王 旗 ， 管 笛 ， 武會(huì)娟 ， 裴星瑤 ， 彭 濤 ， 江海洋

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市理化分析測(cè)試中心 ， 北京海淀100089 ；3.北京市基因測(cè)序與功能分析工程技術(shù)研究中心 ， 北京海淀100094)

?

快速檢測(cè)牛奶中泰樂(lè)菌素殘留的熒光微球免疫層析方法的建立

王 旗1，2，3， 管 笛2，3， 武會(huì)娟2，3， 裴星瑤1， 彭 濤1， 江海洋1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市理化分析測(cè)試中心 ， 北京海淀100089 ；3.北京市基因測(cè)序與功能分析工程技術(shù)研究中心 ， 北京海淀100094)

本研究旨在研制一種快速檢測(cè)牛奶中泰樂(lè)菌素殘留的熒光微球免疫層析試紙條。將包被抗原(0.80 mg/mL)和羊抗鼠IgG(1.01 mg/mL)噴涂在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)檢線(xiàn)。對(duì)制備熒光微球抗體免疫復(fù)合物(免疫探針)的工藝參數(shù)做了一系列的優(yōu)化，同時(shí)比較了不同標(biāo)記方法對(duì)標(biāo)記效率及穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，在pH值為6.0的最佳緩沖體系條件下，催化劑碳化二亞胺(EDC)用量為5 μg，抗體100倍稀釋添加20 μL，檢測(cè)時(shí)間低于25 min，檢測(cè)限為25 μg/L。本試驗(yàn)研制的熒光微球免疫層析試紙條具有簡(jiǎn)便快速、特異性良好、樣本無(wú)需前處理等特點(diǎn)，可用于基層奶站和現(xiàn)場(chǎng)快速篩選。

熒光微球 ； 泰樂(lè)菌素 ； 免疫層析方法 ； 試紙條

目前牛奶中泰樂(lè)菌素(tylosin，TYL)殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[1]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[2]和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[3]。這些方法雖然準(zhǔn)確可靠，但是前處理復(fù)雜且費(fèi)用昂貴，而免疫層析方法因簡(jiǎn)便快速、成本低廉得到廣泛應(yīng)用。膠體金作為主要標(biāo)記物，具有對(duì)標(biāo)記條件要求苛刻且抗體用量多的劣勢(shì)，而熒光微球具有形態(tài)穩(wěn)定、單分散性良好、發(fā)光效率高等特點(diǎn)，所以本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化抗體用量、EDC用量、緩沖體系pH值和標(biāo)記方法等工藝參數(shù)，首次成功建立了檢測(cè)牛奶中TYL的熒光微球免疫層析方法。該方法靈敏度高，特異性好，簡(jiǎn)便快速，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)牛奶中TYL殘留，為我國(guó)奶制品安全保駕護(hù)航。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光微球(0.2 μm，紅色，580/605)泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich Co.Ltd；包被抗原(TYL-BSA)、抗TYL單克隆抗體、羊抗鼠IgG(GXM)，購(gòu)自北京市維德維康生物技術(shù)有限公司；PVC塑料膠板、濾血膜、吸水紙，購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜)，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；ZX1000噴膜平臺(tái)，購(gòu)自美國(guó)BioDot公司；截條機(jī)，購(gòu)自上海杰一生物有限公司；三用紫外分析儀WFH-203，購(gòu)自上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 免疫探針的制備 標(biāo)記方法1[4]：在1.5 mL離心管中依次加入1 mL MES緩沖液(pH值6.0)，15 μL熒光微球，20 μL 100倍稀釋的抗TYL單克隆抗體，10 μL 0.3 mg/mL的EDC和羥基琥珀酰亞胺(NHS)，轉(zhuǎn)速為30 r/min的條件下反應(yīng)2 h。加入20 μL 20%BSA封閉熒光微球表面未反應(yīng)的活化位點(diǎn)。15 min后，以8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用1 mL復(fù)溶液重懸，放在4 ℃?zhèn)溆谩?.3 熒光微球試紙條的制備 將TYL-BSA(0.80 mg/mL)和GXM(1.01 mg/mL)按照0.8 μL/cm噴涂在NC膜上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和質(zhì)檢線(xiàn)(C線(xiàn))，37 ℃干燥2 h。將NC膜、吸水紙和濾血膜依次粘貼在PVC塑料膠板，重疊部分為2 mm，用裁條機(jī)切成寬度為4 mm的試紙條，放在裝有干燥劑的自封袋中備用。

1.4 檢測(cè)程序和結(jié)果判定 在微孔中加入5 μL免疫探針和150 μL樣本溶液，室溫孵育3 min。插入試紙條后層析20 min，在紫外線(xiàn)下觀察結(jié)果。若T線(xiàn)和C線(xiàn)均呈現(xiàn)紅色熒光條帶，則樣本判為陰性；若T線(xiàn)消失，C線(xiàn)呈現(xiàn)紅色熒光條帶，則樣本判為陽(yáng)性；若C線(xiàn)消失，則無(wú)效(見(jiàn)中插彩版圖1)。1.5 標(biāo)記方法的比較 按照標(biāo)記方法2(先加入熒光微球，EDC和NHS，后加入抗體)[5]和標(biāo)記方法 3(先加入抗體和熒光微球，后加入 EDC 和NHS)[6]制備免疫探針，比較偶聯(lián)效率及穩(wěn)定性。

1.6 熒光微球試紙條性能評(píng)價(jià) 檢測(cè)限：在脫脂牛奶中添加TYL標(biāo)準(zhǔn)品：0、5、10、15、20、25 μg/L，以T線(xiàn)熒光強(qiáng)度消失的最低標(biāo)準(zhǔn)品添加濃度作為檢測(cè)限。特異性：在PBST緩沖液中分別添加終濃度為200 μg/L的其他大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，在紫外線(xiàn)下觀察試驗(yàn)結(jié)果。準(zhǔn)確性：取經(jīng)儀器方法驗(yàn)證無(wú)TYL殘留的20份牛奶樣本，分別添加TYL標(biāo)準(zhǔn)品為10 μg/L和 25 μg/L，計(jì)算假陰性率和假陽(yáng)性率。每個(gè)濃度重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體用量的選擇 在一定范圍內(nèi)，隨抗體用量增加，T線(xiàn)熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)?？贵w用量超過(guò)20 μL時(shí)，T線(xiàn)熒光強(qiáng)度基本不再改變。這表明熒光微球所能偶聯(lián)的抗體用量已處于飽和狀態(tài)。繼續(xù)增加抗體用量，不僅提高成本，而且可能會(huì)因自體偶聯(lián)影響標(biāo)記效率或因非特異性吸附而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，所以抗體最佳用量為20 μL。

2.2 催化劑用量的選擇 EDC作為一種羧基催化劑，會(huì)影響熒光微球表面羧基的活化程度，所以本試驗(yàn)優(yōu)化了EDC用量。如中插彩版圖2(A)所示，EDC用量在0～125 μg范圍內(nèi)，隨EDC用量的增加，T線(xiàn)熒光強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱。此外，將免疫探針在4 ℃放置24 h，觀察其穩(wěn)定性。如中插彩版圖2(B)表明，當(dāng)EDC用量小于5 μg時(shí)，免疫探針都較穩(wěn)定，而用量為25 μg和125 μg時(shí)，免疫探針均發(fā)生不同程度的聚集，且用量越大，聚集越明顯?？赡苓^(guò)多EDC會(huì)導(dǎo)致熒光微球表面的羧基過(guò)度活化，增加了自體偶聯(lián)的幾率，降低了標(biāo)記效率和復(fù)合物的穩(wěn)定性。此外在1～5 μg范圍內(nèi)細(xì)微調(diào)試EDC用量時(shí)，結(jié)果并無(wú)顯著差異，所以EDC最佳用量為5 μg。

2.3 緩沖液pH值的選擇 調(diào)節(jié)標(biāo)記體系的酸堿度，評(píng)價(jià)pH值對(duì)熒光微球標(biāo)記效率的影響。在不同pH值緩沖體系條件下標(biāo)記的免疫探針離心后效果如中插彩版圖3(A)所示，當(dāng)pH值大于6.0時(shí)，標(biāo)記效率低且上清液混濁。沉淀復(fù)溶后，試紙條檢測(cè)結(jié)果如中插彩版圖3(B)所示，pH值為6.0時(shí)，T線(xiàn)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。這可能是此時(shí)抗體活性最強(qiáng)，易與熒光微球表面活化的羧基發(fā)生活潑酯反應(yīng)，所以緩沖液的最佳pH值為6.0。

2.4 不同標(biāo)記方法的比較 本研究比較了3種熒光微球標(biāo)記抗體的方法，結(jié)果如表1所示，3種方法透膜時(shí)間和層析效果沒(méi)有顯著差異。方法3上清液抗體含量最低且熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，但方法1穩(wěn)定性最好。本試驗(yàn)在較高標(biāo)記效率的前提下，本試驗(yàn)為保證免疫探針的穩(wěn)定性最終采用方法1。但是不同抗體和熒光微球標(biāo)記時(shí)，反應(yīng)物的加入順序也不盡相同，其反應(yīng)機(jī)理還需在后續(xù)工作深入探討，但目的都是為了獲得標(biāo)記效率更高更穩(wěn)定的免疫探針。2.5 檢測(cè)限、特異性和準(zhǔn)確性 如中插彩版圖4(A)所示，隨TYL標(biāo)準(zhǔn)品濃度增加，C線(xiàn)始終呈現(xiàn)紅色熒光條帶。TYL濃度為25 μg/L時(shí)T線(xiàn)熒光強(qiáng)度消失，即檢測(cè)限為25 μg/L。如圖4(B)所示，2-8號(hào)試紙條T線(xiàn)熒光強(qiáng)度和1號(hào)相近，表明該試紙條和其他藥物無(wú)交叉，特異性良好。在20份牛奶樣本檢測(cè)中，無(wú)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表1 不同標(biāo)記方法的參數(shù)比較

a+：熒光強(qiáng)度；t：樣本從濾血膜底端剛剛層析到達(dá)吸水紙的時(shí)間；b+：濾血膜上探針的殘留情況；c+：NC膜上的非特異性吸附情況；d+：沉淀物

3 討論

本試驗(yàn)主要探討了制備免疫探針的工藝參數(shù)，首次建立了牛奶中TYL殘留的熒光微球免疫層析方法。和相關(guān)文獻(xiàn)[5]對(duì)比，本試驗(yàn)中EDC用量明顯降低，但仍能保證良好的標(biāo)記效果，可能是化學(xué)試劑對(duì)抗體活性有一定的影響，同時(shí)也證明了催化劑低量高效的特點(diǎn)。其次文獻(xiàn)[5]中報(bào)道緩沖液pH值在5.0～7.0范圍內(nèi)，pH值為6.0時(shí)熒光強(qiáng)度幾乎最弱，與本試驗(yàn)中結(jié)果截然相反，側(cè)面說(shuō)明了不同抗體標(biāo)記時(shí)所需要的環(huán)境不同，在實(shí)際標(biāo)記中不可照搬文獻(xiàn)。

目前膠體金因簡(jiǎn)便快速、成本低廉、結(jié)果直觀等優(yōu)勢(shì)得到廣泛應(yīng)用[7]，如快速檢測(cè)A型流感[8]，但膠體金試紙條靈敏度低且對(duì)標(biāo)記環(huán)境要求苛刻。而熒光微球作為一種新型標(biāo)記物，標(biāo)記時(shí)采用共價(jià)結(jié)合代替靜電吸附[9]，提高了免疫探針?lè)€(wěn)定性和樣本耐受性，減少了假陰性率，此外克服了膠體金標(biāo)記物需大量聚集而顯色的劣勢(shì)，其發(fā)光強(qiáng)度可以隨激發(fā)光的增強(qiáng)而增強(qiáng)，所以有望提高免疫檢測(cè)技術(shù)的靈敏度[10]。然而目前應(yīng)用于食品安全檢測(cè)的熒光微球標(biāo)記產(chǎn)品在市場(chǎng)上很少見(jiàn)，限制因素主要為熒光微球本身易淬滅，標(biāo)記技術(shù)中抗體的活性及結(jié)合物的穩(wěn)定性難以維持[10]。但隨科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，這些難題必然得到解決并轉(zhuǎn)化為商品化檢測(cè)產(chǎn)品，為保障食品安全做出貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功研制了牛奶中TYL殘留的熒光微球試紙條，快速靈敏，特異性良好，穩(wěn)定可靠，牛奶樣本無(wú)需稀釋?zhuān)瑱z測(cè)限完全滿(mǎn)足國(guó)家最高殘留限量的要求，尤其適用于基層奶站和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，對(duì)保障我國(guó)奶制品安全具有重要意義。此外，對(duì)比了三種標(biāo)記方法，結(jié)果表明，將抗體、熒光微球、EDC和NHS同時(shí)加入緩沖液的標(biāo)記方法，標(biāo)記效率高且穩(wěn)定性最好，為推廣熒光微球標(biāo)記產(chǎn)品在實(shí)際中的應(yīng)用提供了較高的參考價(jià)值。

[1] 王海濤，張睿，段宏安，等.高效液相色譜法同步檢測(cè)牛奶中替米考星、泰樂(lè)菌素和螺旋霉素殘留量[J].分析試驗(yàn)室，2008，27(7)：98-101.

[2] 謝麗琪，岳振峰，唐少冰，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中林可酰胺類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留量的研究[J].分析試驗(yàn)室，2008，27(3)：5-8.

[3] Peng D，Wang S，Chen Y，etal.Development and validation of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbentassay for the screening of tylosin and tilmicosin in muscle，liver，milk，honey and eggs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60(1)：44-51.

[4] 李懷明，賴(lài)衛(wèi)華，徐恒毅，等.基于熒光硅球的克倫特羅快速定量免疫層析試紙條的研制[J].分析化學(xué)，2011，39(11)：1647-1652.

[5] Chen R，Li H，Zhang H，etal.Development of a lateral flow fluorescent microsphere immunoassay for the determination of sulfamethazine in milk[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405(21)：6783-6789.

[6] 徐飛.氨基糖苷類(lèi)藥物殘留檢測(cè)篩選和確證方法的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[7] 陸必科.膠體金免疫層析技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用及發(fā)展前景[J].飼料博覽，2014(7)：46-50.

[8] 高海崗，王子平，任曉曄，等.A型流感金標(biāo)快速檢測(cè)試紙條的研制及初步應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，31(3)：43-44.[9] 郭詩(shī)靜，唐海波，齊維.免疫熒光層析法快速檢測(cè)豬尿中克倫特羅含量[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29(5)：1154-1156.

[10] 吳剛，姜瞻梅，霍貴成，等.膠體金免疫層析技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2007，28(12)：216-218.

Fluorescent Microsphere Based Immunochromatographic Assay forRapid Detection of Tylosin Residues in Milk

WANG Qi1，2，3， GUAN Di2，3， WU Hui-juan2，3， PEI Xing-yao1， PENG Tao1， JING Hai-yang1

(1.College of Veterinary Medicine,China Agriculture University，Beijing 100193,China;2.Beijing Center for Physical &Chemical analysis，Beijing 100089,China；3.Beijing Engineering Technology Research Centre of Gene Sequencing and Gene Function Analysis，Beijing 100094,China)

The fluorescent microsphere test strip was developed for rapid detection of tylosin(TYL)residues in milk in this paper.TYL-BSA antigen(0.80 mg/mL)and goat anti-mouse IgG(1.01 mg/mL)were sprayed on the nitrocellulose membrane as the detection line and the control line respectively.The parameters in the construction of fluorescent microsphere-antibody complexes as the immune probes were optimized，so did the effect of different labeling methods on labeling efficiency and stability.The results showed that the optimal pH of buffer system was 6.0，and the amount of EDC and antibody(100-fold dilution)were 5 μg and 20 μL.The test was finished in 25 min，and the limit of detection was 25 μg/L in milk sample without pretreatment.In conclusion，the developed assay was simple，rapid，specific，and suitable for rapid screening of milk stations and sites.

fluorescent microspheres ； tylosin ； immunochromatographic assay ； strips

JIANG Hai-yang

2015-09-18

北京市優(yōu)秀人才青年骨干個(gè)人項(xiàng)目(2014400685-627G27);北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計(jì)劃(201415)

王旗(1991-)，女，碩士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail：wangqisuzimo@163.com

江海洋，E-mail：haiyang@cau.edu.cn

TS252.7

A

0529-6005(2016)10-0071-03