陳 蕊 ， 師銘咸 ， 郭 岑 ， 曹馨方 ， 張 宇，周 彤 ， 李欣然 ， 于東旭 ， 魏成威 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室 ， 黑龍江哈爾濱150030)

?

氯胺酮與咪達(dá)唑侖對巴馬豬腦組織cAMP信號通路的影響

陳 蕊 ， 師銘咸 ， 郭 岑 ， 曹馨方 ， 張 宇，周 彤 ， 李欣然 ， 于東旭 ， 魏成威 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室 ， 黑龍江哈爾濱150030)

為探討氯胺酮與咪達(dá)唑侖對巴馬豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)cAMP信號通路的影響及影響情況，研究其中樞作用機(jī)制，試驗(yàn)將35頭健康巴馬豬隨機(jī)分為對照組、麻醉誘導(dǎo)期、麻醉期和蘇醒期四組，在每一期處死取腦組織，用ELISA法分別測定大腦皮質(zhì)、小腦、丘腦、海馬和腦干內(nèi)cAMP含量。結(jié)果：氯胺酮和咪達(dá)唑侖分別能夠一定程度的降低大腦皮質(zhì)和小腦中cAMP含量。表明：氯胺酮、咪達(dá)唑侖的作用可能通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)cAMP信號通路產(chǎn)生作用，為今后進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

氯胺酮 ； 咪達(dá)唑侖 ； 巴馬豬 ； 腦區(qū) ； cAMP信號通路

AC/cAMP/PKA信號通路是神經(jīng)系統(tǒng)興奮過程中的一條重要通路。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其含量變化受腺苷酸環(huán)化酶(AC)和磷酸二酯酶(PDE)活力的雙重調(diào)節(jié)[1]，所以cAMP 在AC/cAMP/PKA信號通路中具有重要地位。

氯胺酮、咪達(dá)唑侖是動物臨床常用麻醉藥物，研究其麻醉中樞機(jī)制是指導(dǎo)臨床用藥的關(guān)鍵，但它對中樞cAMP 信號通路的影響目前報道較少，且不同藥物對機(jī)體cAMP通路影響的報道存在巨大差異，所以，本試驗(yàn)擬研究氯胺酮與咪達(dá)唑侖對各腦區(qū)cAMP信號通路的影響，探討其中樞作用機(jī)制，為今后該麻醉藥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法 鹽酸氯胺酮注射液：西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：H20054748；咪達(dá)唑侖注射液：宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：H20067040；Tris-Hcl 試劑、蔗糖和乙二胺四乙酸(EDTA)，分析純，購自上海北諾生物科技有限公司；豬cAMP測定試劑盒：中國卡爾文生物科技有限公司，批號：20120302A。

1.2 試驗(yàn)動物 臨床健康的廣西巴馬小型豬35頭，7～8月齡，雌雄兼有，體重32.2±4.3 kg，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)外科教研室從三元豬場購入。

1.3 試驗(yàn)動物分組 隨機(jī)取5頭為生理鹽水對照組，其余為試驗(yàn)組。生理鹽水對照組內(nèi)肌肉注射生理鹽水(10 mL)，試驗(yàn)組分為氯胺酮組和咪達(dá)唑侖組，每組15頭。分別肌肉注射等體積的生理鹽水及氯胺酮(0.07 mL/kg 體重)、咪達(dá)唑侖(0.2 mL/kg)。試驗(yàn)動物分別在麻醉誘導(dǎo)期(T1 時期=15 min)、麻醉期(T2時期=45 min)和蘇醒期(T3時期=75 min)各時期宰殺5頭，采集樣本。

時間點(diǎn)選?。簩φ战M和試驗(yàn)組巴馬豬的一般臨床指標(biāo)(T、RR和HP)和循環(huán)系統(tǒng)指標(biāo)(DBP、MAP、SpO2、SBP 和ECG)收集和比較，以及對麻醉組中巴馬豬麻醉后一系列生物反射活動和巴馬豬行為學(xué)變化出現(xiàn)的時間進(jìn)行記錄，并結(jié)合試驗(yàn)動物麻醉后行為學(xué)變化分組標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，得出小型豬給藥后平穩(wěn)的進(jìn)入麻醉(T1時期)的時間為23.5±6.5 min，進(jìn)入深度麻醉(T2時期)的時間為63.3±6.4 min，蘇醒期(T3時期)的時間為72.1±4.3 min。所以我們選定T1時期(麻醉誘導(dǎo)期)中的15 min、T2時期(麻醉期)中的45 min和T3時期(蘇醒期)中的75 min三個時間點(diǎn)，對氯胺酮和咪達(dá)唑侖的中樞作用機(jī)制開展研究。

1.4 腦組織樣品測定各組巴馬豬處死后，用電動石膏鋸沿巴馬豬額骨中縫，自鼻骨至枕髁之間鋸開后，使用拉鉤牽拉兩側(cè)鼻骨斷端，致使顱腔開放，隨即取出全部腦組織，用滅菌后的4 ℃生理鹽水沖洗腦組織上殘留的血跡，并在生理鹽水冰板上迅速分離出大腦皮質(zhì)、小腦、丘腦、海馬和腦干后，稱重，將預(yù)冷的0.32 mol/L的蔗糖緩沖溶液(含0.32 mol/L蔗糖、1 mmol/L Na2HPO4、1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.4)按1∶10(W/V)加入到勻漿器中，將組織放入勻漿器中，隨后在冰水浴條件下進(jìn)行充分的研磨。將所得勻漿液移至離心管中，在4 ℃條件下，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定標(biāo)本中cAMP含量。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮對巴馬豬不同腦區(qū)cAMP含量的影響

如表1所示，在氯胺酮麻醉過程中，小腦中cAMP含量性在麻醉誘導(dǎo)期時較對照組顯著降低；在麻醉期，與對照組相比，cAMP含量在大腦皮質(zhì)、海馬和丘腦中均有不同程度的升高，其中丘腦和海馬升高顯著，腦干和小腦中cAMP含量則呈相反的趨勢變化，其中小腦的cAMP含量顯著降低；在蘇醒期，小腦中的cAMP含量仍較對照組顯著降低，而其他各個腦區(qū)中cAMP含量均恢復(fù)到正常水平。在氯胺酮麻醉過程中，大腦皮質(zhì)和腦干中cAMP含量未呈明顯的變化趨勢。

表1 氯胺酮麻醉對巴馬豬不同腦區(qū)cAMP含量的影響 (U：pmol/mL，n=5)

a**：與對照組比較P<0.01，差異極顯著；*：與對照組比較P<0.05，差異顯著；b：與麻醉期組比較P<0.05，差異顯著，下表同

2.2 咪達(dá)唑侖對巴馬豬不同腦區(qū)cAMP含量的影響 如表2所示，在咪達(dá)唑侖麻醉過程中，麻醉誘導(dǎo)期的巴馬豬各個腦區(qū)中cAMP含量均呈升高趨勢，其中海馬較對照組升高顯著；在深麻醉期中，海馬中cAMP含量較對照組仍升高顯著；在蘇醒期中，與對照組相比大腦皮質(zhì)和小腦中cAMP含量呈顯著降低，而其他各腦區(qū)cAMP含量均恢復(fù)至正常水平，在咪達(dá)唑侖麻醉過程中，腦干中cAMP含量未呈明顯的變化趨勢。

3 討論

當(dāng)觸發(fā)機(jī)體的某些神經(jīng)細(xì)胞后，發(fā)生興奮性，促使神經(jīng)末梢突觸前部釋放神經(jīng)遞質(zhì)，作用于突觸后部的受體，通過AC/cAMP/PKA信號通路的一系列信號傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，影響神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。在AC/cAMP/PKA信號通路中，作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使的cAMP可介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)激素、神經(jīng)遞質(zhì)及其他信號分子[2]，也可以影響相應(yīng)蛋白激酶產(chǎn)生系列雙向調(diào)節(jié)作用[3]。cAMP對細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用主要是通過激活cAMP依賴性蛋白激酶A(cAMP dependentprotein kinase，PKA)來實(shí)現(xiàn)的，cAMP還可以通過PKA磷酸化下游的CREB發(fā)揮作用[4]，與此同時，生成的cAMP可被PDE快速水解并生成5、-AMP，致使cAMP失去生理活性[5]。PKA是依賴于cAMP的絲/蘇氨酸蛋白激酶，全酶由兩個催化亞基C和兩個調(diào)節(jié)亞基R組成。調(diào)節(jié)亞基上有cAMP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)兩個調(diào)節(jié)亞基與cAMP結(jié)合后，催化亞基呈游離狀態(tài)而具有活性[6]。

表2 咪達(dá)唑侖麻醉對巴馬豬不同腦區(qū)cAMP含量的影響 (U：pmol/mL，n=5)

氯胺酮(Ketamine)作為一種自1970 年開始在臨床上應(yīng)用的靜脈麻醉藥，是苯環(huán)己哌啶(Phencyclidine，PCP)衍生物，它能選擇性地阻斷痛覺沖動向丘腦新皮層系統(tǒng)的傳導(dǎo)，興奮腦干及邊緣系統(tǒng)，引起意識模糊、短暫性記憶缺失，但意識并未完全消失，常有夢幻、肌張力增加、血壓升高等，此狀態(tài)又稱為分離麻醉[7]。咪達(dá)唑侖(Midazolam)為水溶性苯二氮卓類藥，具有抗焦慮、催眠、抗驚厥、肌肉松弛和順行性遺忘作用，以及消除半衰期短、起效快、無明顯蓄積作用及治療指數(shù)高等特點(diǎn)，是理想的靜脈麻醉藥[8]。研究表明，多數(shù)全麻藥能明顯改變大腦皮層和小腦等腦區(qū)cAMP的含量。張志龍等研究表明，氯胺酮能夠明顯的增加大鼠不同腦區(qū)的cAMP 的含量[9]，丁海雷等研究表明，依托咪酯能夠使大鼠各腦區(qū)cAMP含量升高[10]，許多靜脈麻醉藥的作用機(jī)制可能涉及cAMP信號通路，其環(huán)節(jié)可能與GABA及其復(fù)合體含量、AC等多方面調(diào)節(jié)相關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氯胺酮對小腦內(nèi)cAMP含量有顯著抑制作用，而丘腦和海馬內(nèi)cAMP含量呈顯著升高的趨勢；咪達(dá)唑侖可使海馬和丘腦內(nèi)cAMP含量升高。這一結(jié)果表明，巴馬豬不同腦區(qū)的cAMP信號傳導(dǎo)系統(tǒng)可能參與了氯胺酮等麻醉藥麻醉分子機(jī)理的調(diào)控。至于氯胺酮使小腦內(nèi)cAMP含量降低，可能是由于藥物劑量不同以及動物種屬不同所致，這需作出進(jìn)一步研究來給予解答。

氯胺酮等麻醉藥對巴馬豬大腦、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)cAMP含量有明顯的影響作用，表明cAMP信號傳導(dǎo)系統(tǒng)是氯胺酮等麻醉藥產(chǎn)生全身麻醉作用的重要機(jī)制之一。

[1] 楊國平，王洪軍，張銳，等.冷應(yīng)激對大鼠腦組織cAMP和cGMP水平及AC和PDE生物活力的影響[J].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2009，02：77-80.

[2] 韓羽楠，王振宇.鋅與cAMP/PKA-CREB-BDNF信號通路在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)性[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2013，02：167-170.

[3] Abe K，Hosoi R，Momosaki S，et al.Increment of in vivo binging of [3H]SCH-23390，a dopamine D1receptor ligand，induced by cyclic AMP-dependent protein kinase in rat brain[J].Brain Res，2002，952(2)：211-217.

[4] Kirschner L S，Yin Z，Jones G N，et al.Mouse models of altered protein kinaseA signaling[J].Endocr Relat Cancer，2009，16(3)：773-93.

[5] 何亞軍.氯胺酮對腦電雙頻指數(shù)、環(huán)磷酸腺苷及應(yīng)急指標(biāo)的影響[D].昆明：昆明醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文，2003．

[6] Pidoux G，Tasken K.Specificity and spatial dynamics of protein kinaseA signaling organized by A-kinase-anchoring proteins[J].J Mol Endocrinol，2010，44(5)：271-84.

[7] 劉偉麗，卞士中，顧振綸，等.氯胺酮成癮機(jī)制的研究進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，03：200-203+207.

[8] 徐波，張興安.咪達(dá)唑侖臨床藥動學(xué)參數(shù)的研究[J].中國藥房，2009，02：106-108.

[9] 張志龍，曹因明，王鈞，等.氯胺酮對大鼠腦內(nèi)cAMP信使系統(tǒng)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2001，06：379.

[10] 丁海雷，曾因明，段世明，等.依托咪酯對大鼠皮質(zhì)、海馬cAMP含量的影響[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，01：1-3.

Effects of Ketamine and Midazolam on cAMP signaling pathway in brain tissue in miniature pigs

CHEN Rui ， SHI Ming-xian ， GUO Cen ， CAO Xin-fang ， ZHANG Yu，ZHOU Tong ， LI Xin-ran ， YU Dong-xu ， WEI Cheng-wei ， GAO Li

(Institute of Animal Medicine Surgery Teaching and Research Section，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To explore the effect of ketamine and midazolam on the central nervous system cAMP signaling pathway，35 healthy experimental Bama pigs were randomly divided into four groups：control group，anesthesia inducement period，stage of narcosis and revive period.In each period,the pigs were euthanized for brain samples，cAMP levels in cerebral cortex，cerebellum，thalamus，hippocampus and brainstem were measured by ELISA.Our results showed that ketamine and midazolam were able to reduce cAMP content to a certain level in cerebral cortex and cerebellum independently.Our data indicate that ketamine and midazolam might act on central nervous system cAMP signaling pathway.

Ketamine ； Midazolam ； Bama pigs ； Brain regions ； cAMP signaling pathways

GAO Li

2015-11-12

國家自然科學(xué)基金(31372491，31572580)

陳蕊(1990-)，女，碩士，從事臨床獸醫(yī)工作，E-mail：563928610@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S859.7

A

0529-6005(2016)10-0093-03