馬 芹 ， 宋甲寶 ， 王方正 ， 孫月萍 ， 劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東青島266109)

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鴨源致病菌的分離鑒定及耐藥性分析

馬 芹 ， 宋甲寶 ， 王方正 ， 孫月萍 ， 劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東青島266109)

從臨床發(fā)病鴨中分離到的57株細(xì)菌進(jìn)行了鑒定和藥敏檢測(cè)。通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)和生化試驗(yàn)鑒定出11株大腸桿菌；通過(guò)16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序確診了13株沙門菌和33株鴨疫里默菌。紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)20種抗菌藥物有不同程度的耐藥性。利用PCR方法檢測(cè)了喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類等耐藥基因在分離株的分布情況，結(jié)果顯示，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)的菌株的耐藥表型與耐藥基因并非完全一致，耐藥菌株中有60%以上的菌株能檢測(cè)到相應(yīng)的耐藥基因。

大腸桿菌 ； 沙門菌 ； 鴨疫里默菌 ； 耐藥性檢測(cè)

目前在肉鴨養(yǎng)殖中，大腸桿菌、沙門菌和鴨疫里默菌是臨床最常見(jiàn)的細(xì)菌性感染，并往往表現(xiàn)為混合感染，發(fā)病率和死亡率極高，臨床上細(xì)菌的耐藥情況日益嚴(yán)重。3種致病菌感染的某些癥狀相似，單純通過(guò)臨床觀察很難鑒別開(kāi)來(lái)。因此，分離致病菌并通過(guò)實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行鑒定，對(duì)了解鴨源細(xì)菌性感染情況具有重要意義。通過(guò)檢測(cè)分離菌株的耐藥性和耐藥基因的存在可對(duì)指導(dǎo)臨床用藥提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌單因子陽(yáng)性血清(O1、O2、O3、O6、O8、O15、O17、O18、O22、O28、O36、O107)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；引物由華大基因科技服務(wù)有限公司合成；其他試劑由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 從山東臨沂、濰坊等地區(qū)送檢的病鴨分別取其腦、肝、心等組織進(jìn)行細(xì)菌分離，分別接種麥康凱培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基和含2%小牛血清的TSA培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。其中在麥康凱培養(yǎng)基上形成中等大小、表面光滑濕潤(rùn)的紅色菌落者判定為疑似大腸桿菌；在S.S.培養(yǎng)基上形成表面光滑的黑色菌落判定為疑似沙門菌；在麥康凱和S.S.培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，但在TSA培養(yǎng)基上會(huì)形成生長(zhǎng)良好的無(wú)色透明菌落者判定為疑似鴨疫里默菌。

1.2.2 形態(tài)觀察及生化試驗(yàn) 挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。并進(jìn)行以下生化反應(yīng)：糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)和尿素酶試驗(yàn)，具體操作參照文獻(xiàn)[1]。

1.2.3 沙門菌和鴨疫里默菌的PCR鑒定 通過(guò)16S rRNA 基因的PCR擴(kuò)增鑒定分離的疑似沙門菌菌株；通過(guò)外膜蛋白序列擴(kuò)增鑒定疑似鴨疫里默菌[2]。將擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。1.2.4 血清型鑒定 利用單因子陽(yáng)性血清進(jìn)行玻片凝集，鑒定大腸桿菌和鴨疫里默菌菌株的血清型[3]。

1.2.5 紙片法藥敏試驗(yàn) 利用慶大霉素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考等20種抗菌藥物對(duì)57株分離菌進(jìn)行K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[4]。

1.2.6 耐藥基因的檢測(cè) 為了檢測(cè)紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果與相應(yīng)耐藥基因的相關(guān)性及多重耐藥的存在情況，首先根據(jù)紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果，在耐β-內(nèi)酰胺類藥物的分離菌株中隨機(jī)抽取5株沙門菌、4株大腸桿菌和16株鴨疫里默菌進(jìn)行相關(guān)耐藥基因檢測(cè)。采用煮沸法制備細(xì)菌DNA模板[5]，參照相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]分別合成了針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶基因、抗喹諾酮類藥物的DNA螺旋酶基因、抗氨基糖苷類藥物的鈍化酶基因、氟苯尼考耐藥基因的11對(duì)引物進(jìn)行耐藥基因的PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 通過(guò)觀察細(xì)菌在不同平板上的培養(yǎng)特性、形態(tài)特點(diǎn)和生化反應(yīng)特征，初步確定其中11株為大腸桿菌，13株為沙門菌。

2.2 沙門菌的16S rRNA基因擴(kuò)增和鑒定結(jié)果 沙門菌菌株的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)測(cè)序及序列比對(duì)，其中11株鑒定為腸炎沙門菌，另外2株鑒定為雞白痢沙門菌。

圖1 16S rRNA 基因片段擴(kuò)增

M：DL-2 000 DNA分子量；1～4分別為4株臨床

沙門菌分離株的16S rRNA基因片段擴(kuò)增結(jié)果

2.3 鴨疫里默菌的外膜蛋白基因片段的擴(kuò)增 部分疑似鴨疫里默菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。33株鴨疫里默菌臨床分離株均獲得預(yù)期660 bp大小的條帶，通過(guò)測(cè)序比對(duì)，確定為鴨疫里默菌。

2.4 血清型鑒定 通過(guò)玻片凝集試驗(yàn)對(duì)分離的11株大腸桿菌和33株鴨疫里默菌進(jìn)行了血清型鑒定，結(jié)果表明，8株大腸桿菌分屬O6(2株)，O36(2株)，O78(2株)，O17(1株)，O18(1株)5個(gè)血清型，有3株未定型；33株鴨疫里默菌臨床分離株中鑒定為血清1型的有11株，血清2型的有5株，其他菌株未定型。

圖2 外膜蛋白基因片段擴(kuò)增圖譜

M：DL-2 000 DNA分子量；1～3分別是3株RA

臨床分離株的外膜蛋白基因片段擴(kuò)增結(jié)果

2.5 紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果 參照CLSI藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，57株細(xì)菌對(duì)20種抗生素的耐藥情況見(jiàn)表1。

表1 57株細(xì)菌的紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，57株分離菌對(duì)20種抗生素均有不同程度的耐藥性，其中大腸桿菌和沙門菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類藥物的耐藥率達(dá)到了100%，鴨疫里默菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥率 超 過(guò)了 50%，大多數(shù)分離菌株表現(xiàn)為多重耐藥。2.6 耐藥基因的檢測(cè) 在耐藥基因檢測(cè)過(guò)程中，擴(kuò)增到了與 OXA、IMP、SHV、TEM、CTX-M、aac(3)-II、ant(3″)-I、gyrA、floR基因預(yù)期大小一致的目的條帶，并通過(guò)測(cè)序確定了耐藥基因的正確性。而aac(3)-I、aph(3′)-IV基因引物未能擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的條帶。將藥敏結(jié)果和耐藥基因檢測(cè)結(jié)果比較分析見(jiàn)表2。

由表2可知，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)的菌株的耐藥表型與相應(yīng)耐藥基因并非完全吻合，但絕大多數(shù)耐藥菌株中能檢測(cè)到含有相應(yīng)的耐藥基因。未檢測(cè)到耐藥基因的菌株很可能具有其他的耐藥機(jī)制。

表2 耐藥菌株數(shù)與含耐藥基因的菌株數(shù)的比較

3 討論

3.1 細(xì)菌的血清型 通過(guò)玻片凝集試驗(yàn)對(duì)分離到的大腸桿菌和鴨疫里默菌進(jìn)行了血清型的鑒定。僅從檢測(cè)情況來(lái)看，8株定型大腸桿菌菌株分別屬于5個(gè)不同的血清型，說(shuō)明鴨源大腸桿菌血清型分布的廣泛性；而從鴨疫里默菌分離株已鑒定血清型來(lái)看，1型所占比例達(dá)到33%以上，仍為流行的優(yōu)勢(shì)血清型。由于實(shí)驗(yàn)室保存的單因子陽(yáng)性血清種類不全，未能鑒定出所有大腸桿菌和鴨疫里默菌分離株的血清型。

3.2 耐藥性檢測(cè) 在紙片法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果中，57株細(xì)菌對(duì)20種抗菌藥物的耐藥性不同，臨床耐藥表現(xiàn)與耐藥基因的相關(guān)性與其他報(bào)道的結(jié)果也存在差異[8-9]，這可能因?yàn)椴煌貐^(qū)耐藥基因的流行和分布情況不同，使得耐藥性與耐藥基因兩者之間的相關(guān)性不完全相同。在耐藥基因的檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有極個(gè)別無(wú)耐藥表型的菌株也能檢測(cè)出耐藥基因，如試驗(yàn)中2株表現(xiàn)為耐β-內(nèi)酰胺但不耐氨基糖苷類藥物的菌株檢測(cè)到了抗氨基糖苷類基因，這可能是因?yàn)樵撃退幓蛞蚴苣承┮蛩氐挠绊懚蔀槌聊颍瑳](méi)有表達(dá)應(yīng)有的表型。另外，一部分菌株盡管表現(xiàn)出了耐藥性，但是沒(méi)有檢測(cè)出相應(yīng)的耐藥基因，由于本試驗(yàn)只對(duì)部分耐藥基因進(jìn)行了初步鑒定，不排除菌株含有其他耐藥基因或存在其他耐藥機(jī)制的情況。

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2015-08-19

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技計(jì)劃項(xiàng)目-山東省鴨傳染性漿膜炎流行病調(diào)查及病原耐藥性檢測(cè)(201410435010)

馬芹(1990-)，女，本科生，就讀于動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)，E-mail：542446515@qq.com

劉文華，E-mail：wenhualiu2668@126.com

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0529-6005(2016)10-0080-03