呼爾查 ， 哈西巴特 ， 李永暢 ， 席 耐 ， 巴音查汗

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 新疆烏魯木齊830052 ； 2.新疆巴音郭楞蒙古自治州動(dòng)物疾病控制與診斷中心 ，新疆庫爾勒841000 ； 3.新疆巴音郭楞蒙古自治州和靜縣畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆和靜841300)

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新疆和靜縣部分地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬梨形蟲病的 PCR 診斷

呼爾查1，2， 哈西巴特3， 李永暢1， 席 耐2， 巴音查汗1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 新疆烏魯木齊830052 ； 2.新疆巴音郭楞蒙古自治州動(dòng)物疾病控制與診斷中心 ，新疆庫爾勒841000 ； 3.新疆巴音郭楞蒙古自治州和靜縣畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆和靜841300)

馬梨形蟲病是寄生于馬屬動(dòng)物(馬、斑馬、驢和騾)紅細(xì)胞內(nèi)的通過蜱[2，7，11]傳播的血液原蟲病，目前已發(fā)現(xiàn)的有馬泰勒蟲[3-5]和駑巴貝斯蟲[6，9-10]兩種。被梨形蟲感染的馬屬動(dòng)物發(fā)病后出現(xiàn)發(fā)熱、皮下淋巴結(jié)腫大、貧血、黃疸等主要癥狀，降低動(dòng)物的勞動(dòng)力，偶爾會(huì)出現(xiàn)死亡病例。該病常出現(xiàn)在3月底至5月中旬，6月至8月份散發(fā)與該地區(qū)的蜱蟲活動(dòng)密切相關(guān)。在巴音郭楞蒙古自治州(簡(jiǎn)稱巴州)主要發(fā)生在馬養(yǎng)殖較多的縣市，和靜縣[1]最為突出，焉耆馬(地方品種馬匹總稱)為其特色，因近年來焉耆馬的存欄量在逐步減少，提高焉耆馬飼養(yǎng)數(shù)量已是非常重要。馬梨形蟲病[8]的廣泛流行，給巴州馬產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重的考驗(yàn)。隨著新疆馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，專業(yè)技術(shù)人員對(duì)該病的認(rèn)識(shí)及研究水平亦在不斷提高，正在努力掌握和探索一系列較為先進(jìn)的診斷和防控技術(shù)，為預(yù)防、控制馬梨形蟲病奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 從巴州和靜縣兩個(gè)山區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的焉耆馬養(yǎng)殖戶，共采集了68份全血樣品，同時(shí)進(jìn)行血液涂片，經(jīng)甲醇固定后帶回實(shí)驗(yàn)室染色。記錄馬匹年齡與性別，觀察馬匹體表是否有蜱蟲吸血，并一同采集了附著于馬匹體表的飽血、半飽血和地面未吸血的蜱蟲。

試劑：瓊脂糖、溴化乙錠，購自Sigma公司；賽百盛血液基因組DNA提取試劑盒，購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DL-2 000Marker、2×EsTaqMaster Mix(TaKaRa)，購自晶美有限公司。

RADIAL20 臺(tái)式高速離心機(jī)(西班牙 ORTOALRESA 公司)；DK-600A 型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DYY-III-5 型電泳儀(北京六一公司)；PCR儀(美國(guó) Bio-Rad公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 模板DNA提取 從EDTA抗凝管采集的全血樣品取出馬匹血液，使用北京賽百盛樹脂型基因組DNA提取試劑盒，按說明書操作提取馬全血基因組DNA。

1.2.2 引物 診斷所需的馬梨形蟲引物由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系 馬泰勒蟲(25 μL)：dNTPMixture 12.5 μL(TaKaRa)，上下游引物1 μL，模板2 μL，雙蒸水 9.5 μL 至終體積 25 μL?；靹蚝笾肞CR 擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，引物退火溫度為 55 ℃，退火時(shí)間30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30 個(gè)循環(huán)后 72 ℃延伸 3 min，最后10 ℃無限時(shí)設(shè)定。

駑巴貝斯蟲(25 μL)：dNTP mixture 12.5 μL(TaKaRa)，上下游引物 1 μL，模板 2 μL，雙蒸水9.5 μL至終體積25 μL?；靹蚝笾肞CR擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，引物退火溫度為 56 ℃，退火時(shí)間 45 s，72 ℃延伸 1min，共 35 個(gè)循環(huán)后 72 ℃延伸 10 min，最后 10 ℃無限時(shí)設(shè)定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR方法檢測(cè)馬梨形蟲感染情況

2.1.1 泰勒蟲病部分PCR陽性擴(kuò)增結(jié)果 以馬泰勒蟲Te18S為引物的駑巴貝斯蟲特異性引物，目的片段為 512 bp，陰性、陽性對(duì)照成立，陰性樣品未出現(xiàn)DNA條帶，有10個(gè)樣品出現(xiàn)512 bp左右的擴(kuò)增條帶。共 68 份樣品，10 份陽性，陽性率14.7%，見圖1。

2.1.2 馬駑巴貝斯蟲部分PCR陽性擴(kuò)增結(jié)果 以BC48為引物的駑巴貝斯蟲特異性引物，目的片段為 451 bp，陰性、陽性對(duì)照成立，陰性樣品未出現(xiàn)DNA條帶，有40個(gè)樣品出現(xiàn)451 bp左右的擴(kuò)增條帶。共68份樣品，40份陽性，陽性率58.8%，詳見圖2。

圖1 馬泰勒蟲Te18S靶基因PCR擴(kuò)增

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ；1～2：馬泰勒蟲擴(kuò)增產(chǎn)物 ；3：陰性對(duì)照

圖2 馬駑巴貝斯蟲BC48靶基因部分陽性PCR擴(kuò)增

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：馬駑巴貝斯蟲擴(kuò)增產(chǎn)物；3：陰性對(duì)照

2.1.3 混合感染情況 經(jīng)馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲診斷DNA 片段擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)兩種梨形蟲共同感染的血液樣品有7個(gè)，感染率為10.3%。

2.1.4 馬梨形蟲感染情況分析 馬駑巴貝斯蟲及泰勒蟲PCR 總感染率分別為58.8%(40/68)和14.7%(10/68)，兩鄉(xiāng)均以駑巴貝斯蟲感染為主，A鄉(xiāng)、B 鄉(xiāng)共68 匹焉耆馬中分別有不同的混合感染情況，感染率分別為14.0%(6/43)和4.0%(1/25)，經(jīng)SPPS20.0 軟件分析，兩地區(qū)梨形蟲血涂片及PCR感染情況無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 和靜縣部分地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬梨形蟲PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同性別馬匹感染馬梨形蟲病檢查結(jié)果對(duì)不同性別放牧馬群進(jìn)行馬梨形蟲病流行病學(xué)調(diào)查分析。PCR 結(jié)果表明，馬匹普遍感染駑巴貝斯蟲，且駑巴貝斯蟲感染率高于馬泰勒蟲；公馬與母馬駑巴貝斯蟲感染率分別為57.9%和60.0%，感染率最低為;公馬梨形蟲感染率均高于母馬；不同性別馬匹梨形蟲血涂片及PCR 結(jié)果。經(jīng)SPPS20.0 軟件分析，公馬與母馬梨形蟲檢出率均無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 不同性別焉耆馬梨形蟲病感染情況

2.3 不同年齡馬匹感染馬梨形蟲病檢查結(jié)果

對(duì)不同年齡放牧馬群進(jìn)行馬梨形蟲病流行病學(xué)調(diào)查分析，各年齡段馬匹梨形蟲均有感染；不同年齡馬匹梨形蟲血涂片及PCR 結(jié)果經(jīng)SPPS20.0軟件分析，各年齡段感染馬梨形蟲情況無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 不同年齡段焉耆馬梨形蟲病感染情況

3 討論與小結(jié)

調(diào)查結(jié)果表明，巴州和靜縣是馬梨形蟲病的流行地區(qū)，此次試驗(yàn)通過隨機(jī)抽樣被檢樣品對(duì)馬梨形蟲病采用血液涂片染色鏡檢法和聚合酶聯(lián)式反應(yīng)(PCR)檢測(cè)。傳統(tǒng)方法是血涂片法，該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性較差，而且?guī)x狀態(tài)感染的隱性馬匹，在多數(shù)情況下很難發(fā)現(xiàn)蟲體，只有在高熱期時(shí)蟲體檢出率較高。PCR技術(shù)是診斷該病較好的方法，本試驗(yàn)通過對(duì)68 份血液樣本的PCR 檢測(cè)，馬泰勒蟲陽性樣品為10 份，其感染率為14.71%(10/68)；駑巴貝斯蟲陽性樣品為40 份，其感染率為58.82%(40/68)；顯著高于血液涂片染色鏡檢法的16.9%(35/68)。將68 頭份被檢血液涂片的檢測(cè)結(jié)果按不同地區(qū)、年齡、性別分組分別進(jìn)行比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，馬巴梨形蟲感染情況在年齡段上和性別上均無明顯區(qū)別。

經(jīng)本次PCR 診斷結(jié)果分析，和靜縣部分地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬梨形蟲病病原種類主要以駑巴貝斯蟲為主，以泰勒蟲為輔，且亦混合感染，筆者建議，通過與科研院校合作的方式可以解決基層工作技術(shù)、設(shè)備不足等問題，通過分子生物學(xué)早期診斷，隨時(shí)掌握地方馬匹感染馬梨形蟲病病原種類及其感染強(qiáng)度。該試驗(yàn)數(shù)據(jù)可為地方散養(yǎng)戶馬梨形蟲病的綜合防控奠定基礎(chǔ)。

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2015-08-19

國(guó)家自然科學(xué)基金新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(U140-3283)

呼爾查(1986-)，男(蒙古族)，碩士生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：mg93210@163.com

巴音查汗，E-mail：bynch@hotmail.com

S858.21

B

0529-6005(2016)10-0042-02