岳 筠 ， 程振濤 ， 歐德淵 ， 徐春志 ， 袁翠霞 ， 張 華

(1.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州貴陽550008 ； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽550025 ； 3.貴陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州貴陽550081)

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PCR檢測技術(shù)在奶牛結(jié)核病鮮乳樣本監(jiān)測中的應(yīng)用

岳 筠1， 程振濤2， 歐德淵2， 徐春志3， 袁翠霞3， 張 華1

(1.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州貴陽550008 ； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽550025 ； 3.貴陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州貴陽550081)

奶牛結(jié)核病是一種嚴(yán)重的人獸共患傳染病，為建立可快速評(píng)估鮮乳污染狀況、追溯傳播途徑的試驗(yàn)方法，本試驗(yàn)根據(jù)牛分枝桿菌基因組合成特異性引物，建立普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并評(píng)價(jià)該方法的性能。結(jié)果可見，本試驗(yàn)所建立的普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能有效檢測牛分枝桿菌目的基因，且均具有較好的敏感性、特異性，可對(duì)鮮乳樣本進(jìn)行檢測，且實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比普通PCR方法更敏感。試驗(yàn)結(jié)果表明，所建PCR方法可用于鮮乳樣本牛分枝桿菌的定性和定量檢測，這為鮮乳牛分枝桿菌污染狀況和食品安全評(píng)估提供重要技術(shù)。

鮮乳 ； 牛分枝桿菌 ； PCR ； 建立 ； 應(yīng)用

奶牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的人獸共患慢性傳染病，嚴(yán)重威脅人類身體健康及公共衛(wèi)生安全。研究資料顯示，患病奶牛是結(jié)核病的重要傳染源，可隨鼻汁、糞便和乳汁污染飼料、飲水、鮮乳等，使其呈現(xiàn)畜群間和人畜間傳播。一些研究認(rèn)為肺結(jié)核病人中約15%的結(jié)核病人是飲用了結(jié)核病牛的奶而發(fā)病[1]。奶牛結(jié)核病傳統(tǒng)檢測方法有細(xì)菌分離鑒定、免疫學(xué)檢驗(yàn)等方法，隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疫病診斷、動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全等領(lǐng)域[3-4]，其可用于鼻液、乳樣、血液等樣本的檢測。我國《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18645-2002)規(guī)定，乳液可以作為檢測樣本用于牛結(jié)核病診斷，與其他診斷檢測樣本比較，鮮乳樣品具有易采集、對(duì)動(dòng)物無傷害等優(yōu)點(diǎn)，提高了監(jiān)測樣本采集效率。為貴州省奶牛結(jié)核病流行狀況與鮮奶結(jié)核桿菌污染狀況評(píng)估儲(chǔ)備技術(shù)，本試驗(yàn)基于牛分枝桿菌基因組合成特異性引物，構(gòu)建普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，評(píng)估兩種方法對(duì)鮮乳樣本檢測效果的優(yōu)劣與可應(yīng)用性，為牛結(jié)核病檢疫與鮮奶食品安全評(píng)估提供關(guān)鍵技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 參考菌株 牛分枝桿菌參考菌株(GIMI-267)，購自上海研生生化有限公司。大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、枯草桿菌等菌株均為貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；副結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核桿菌由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所提供。

1.2 主要試劑 改良羅氏培養(yǎng)基，購自上海研生生化有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTMⅠ(Perfect Real Time)試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。 其他試劑為國產(chǎn)分析純。1.3 引物合成 參考GenBank數(shù)據(jù)庫牛分枝桿菌基因序列(CP009449.1)，基于插入序列IS6110基因合成1對(duì)牛分枝桿菌特異性引物(TB-P-F：5′-GGATCCTGCGAGCGTAGGCG-3′，TB-P-R：5′-CATCAGCCGCGTCCACGC-3′)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為323 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 牛分枝桿菌核酸提取 配制改良羅氏培養(yǎng)基，取菌液以劃線方式接種于培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d，待觀察到培養(yǎng)基逐漸由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)色，將1 000 μL滅菌雙蒸水加于固體培養(yǎng)基表面，洗脫菌落，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR方法體系建立 構(gòu)建普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，普通PCR 50μL反應(yīng)體系包括：2×TaqPCR MasterMix為25 μL，TB-P-F和TB-P-R(10 μm/L)分別為2 μL，DNA模板為2 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足50 μL體系；反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，50 μL反應(yīng)體系包括：SYBRGreen I 25 μL，引物、模板DNA同普通PCR方法，滅菌去離子水補(bǔ)足50 μL體系；反應(yīng)條件：同普通PCR方法，40個(gè)循環(huán)。以上述反應(yīng)體系和條件于PCR儀進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。

1.6 PCR方法性能評(píng)價(jià)

1.6.1 敏感性的測定 將牛分枝桿菌DNA樣本按10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行普通PCR和FQ-PCR擴(kuò)增，計(jì)算兩種方法的最小DNA檢測濃度。

1.6.2 特異性試驗(yàn) 提取奶牛場常見細(xì)菌大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、枯草桿菌、副結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核桿菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以牛分枝桿菌為陽性對(duì)照，檢測兩種方法的特異性。

1.7 臨床應(yīng)用性比較 對(duì)26份臨床疑似陽性鮮乳樣本應(yīng)用普通PCR和FQ-PCR分別進(jìn)行檢測，比較兩種方法的臨床應(yīng)用性。

2 結(jié)果

2.1 PCR方法建立 取兩份牛分枝桿菌DNA樣本，應(yīng)用引物TB-P-F/TB-P-R分別進(jìn)行普通PCR和熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1、2。

圖1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

M：DL-2 000 Marker；1～2：待檢樣本；3：陰性對(duì)照

圖2 熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

M：DL-2 000 Marker；1～5：牛結(jié)核分枝桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、枯草桿菌、葡萄球菌DNA待檢樣本；-：陰性對(duì)照

由圖1、2可見，所構(gòu)建的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件能有效擴(kuò)增牛分枝桿菌參考株DNA樣本目的基因，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，且熒光定量PCR方法Ct值均小于30，而陰性對(duì)照Ct值均大于30，因此，設(shè)定陽性樣本判定標(biāo)準(zhǔn)為Ct值≤30。

2.2 兩種PCR方法性能比較

2.2.1 敏感性檢測結(jié)果 將已知DNA樣本(OD260=0.042，DNA濃度為0.021 μg/μL)進(jìn)行10倍倍比稀釋，不同濃度樣品分別進(jìn)行普通PCR和FQ-PCR擴(kuò)增，結(jié)果可見，所建立的牛分枝桿菌普通PCR方法可檢測到103倍稀釋度，即最小DNA檢測濃度為8.4pg/μL；所建實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可檢測到105倍稀釋度，即最小檢出濃度為8.4×10-2pg/μL。2.2.2 特異性檢測結(jié)果 以大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、枯草桿菌、副結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核桿菌為對(duì)比菌株，以牛分枝桿菌作為陽性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增見圖3、4。普通PCR結(jié)果可見，除牛分枝桿菌DNA樣本外，其他DNA樣本均未擴(kuò)增出任何條帶；熒光定量PCR 結(jié)果可見，牛分枝桿菌DNA樣本擴(kuò)增曲線Ct值小于30，其他參考菌株DNA樣本擴(kuò)增曲線Ct值均大于30，因此所建立的普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法均具有較好的特異性。

2.3 兩種方法應(yīng)用性比較結(jié)果 通過對(duì)26份臨床疑似結(jié)核病奶牛鮮乳樣本進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果見圖5-7。由圖5和圖6可見，在26個(gè)所檢測的樣品中，除了3號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、17號(hào)、20號(hào)、25號(hào)為陰性外，其他樣本均有明顯的目的基因條帶；由圖7可見，26份鮮乳樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測有23份顯陽性，3份陰性。

圖3 普通PCR 特異性檢測結(jié)果

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性檢測結(jié)果

圖5 樣品檢測結(jié)果

M：DL-2 000 Marker；1～13：待檢樣品；-：陰性對(duì)照

圖6 樣品檢測結(jié)果

M：DL-2 000 Marker；14～26：14至26號(hào)待檢樣品；-：陰性對(duì)照

圖7 鮮乳樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線

3 討論

牛結(jié)核病是一種慢性傳染性人獸共患傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必報(bào)傳染病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病，也是國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)中優(yōu)先防治的病種[4]。張高迪等[5]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)核病人中10.6%為牛分支桿菌感染，而1979、1985、1990年3次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，由牛型分枝桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病所占的比例分別為3.8%、4.2%、6.4%[4]。因此，牛群、鮮奶及其制品牛分枝桿菌感染(或污染)情況評(píng)估預(yù)警是防控人結(jié)核病的關(guān)鍵。目前，我國牛結(jié)核病的檢疫主要采用變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測陽性牛并撲殺，但這種方法無法區(qū)分其他分枝桿菌感染(如副結(jié)核分枝桿菌)，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，且無法區(qū)分患病牛和BCG免疫牛[5]。目前國際上推行γ-干擾素法提高了該病檢測的特異性、敏感性[6]，但價(jià)格高，不易于推廣。鑒于上述免疫學(xué)技術(shù)不具備評(píng)估環(huán)境污染狀況、鮮乳污染狀況的功能，且基于DNA聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的牛分枝桿菌檢測方法得到了快速發(fā)展[7-8]，本文選擇牛分枝桿菌保守基因區(qū)域合成特異性引物，構(gòu)建了可檢測牛分枝桿菌病原核酸的普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，兩種方法均具有良好的敏感性和特異性，可用鮮乳樣本的檢測。其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)較普通PCR技術(shù)敏感100倍，對(duì)26份皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性奶牛乳樣檢測亦顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(88.4%，23/26)檢出率高于普通 PCR 技術(shù)(76.9%，20/26)，這與孟茹等[9]所建方法敏感性類似。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法還可結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)鮮乳樣本、環(huán)境樣本牛分枝桿菌污染程度進(jìn)行定量評(píng)估，可用于對(duì)污染的追蹤溯源。

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2015-09-10

貴陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目[筑科合同(2012)207號(hào)]；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合NY字(2011)3061號(hào)]；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合NY字(2014)3042號(hào)]

岳筠(1981-)，女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物病原學(xué)研究，E-mail：yunyun810903@163.com

程振濤，E-mail：chengzhentao@sohu.com

S852.61

B

0529-6005(2016)10-0077-03