作用的重要機(jī)理之一。

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Effects of the QIANG TONG NING on NO/cGMP Signal Pathway in in the Central Brain Regions of Rats

YIN Bai-shuang1， SONG Yong-li1， HU Xian-sheng1，SHA Wan-li1， SHI Xing-xing2， GAO Li2， FU Lian-jun1

(1.Department of Animal Medicine，JiLin Agricultural Science and technology，Jilin 132101，China；2.College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The experiment was conducted to investigate the possible molecular mechanisms of QIANG TONG NING(QTN)anesthesia on the central nervous system by analyzing the NOS activity，NO and cGMP contents in central brain regions in rats.Twenty-four SD rats were divided randomly into control group，induction group，anesthesia group,and recovery from anesthesia group.Rat brain samples of cerebral cortex，hippocampus，cerebellum，thalamus and brain stem were separated in different period under specificity anesthetic for deer anesthesia.The activity of NOS and concentration of NO were measured using colorimetry，and cGMP was determined by Elisa.The results showed that the NOS activity was significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)，the NO contents were significantly decreased(P<0.01)，and the concentration of cGMP were also obviously decreased(P<0.05 orP<0.01)in all encephalic regions in the anesthesia group as compared with control group.These results indicated that the QTN inhibited NOS activity，and blocked NO/cGMP signal conduction suggesting that effects on NO/cGMP signal transduction may be the important mechanism of general anesthesia.

QIANG TONG NING ； NOS ； NO/cGMP ； signal pathway

FU Lian-jun

2015-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302150)；吉林省科技廳發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20140204062NY)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(吉教科合字2014379)；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字2013905)

尹柏雙(1978-)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槁樽砼c鎮(zhèn)痛研究，E-mail：ybs3421@126.com

付連軍，E-mail：fulianjun1968@163.com

S853.74

A

0529-6005(2016)10-0099-03