朱慧民 李露露 蔡遠(yuǎn)榛 陳琪 陳華群 張婭麗

紅豆杉多糖對免疫功能低下小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

朱慧民 李露露 蔡遠(yuǎn)榛 陳琪 陳華群 張婭麗

目的 探討紅豆杉多糖增強(qiáng)免疫低下小鼠免疫功能的機(jī)制。方法 將48只昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組，氫化可的松模型組，紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組，每組8只。除正常對照組外，其余各組小鼠皮下注射氫化可的松0.2mg/kg，隔天1次，共14 d，制備小鼠免疫功能低下模型。正常對照組和氫化可的松模型組予0.9%氯化鈉溶液10ml/kg灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別予等量不同濃度10、20、40mg/ml紅豆杉多糖溶液灌胃，猴頭菇多糖陽性對照組予等量濃度為1.1mg/ml猴頭菇多糖溶液灌胃,均1次/d，連續(xù)14d。流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠血CD4+、CD8+細(xì)胞百分比，ELIAS法檢測血清IL-4水平，測量小鼠胸腺指數(shù)。結(jié)果 與正常對照組比較，氫化可的松模型組CD4+、CD8+細(xì)胞百分比均明顯降低（P＜0.01），紅豆杉多糖低、中、高劑量組與氫化可的松模型組對比，CD4+、CD8+細(xì)胞百分比均有所增加（均P＜0.05），其中紅豆杉多糖中劑量組能降低CD4+/CD8+比值（P＜0.05）。與正常對照組比較，氫化可的松模型組血清IL-4水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；紅豆杉多糖低、中、高劑量組IL-4水平均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01）。氫化可的松模型組與正常對照組比較，胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組與氫化可的松模型組比較，胸腺指數(shù)均有所增加（P＜0.05），其中紅豆杉多糖中劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組均明顯增高（P＜0.01）。結(jié)論 紅豆杉多糖增強(qiáng)細(xì)胞免疫的機(jī)制它可能主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫來增強(qiáng)免疫低下小鼠的免疫功能。

紅豆杉多糖 T淋巴細(xì)胞亞群 胸腺指數(shù) 小鼠

紅豆杉是我國一級保護(hù)植物，具有較高的觀賞及藥用價(jià)值，其樹皮是抗腫瘤藥物紫杉醇的原料，但大量的紅豆杉在樹皮提取紫杉醇后便被遺棄，造成資源的極大浪費(fèi)。本課題組與浙江大學(xué)及省內(nèi)企業(yè)合作首次以極性梯度提取技術(shù)從紅豆杉科、紅豆杉屬植物南方紅豆杉中發(fā)現(xiàn)、提純并分離出“紅豆杉多糖”（已獲國家發(fā)明專利授權(quán)：03129421.9），并在近年研究中逐步完成其毒理學(xué)、藥效學(xué)、藥代學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)該多糖具有抗腫瘤[1]、抗糖尿病[2]、抗氧化等作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有干預(yù)心肌缺血再灌注損傷等生物學(xué)特性和功能[3-5]。筆者在前期研究中，發(fā)現(xiàn)紅豆杉多糖可增強(qiáng)免疫功能低下小鼠的相關(guān)免疫功能[6]?，F(xiàn)進(jìn)一步探討這一作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 昆明小鼠48只，7周齡，22～25g,雄性清潔級，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK（浙）2010-0150。低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司），電熱恒溫水箱（一恒儀器公司），漩渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠），酶標(biāo)儀（美國Aurobiio公司），全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（匯松儀器廠），流式細(xì)胞儀（美國BD公司）?？剐∈驝D8+（PE）、抗小鼠CD4+（PE）、小鼠IL-4 ELIAS試劑盒（武漢博士得生物有限公司），猴頭菇多糖（中國無限極有限公司，含量90%）粉劑5g，紅豆杉多糖（浙江省中醫(yī)藥研究所，含量90%）粉劑5g。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與干預(yù) 按隨機(jī)數(shù)字表法將48只小鼠分為6組：正常對照組，氫化可的松模型組，紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組，每組8只。氫化可的松模型組、猴頭菇多糖陽性對照組及紅豆杉多糖低、中、高劑量組小鼠皮下注射氫化可的松0.2mg/kg，隔天1次，共14d，完成造模[8]。于造模第1天起，正常對照組及氫化可的松模型組小鼠予0.9%氯化鈉溶液10ml/kg灌胃；紅豆杉多糖低、中、高劑量組小鼠予等量紅豆杉多糖溶液（將粉劑溶于0.9%氯化鈉溶液配置不同濃度10、20、40mg/ml）等量灌胃；猴頭菇多糖陽性對照組小鼠予等量猴頭菇多糖溶液（將粉劑用0.9%氯化鈉溶液配置濃度1.1mg/ml）灌胃，均1次/d，連續(xù)14d[9]。

1.2.2 T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 末次給藥后12h，各組小鼠眼眶取血50μl加入流式管中，并加以4%EDTANa2抗凝，再取PE-CD4-Ab、PE-CD8-Ab各3μl，依次加入流式管中，混勻后避光15min，結(jié)束后加入200μl紅細(xì)胞裂解液，渦輪震蕩，再次避光孵育10min，結(jié)束后離心3 000r/min，棄上清液，加入500μlPBS，暗室室溫下孵育10min，流式細(xì)胞儀測定CD4+、CD8+細(xì)胞百分比。

1.2.3 血清IL-4水平的測定 末次給藥12h后，摘眼球采血0.5ml，按組別裝入EP管，肝素抗凝，4℃3 000r/ min離心3min，標(biāo)本分為血清及血細(xì)胞沉淀，取血清，采用ELIAS法，按試劑盒說明書方法操作，酶標(biāo)儀450nm處檢測吸光度A值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-4水平。

1.2.4 胸腺指數(shù)測量 末次給藥12 h后，稱量小鼠體重，摘取小鼠胸腺組織，濾紙吸干殘血后稱重（mg），分別除以小鼠體重，再乘以10，得到小鼠胸腺指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表達(dá)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況 造模與干預(yù)結(jié)束后，氫化可的松模型組小鼠可見皮膚松弛，進(jìn)針處皮膚潰爛，精神萎靡，活動(dòng)度差，進(jìn)食差；正常對照組小鼠皮膚緊實(shí)，無精神萎靡、進(jìn)食差等表現(xiàn)；紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組小鼠也可見皮膚松弛，但較氫化可的松模型組程度輕，進(jìn)針處皮膚有潰爛，面積較氫化可的松模型組小，活動(dòng)度尚可，進(jìn)食可。

2.2 各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的比較 與正常對照組比較，氫化可的松模型組CD4+、CD8+細(xì)胞百分比均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），說明氫化可的松成功建立免疫低下小鼠的模型。紅豆杉多糖高、中、低劑量組及猴頭菇陽性對照組CD4+、CD8+細(xì)胞百分比均高于氫化可的松模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），且以中劑量組升高更為顯著；紅豆杉多糖中劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組均能降低CD4+/CD8+比值，與氫化可的松模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；紅豆杉多糖高、低劑量組與氫化可的松模型組比較CD4+/CD8+比值有降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表1。

表1 各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的比較

2.3 各組小鼠血清IL-4水平的比較 與正常對照組比較，氫化可的松模型組血清IL-4水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。紅豆杉多糖低、中、高劑量組IL-4水平均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01），詳見表2。

表2 各組小鼠血清IL-4水平的比較（pg/ml）

2.4 各組小鼠胸腺指數(shù)的比較 與正常對照組比較，氫化可的松模型組胸腺指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；猴頭菇多糖陽性對照組及紅豆杉多糖低、中、高劑量組胸腺指數(shù)均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01），詳見表3。

表3 各組小鼠胸腺指數(shù)的比較

3 討論

免疫器官的重量是反應(yīng)機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，免疫抑制劑可造成機(jī)體免疫器官重量下降或者功能低下，而免疫促進(jìn)劑可使免疫器官的重量恢復(fù)正常，胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能。目前胸腺指數(shù)成為判斷體內(nèi)細(xì)胞免疫水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)[10]。細(xì)胞免疫為T細(xì)胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞，當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機(jī)體，致敏T細(xì)胞對抗原有直接殺傷作用，T細(xì)胞所釋放的淋巴因子有協(xié)同殺傷作用。T淋巴細(xì)胞亞群是細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，可分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）、輔助性T細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）和抑制性T細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)多數(shù)細(xì)胞因子可通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群的增殖及分化直接增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，還可激活T淋巴細(xì)胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4等細(xì)胞因子增強(qiáng)殺傷性T細(xì)胞、NK細(xì)胞等的殺傷活性，協(xié)同B細(xì)胞增殖及分泌抗體，同時(shí)在一定程度上可刺激誘導(dǎo)活化的CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)CD4+/CD8+細(xì)胞比例，從而起到調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的作用[11-12]。故T淋巴細(xì)胞亞群的檢測分析是判斷細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要方法，正常機(jī)體內(nèi)CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞保持一定的比例，當(dāng)兩者比例失衡，即可產(chǎn)生免疫功能紊亂。

本研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量紅豆杉多糖均能明顯提高氫化可的松誘導(dǎo)的免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)水平，其中猴頭菇多糖陽性對照組及紅豆杉多糖中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；紅豆杉多糖對免疫低下小鼠的CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞有促進(jìn)增殖的能力；同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)紅豆杉多糖低、中、高劑量組IL-4水平均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01），提示紅豆杉多糖改善免疫功能低下小鼠細(xì)胞免疫功能。

綜上所述，紅豆杉多糖能提高免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)及IL-4水平，對CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞有促進(jìn)增殖的能力，可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫來增強(qiáng)免疫功能低下小鼠的免疫功能。

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Effects of taxus polysaccharide on cellular immunity of immunosuppressed mice

ZHU Huimin,LI Lulu,CAI Yuanzhen,et al. Department of Geriatric Medicine，Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province,the Second Clinical Medical Conllege of Wenzhou Medical University,Taizhou 318000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of taxus polysaccharide on cellular immunity of immunosuppressed mice. Methods Forty-eight male Kunming mice were divided into 6 groups.Five groups of mice were administered with hydrocortisone (Hy)(0.2mg·kg-1q.o.d x14d s.c)to induce immunosuppression,3 of these groups received taxus polysaccharide treatment (10mg/ml,20mg/ml,40mg/ml),1 group received polysaccharide of hericium erinaceusthe(HEP),1 group received normal saline (NS).Serum CD4+,CD8+levels were detected by flow cytometry,and the thymus index was measured. Results The number of CD4+T cells,CD8+T cells were significantly reduced in Hy-groups compared with normal group,but in high-dose,and middle-dose the number of CD4+T cells,CD8+T cells was significantly increased(P＜0.01),the CD4+/CD8+ratio was decreased in middle dose group compared with model group (P＜0.05).Compared with control group,thymus index was elevated in treatment groups(P＜0.05),which was more markedly in the middle dose group(P＜0.01). Conclusion Taxus polysaccharide can improve the cellular immunity in immunodepressed mice.

Taxus polysaccharide T-lymphocyte Thymus index Mice

2015-12-21）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省臺州市科技局科技計(jì)劃基金（111ky7-2）

318000 臺州市中心醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（朱慧民）；溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（李露露）；臺州市中心醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科（陳琪、陳華群、張婭麗）；寧波第七醫(yī)院心內(nèi)科（蔡遠(yuǎn)榛）

朱慧民，E-mail：hkat@163.com