馬江波 許鑫 馬改改 沈潔 黃青華 施育平

單核細(xì)胞趨化蛋白-1基因多態(tài)性與浙江局部地區(qū)漢族人群2型糖尿病的相關(guān)性研究

馬江波 許鑫 馬改改 沈潔 黃青華 施育平

目的 探討單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）基因多態(tài)性與浙江局部地區(qū)漢族人群2型糖尿?。═2DM）的相關(guān)性。方法 采用病例對(duì)照研究，選取浙江局部地區(qū)漢族人群中T2DM患者208例（T2DM組）和健康體檢者209例（對(duì)照組），采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測受試者CCL2 rs1024611（-2518A/G）的基因型，并用DNA測序法鑒定部分結(jié)果。結(jié)果CCL2 rs1024611基因多態(tài)性與T2DM發(fā)生相關(guān)，T2DM組和對(duì)照組G基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），T2DM組和對(duì)照組GG基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），多因素logistic回歸分析顯示，GG基因型頻率可顯著降低T2DM風(fēng)險(xiǎn)（校正后OR=0.201，95%CI：0.077～0.526，P＜0.01）。結(jié)論 CCL2 rs1024611基因多態(tài)性與T2DM發(fā)生相關(guān)，其中GG基因型可能是T2DM的保護(hù)性因素，G等位基因可能降低漢族浙江局部地區(qū)漢族人群T2DM的風(fēng)險(xiǎn)。

單核細(xì)胞趨化蛋白-1 2型糖尿病 單核苷酸多態(tài)性

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2009年10月至2014年10月入住浙江省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科的T2DM患者208例，男143例，女65例，年齡55～76（65.8±10.1）歲。符合1999年WHO關(guān)于T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除感染、心腦血管疾病、自身免疫性疾病、非糖尿病引起的腎功能衰竭、惡性腫瘤患者。選擇性別、年齡相匹配的同期浙江省人民醫(yī)院門診健康體檢者209例作為對(duì)照組，男143例，女66例，年齡53～74（63.9±10.6）歲。本研究所有受試者均為中國浙江地區(qū)漢族人，個(gè)體之間無血緣關(guān)系。兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。所有入選者均征得本人或其家屬同意并簽署知情同意書。本研究獲得浙江省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 白細(xì)胞基因組DNA提取 所有對(duì)象采集晨起空腹靜脈血5ml 2管，其中一管測定血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血脂等，另一管以EDTA抗凝，以溶液鹽析法提取DNA，TE溶解，-80℃保存。

1.2.2 CCL2 rs1024611多態(tài)性檢測 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)方法參考文獻(xiàn)[8-10]。應(yīng)用上游引物5′-TCT CTC AGC CCA GCA CTG ACC-3′和下游引物 5′-GAG TGT TCA CAT AGG CTT CTG-3′擴(kuò)增包含CCL2 rs1024611（-2518A/ G）位點(diǎn)的DNA片段234 bp。當(dāng)-2518位點(diǎn)為G等位基因時(shí)，PCR產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶PvuⅡ（加拿大生工公司）切割產(chǎn)生2個(gè)片段：159 bp和75 bp。隨機(jī)選擇20%的T2DM組和20%的對(duì)照組，將每個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增片段送至上海生工生物工程有限公司，采用ABI_3730XL測序儀（美國ABI公司）進(jìn)行單向測序。DNA測序圖譜中多態(tài)性位點(diǎn)僅有一個(gè)G或A峰，表示其為純合GG或AA型；出現(xiàn)雙峰則表示其為雜合GA型測序得到的基因型與采用PCR-RFLP得到的基因型進(jìn)行比對(duì)，詳見圖1。

圖1 CCL2rs1024611（-2518A/G）瓊脂糖電泳及測序結(jié)果[a：M：DL500 DNA分子標(biāo)志物；1、4、5、6、7：AG型；2、8：AA型；3：GG型；b：小方框位置為多態(tài)性位點(diǎn)]

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。通過非條件logistic回歸分析校正危險(xiǎn)因素后估算基因型與表型的相關(guān)性。未校正的OR值和校正后的OR值分別采用單因素分析和多因素logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) CCL2 rs1024611在對(duì)照人群中的基因分型符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律（CCL2：χ2=2.01，P=0.156），表明對(duì)照人群的基因分布可反映整體人群基因的分布情況。

2.2 兩組對(duì)象一般資料的比較 在T2DM組中BMI、TG及LDL-C水平均高于對(duì)照組（均P＜0.05），而HDLC水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。T2DM組中空腹血糖和HbA1c高于對(duì)照組（P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組對(duì)象一般資料的比較

2.3 兩組CCL2 rs1024611（-2518A/G）基因型和等位基因頻率的比較 兩組CCL2 rs1024611的基因型和等位基因頻率分布見表2。T2DM組和對(duì)照組G基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。T2DM組和對(duì)照組GG基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），經(jīng)非條件logistic回歸分析校正BMI及血脂水平后，CCL2-2518 GG基因型能顯著降低發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)，為T2DM的保護(hù)性因素。

表2 兩組CCL2rs1024611（-2518A/G）基因型和等位基因頻率的比較

3 討論

T2DM呈復(fù)雜性遺傳模式，即多個(gè)基因變異加上環(huán)境因素的影響共同決定疾病的易感性。近年提出的T2DM的炎癥學(xué)說，認(rèn)為T2DM是一種慢性非特異性炎癥過程。而MCP-1對(duì)各種炎癥細(xì)胞有趨化激活作用。本研究分析了浙江局部地區(qū)漢族人群CCL2 rs1024611（-2518A/G）基因多態(tài)性與T2DM的關(guān)系，研究結(jié)果表明，CCL2 rs1024611(-2518A/G)基因多態(tài)性與漢族人群T2DM發(fā)生相關(guān)，其中GG基因型可能是T2DM的保護(hù)性因素，G等位基因可能降低浙江局部地區(qū)漢族人群T2DM的風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于MCP-1-2518A/G基因多態(tài)性與T2DM的關(guān)聯(lián)研究國內(nèi)外也有相關(guān)報(bào)道。本研究中對(duì)照組AA、AG、GG基因型分別為22.0%、44.5%、33.5%，這與Jiang等[9]報(bào)道的中國人群（病例數(shù)416）研究結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而與國外Simeoni[11]、Zietz等[12]報(bào)道的研究結(jié)果相比，G等位基因頻率高于高加索人群，提示該基因變異存在種族異質(zhì)性。

2004年，Simeoni等[11]對(duì)大樣本量的高加索人群研究后發(fā)現(xiàn)，血漿MCP-1水平升高與胰島素抵抗和T2DM發(fā)生呈顯著正相關(guān)，MCP-1 G-2518等位基因作為一種胰島素抵抗和T2DM負(fù)效因子有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Jing等[9]對(duì)中國人群的研究亦與本研究結(jié)果一致，均表明G等位基因可能為T2DM的保護(hù)性因素。然而，Zietz等[12]對(duì)高加索人群的另一項(xiàng)研究卻未發(fā)現(xiàn)MCP-1-2518A/G基因多態(tài)性與T2DM相關(guān)。其原因可能有：首先，部分研究樣本量太小，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)效能低，其研究結(jié)果可信度不高；其次，糖尿病的不同表型可能有不同的遺傳發(fā)病機(jī)制，目前已有多項(xiàng)研究報(bào)道MCP-1基因多態(tài)性與糖尿病微血管病變、糖尿病腎病、糖尿病大血管病變等糖尿病并發(fā)癥相關(guān)，若納入研究的T2DM表型不一致，是否合并糖尿病并發(fā)癥可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。

關(guān)于MCP-1基因多態(tài)性與T2DM關(guān)聯(lián)的機(jī)制研究主要集中在不同基因型其MCP-1表達(dá)水平的差異方面。研究表明，MCP-1-2518A/G位點(diǎn)的基因多態(tài)性影響炎癥刺激反應(yīng)中MCP-1的表達(dá)水平[6]。Simeoni等[11]研究也表明，T2DM患者體內(nèi)MCP-1水平顯著高于正常對(duì)照。MCP-1是炎癥趨化因子CC亞族的一員，對(duì)各種炎性細(xì)胞尤其是單核/巨噬細(xì)胞具有趨化激活作用，研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織可以產(chǎn)生MCP-1，當(dāng)脂肪沉積到達(dá)一定閾值時(shí)，來自脂肪細(xì)胞的因子，如TNF-α、MCP-1等引起巨噬細(xì)胞激活和浸潤，激活的巨噬細(xì)胞分泌各種炎癥因子，后者可損傷脂肪細(xì)胞胰島素敏感性，同時(shí)刺激周圍單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)一步激活和浸潤脂肪，最終引起全身胰島素抵抗[5]。因此作為一種重要的前炎癥細(xì)胞因子，MCP-1在炎癥-胰島素抵抗型-糖尿病的病理生理過程中起著重要作用。然而，Zietz等[12]研究卻發(fā)現(xiàn)，T2DM患者體內(nèi)MCP-1水平顯著升高，但MCP-1-2518A/G基因型和等位基因頻率與非糖尿病人群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與MCP-1水平也無相關(guān)性，提示MCP-1水平可能只是MCP-1-2518A/G基因型影響T2DM的發(fā)生和發(fā)展的部分原因，關(guān)于其完整和詳盡的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究從一定角度揭示了 CCL2 rs1024611基因多態(tài)性可能與浙江局部地區(qū)漢族人群T2DM發(fā)生相關(guān)，其中GG基因型可能是T2DM的保護(hù)性因素，G等位基因可能降低浙江局部地區(qū)漢族人群T2DM的風(fēng)險(xiǎn)，但由于T2DM屬多基因遺傳性疾病，每個(gè)易感基因的作用可能都是微小的，而且本研究的研究人群并非來自社區(qū)，雖然有明確的排除標(biāo)準(zhǔn)，但住院患者糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率顯然大于一般人群，這對(duì)研究結(jié)果造成了一定的偏倚。因此，有必要擴(kuò)大研究對(duì)象的數(shù)量，為進(jìn)一步從基因水平揭示MCP-1基因與糖尿病的關(guān)系提供依據(jù)。

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

Association of monocyte chemoattractant protein-1 gene polymorphism with risk of type 2 diabetes mellitus in Han population in Zhejiang province

MA Jiangbo,XU Xin,MA Gaigai,et al. Department of Endocrinology,Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310009，China

【 Abstract】 Objective To investigate the association of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)gene rs1024611 (-2518A/G)polymorphisms with risk of type 2 diabetes mellitus(T2DM)in Han population of Zhejiang province. Methods A total of 208 patients with T2DM and 209 healthy control subjects in Han population of Zhejiang province were enrolled in this study.Genotyping wasperformed by polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism and subsequently confirmed by DNA sequencing.Odds ratio(OR)and 95%confidence intervals(CI)were calculated for the risk of genotypes and alleles. Results MCP-1 gene polymorphism rs1024611(-2518A/G)was conformed to the Hardy-Weinberg equilibrium.The statistical differences in the G allele(43.7%vs.55.7%,P＜0.01)and GG genotype(19.2%vs.33.5%,P＜0.01) were found between T2DM patients and controls.The GG genotype was associated with a decreased risk of T2DM(OR=0.201, 95%CI:0.077-0.526,P＜0.01). Conclusion The MCP-1 gene rs1024611(-2518A/G)may be associated with T2DM susceptibility in Han population of Zhejiang province;GG genotype may be the protect factor for T2DM and G allele may reduce the risk of T2DM.

Monocyte chemoattractant protein-1 Type 2 diabetes mellitus Single nucleotide polymorphism

310009 杭州，浙江省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（馬江波、沈潔、黃青華）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院兒童保健科（許鑫）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科（馬改改、施育平）

施育平，E-mail：shiyuping007@hotmail.com不一致，且針對(duì)漢族人群的該基因多態(tài)性缺少系統(tǒng)性研究，目前僅有Jing等[9]針對(duì)江蘇地區(qū)人群（病例數(shù)416）進(jìn)行過系統(tǒng)研究。筆者擬探討CCL2 rs1024611基因多態(tài)性與浙江局部地區(qū)漢族人群T2DM易感性的關(guān)系，在不同人群中對(duì)該基因多態(tài)性與T2DM相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探討T2DM發(fā)生的病理生理機(jī)制。

2016-01-18）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同參與、相互作用所導(dǎo)致的慢性復(fù)雜代謝性疾病。近年來一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多炎癥因子與胰島素抵抗、T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，進(jìn)而提出了T2DM的炎癥學(xué)說，認(rèn)為T2DM是一種慢性非特異性炎癥過程[1-4]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）是炎癥趨化因子CC亞族的一員，對(duì)各種炎性細(xì)胞尤其是單核/巨噬細(xì)胞具有趨化激活作用，研究發(fā)現(xiàn)MCP-1作為一種胰島素反應(yīng)因子，在炎癥-胰島素抵抗-T2DM的病理生理過程中起著重要作用[5]。人類CCL2基因位于染色體17q11.2-q12上，位于遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)的SNP位點(diǎn)rs1024611（-2518A/G）能影響MCP-1的表達(dá)[6]。近年來有國內(nèi)外研究報(bào)道，MCP-1-2518A/G基因多態(tài)性與胰島素抵抗、T2DM及其并發(fā)癥相關(guān)[7-9]，然而研究結(jié)果尚