杜久斌 ， 賀 筍 ， 劉小蘭 ， 程蘭玲 ， 張 迪 ， 李延濤 ， 李盛東 ， 袁 科

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司 ， 新疆烏魯木齊830001)

?

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)XJ-DB2株對25日齡仔豬毒力試驗(yàn)

杜久斌 ， 賀 筍 ， 劉小蘭 ， 程蘭玲 ， 張 迪 ， 李延濤 ， 李盛東 ， 袁 科

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司 ， 新疆烏魯木齊830001)

用生理鹽水將豬流行性腹瀉病毒細(xì)胞分離毒株XJ-DB2株稀釋成含104、105和106TCID50(病毒半數(shù)細(xì)胞感染量)3個(gè)劑量組。將16頭25日齡健康易感仔豬隨機(jī)分成4組，每組4頭。前3組分別口服1 mL含有104、105TCID50和106TCID50PEDV XJ-DB2株病毒液作為攻毒組，最后1組作為陰性對照口服同等量的生理鹽水。相同條件下隔離飼喂，連續(xù)觀察7 d，攻毒組全部出現(xiàn)豬流行性腹瀉臨床癥狀，對照組則無任何臨床癥狀。第7天全部剖殺，觀察腸組織病理變化。剖檢結(jié)果顯示：104TCID50劑量組中有3頭豬腸組織均有明顯病變(腸壁變薄、臌氣，腸內(nèi)充滿黃色液體)而另外1頭豬腸組織無明顯病變；105TCID50和106TCID50兩個(gè)劑量組8頭仔豬腸組織均出現(xiàn)明顯病變；陰性對照組4頭仔，豬腸組織均無病變。由此判斷XJ-DB2株為PEDV強(qiáng)毒株，以104TCID50劑量口服可以致25日齡仔豬發(fā)病。

仔豬 ； PEDVXJ-DB2株 ； TCID50； 臨床癥狀 ； 病理變化

豬流行性腹瀉僅發(fā)生于豬，各個(gè)年齡段豬均可感染發(fā)病。哺乳仔豬、保育小豬和肥育豬的發(fā)病率很高，但以哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重，母豬發(fā)病率變動很大，約為15%～90%。病豬是主要傳染源，病毒存在于腸絨毛上皮和腸系膜淋巴結(jié)，隨糞便排出后，污染環(huán)境、飼料、飲水，以及交通工具及用具而傳染。

經(jīng)人工發(fā)病試驗(yàn)，豬口服PEDV后，潛伏期一般為20 h至3 d。在實(shí)驗(yàn)室，新生仔豬最早有接種8 h后就開始發(fā)病的，病毒在小腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖，在16～30 h達(dá)到最大量。由于病毒的侵襲，小腸上皮細(xì)胞變性、絨毛脫落，導(dǎo)致小腸內(nèi)酶活性明顯下降，擾亂了消化及細(xì)胞運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和電解質(zhì)，引起急性吸收不良。對哺乳仔豬而言，就不能消化乳中的乳糖和蛋白質(zhì)，使腸內(nèi)產(chǎn)生高滲，液體在腸內(nèi)滯留，甚至從組織內(nèi)吸收液體，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉和脫水，酸中毒而死亡[1]。

本試驗(yàn)通過對25日齡仔豬口服PEDVXJ-DB2株，研究分離毒株XJ-DB2株對豬致病性的強(qiáng)弱。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：非洲綠猴傳代腎細(xì)胞(Vero)由本實(shí)驗(yàn)室保存。病毒：PEDV分離毒XJ-DB2株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。細(xì)胞培養(yǎng)基及血清：細(xì)胞培養(yǎng)基MEM和胎牛血清，均購自Hyclone公司。實(shí)驗(yàn)動物：25日齡健康易感仔豬(豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒抗原陰性，豬流行性腹瀉中和抗體效價(jià)不高于1∶4)，與15日齡時(shí)斷奶，隔離單獨(dú)飼養(yǎng)，飼喂顆粒豬飼料。

1.2 方法

1.2.1 PEDV TCID50的測定將PEDV DB2株細(xì)胞傳代毒解凍。用DMEM培養(yǎng)基將病毒作連續(xù)10倍稀釋，即10-1、10-2……每個(gè)稀釋度取100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨后加入經(jīng)0.25%胰酶消化的感染的宿主細(xì)胞100 μL(細(xì)胞含量以105/mL左右為宜)每個(gè)稀釋度作8個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白細(xì)胞培養(yǎng)對置37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中。逐日觀察細(xì)胞病變，并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，連續(xù)觀察5 d。用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.2.2 試驗(yàn)仔豬中和抗體的測定 按1.2.1中方法進(jìn)行病毒液TCID50的測定。將測定好TCID50的毒液稀釋成200個(gè)TCID50的病毒懸液。在96孔微量培養(yǎng)板中將血清(預(yù)先56 ℃滅活30 min)作連續(xù)倍比稀釋(具體方法是在96孔板中先加入50 μL生長液，再加50 μL待檢血清，混勻后，吸50 μL至下一孔，如此下去。一直到1∶256)每個(gè)稀釋度作4孔。在上述各孔內(nèi)加入50 μL稀的病毒液，混勻。同時(shí)設(shè)待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細(xì)胞對照，其中病毒對照要作200個(gè)TCID50、20個(gè)TCID50、2個(gè)TCID50、0.2個(gè)TCID504個(gè)不同濃度。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中作用45 min～60 min。感作完成后每孔加入 100 μL 細(xì)胞懸液，繼續(xù)置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果，一般觀察5～6 d。結(jié)果計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Ksrber法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 攻毒 將試驗(yàn)仔豬隨機(jī)分成4組，每組4頭。分別用104、105、1063個(gè)劑量PEDV分離毒XJ-DB-2株和生理鹽水1 mL對4個(gè)試驗(yàn)組仔豬進(jìn)行口服，相同條件下飼喂，連續(xù)觀察7 d并記錄臨床癥狀。

1.2.4 剖檢 7日后所有豬只剖檢觀察腸組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 PEDV TCID50PEDV分離毒株DB-2株19代細(xì)胞毒TCID50=1.0×106/mL。

2.2 試驗(yàn)仔豬攻毒前PEDV抗體 16只25日齡仔豬血清檢測中和抗體均不高于1∶4。

2.3 臨床癥狀 所有仔豬在攻毒后觀察臨床癥狀變化，攻毒組仔豬出現(xiàn)明顯的臨床癥狀嘔吐、腹瀉、脫水等癥狀，而陰性對照組均無臨床癥狀。每頭仔豬的臨床觀察結(jié)果見表1。

2.4 剖檢結(jié)果 通過剖檢發(fā)現(xiàn)，104TCID50攻毒劑量組有3頭仔豬出現(xiàn)明顯的腸組織病變(腸壁變薄、臌氣、內(nèi)充滿黃色液體或泡沫)1頭則無明顯的腸病變。105、106TCID50兩個(gè)劑量組，8 頭仔豬都出現(xiàn)明顯的腸病變。陰性對照組腸組織正常。

表1 攻毒后仔豬臨床癥狀觀察結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)選取25日齡豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒抗原陰性，豬流行性腹瀉中和抗體效價(jià)不高于1∶4仔豬進(jìn)行毒力試驗(yàn)，分別用3個(gè)劑量(104、105TCID50和106TCID50)的PEDV XJ-DB2株分離病毒進(jìn)行口服攻毒，通過臨床癥狀觀察，3個(gè)攻毒組部分仔豬在20 h左右部分豬出現(xiàn)嘔吐癥狀，且嘔吐物中含有泡沫，特別是進(jìn)食或飲水后。30 h左右出現(xiàn)腹瀉、震顫、行動遲緩等癥狀。70 h攻毒組仔豬全部表現(xiàn)精神沉郁、嗜睡、扎堆、驅(qū)趕不動，行動遲緩，站立震顫、腹瀉、脫水等癥狀，部分嘔吐仔豬癥狀變輕或消失。在整個(gè)發(fā)病過程中，每頭攻毒仔豬雖然發(fā)病程度輕重不同，但都會出現(xiàn)腹瀉癥狀。25日齡仔豬攻毒后，嘔吐物為黃色液體，腹瀉物為黑色黏稠水樣液體，這與兩周齡內(nèi)仔豬癥狀不同(兩周齡內(nèi)仔豬嘔吐物為黃色液體，有凝乳塊。腹瀉物為黃色或黃綠色液體[2])這可能與仔豬的飲食、日齡有關(guān)，其他癥狀均與兩，周齡內(nèi)仔豬感染PEDV癥狀相同。

剖檢104TCID50攻毒劑量組腸組織病變有1頭輕微，其余3頭腸組織病變很明顯，105、106TCID50攻毒劑量組8頭仔豬腸組織病變明顯，陰性對組4頭腸組織正常。所有仔豬腸病變主要體現(xiàn)在小腸部分，與報(bào)道的豬流行性腹瀉病毒在人工感染仔豬體內(nèi)的分布中剖檢結(jié)果相一致[3]，PEDV XJ-DB2株只引起豬的局部感染。

綜上所述，PEDV XJ-DB2株細(xì)胞適應(yīng)毒株為強(qiáng)致病性毒株，結(jié)合臨床癥狀和剖檢腸病變程度我們認(rèn)為104TCID50劑量可致25日齡仔豬發(fā)病，至于更低的劑量能否使25日齡仔豬發(fā)病還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] 錢永清，鄒勇，何錫忠，等.豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒病及其防治[J].豬病防治與保健，2004，6：28-31

[2] 王增計(jì).冬季養(yǎng)豬謹(jǐn)防豬流行性腹瀉[J].北方牧業(yè)，2012(2)：20.

[3] 楊臣，豬流行性腹瀉病毒在人工感染仔豬體內(nèi)的分布[J]．中國人民解放軍獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1986，6(1)：21-25.

2015-06-18

杜久斌(1979-)，男，獸醫(yī)師，本科，從事動物疫苗研發(fā)工作，E-mail：229895232@qq.com

賀筍，E-mail：18646206@163.com

S852.65+1

A

0529-6005(2016)10-0027-02