王瑞麗 戴威 李鳳琴 吳立琴 戴元榮

微囊蛋白1及細(xì)胞內(nèi)鈣離子在TGF-β1誘導(dǎo)哮喘大鼠氣道平滑肌增殖中的作用

王瑞麗 戴威 李鳳琴 吳立琴 戴元榮

目的 探討微囊蛋白1、細(xì)胞內(nèi)鈣離子在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）增殖中的作用。方法 離體培養(yǎng)大鼠ASMCs，并分為正常組、哮喘組、TGF-β1干預(yù)組、TGF-β1+β-環(huán)糊精（β-CD）干預(yù)組，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖水平；Western blot法檢測(cè)各組微囊蛋白1含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組ASMCs胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。結(jié)果 哮喘組OD值較正常組明顯增加（P＜0.05），TGF-β1組OD值較正常組、哮喘組明顯增加（P＜0.05），TGF-β1+β-CD組OD值較TGF-β1組明顯增加（P＜0.05）。TGF-β1組較正常組和哮喘組微囊蛋白1含量減少（P＜0.05），TGF-β1+β-CD組較TGF-β1組微囊蛋白1含量減少（P＜0.05）。TGF-β1組較正常組和哮喘組胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增加（P＜0.05），TGF-β1+β-CD組較TGF-β1組胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增加（P＜0.05）。相關(guān)關(guān)系分析示細(xì)胞增殖水平與微囊蛋白1含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.51，P＜0.05），細(xì)胞增殖水平與鈣離子熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)（r=0.60，P＜0.05），微囊蛋白1含量與鈣離子熒光強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.87，P＜0.05）。結(jié)論 微囊蛋白1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的ASMCs增殖,這種抑制作用可能部分是通過減少胞內(nèi)游離鈣離子來實(shí)現(xiàn)的。

哮喘 平滑肌細(xì)胞 增殖 微囊蛋白 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 鈣離子 β環(huán)糊精類 大鼠

氣道重塑被認(rèn)為是引起難治性哮喘的重要病理生 理基礎(chǔ)，在哮喘發(fā)病中的作用越來越受到重視。而氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖在哮喘氣道重塑中占有十分重要的地位[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能刺激ASMCs的分裂與增殖，微囊和微囊蛋白1是ASMCs對(duì)細(xì)胞外信號(hào)的核心處理器[2]。本課題組前期研究顯示，微囊蛋白1能通過抑制ASMCs增殖來影響哮喘的氣道重塑[3-4]，但微囊蛋白1對(duì)ASMCs增殖的抑制作用以及TGF-β1對(duì)其調(diào)控的具體機(jī)制尚不清楚；Zon等[5]發(fā)現(xiàn)在大鼠ASMCs中，鈣池操縱的鈣通道電流在細(xì)胞增殖期明顯高于靜止期，鈣池操縱的鈣通道阻滯劑Ni2+可以抑制ASMCs的增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，在人的ASMCs中，微囊蛋白1在調(diào)節(jié)胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)過程中發(fā)揮重要作用[6]。筆者擬通過體外培養(yǎng)ASMCs，探討微囊蛋白1及胞內(nèi)鈣離子在TGF-β1誘導(dǎo)ASMCs增殖中的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和試劑 SPF級(jí)雄性SD大鼠由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重100～120g，合格證號(hào)：SYXK（浙）2010-0150）。TGF-β1（美國(guó)PeproTech公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司），優(yōu)級(jí)胎牛血清（杭州四季青公司），1型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），胰酶細(xì)胞消化液、青霉素、鏈霉素（江蘇碧云天生物工程有限公司），ECL試劑盒（美國(guó)Pierce公司），微囊蛋白1抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國(guó)Abcam公司），GAPDH抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（江蘇碧云天生物工程有限公司），F(xiàn)luo-3/AM（日本Dojindo公司），β環(huán)糊精（β cyclodextrin，β-CD）（美國(guó)CST公司）。

1.2 ASMCs培養(yǎng)及分組 參照Palmans等[7]方法成功建立大鼠慢性哮喘模型后，將正常和哮喘大鼠利用組織塊貼壁法進(jìn)行ASMCs培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶細(xì)胞消化液傳代。用 3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用的ASMCs用平滑肌α肌動(dòng)蛋白（α-actin）抗體，SABC免疫組織化學(xué)法進(jìn)行鑒定。ASMCs培養(yǎng)成功后分為正常組、哮喘組、10μg/L TGF-β1干預(yù)組、10μg/L TGF-β1+β-CD干預(yù)組。

1.3 CCK-8法檢測(cè)ASMCs的增殖 取3～6代細(xì)胞，消化、離心后，用含l0%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至4×103～5×103/ml，然后接種于96孔板，每孔100μl，待細(xì)胞80%～90%融合后，換無血清RPMI 1640培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0期，正常組、哮喘組用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；TGF-β1干預(yù)組加入10μg/L TGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)，TGF-β1+β-CD干預(yù)組在加入TGF-β1前1h，先加入10mmol/L的β-CD。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在每孔中加入10μl CCK-8，混勻后繼續(xù)置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)1～4h，注意避光操作。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖時(shí)，細(xì)胞增殖越多越快，顏色便越深，所測(cè)OD值越大，故將OD值作為各組細(xì)胞增殖水平。

1.4 Western blot法檢測(cè)ASMCs上微囊蛋白1的含量提取上述各組干預(yù)后的ASMCs總蛋白質(zhì)，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。按每孔40μg蛋白量加樣進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉1～2h，分別加兔抗大鼠微囊蛋白1抗體（1∶1 000）及小鼠抗大鼠GAPDH抗體（1∶5 000）孵育，4℃過夜。TBST洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶2 000）及山羊抗小鼠二抗（1∶3 000），室溫孵育1～2h，洗膜，ECL顯影。采用AlphaEaseFC 4.0軟件分析目的蛋白微囊蛋白1和內(nèi)參GAPDH的吸光度值，以目的蛋白和內(nèi)參吸光度的比值代表目的蛋白的相對(duì)含量。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASMCs細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子 取上述各組干預(yù)后的ASMCs，用胰酶細(xì)胞消化液消化成單細(xì)胞懸液，1 000r/min離心5min，棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000r/min離心5min，使用無血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入5μl的Fluo-3/AM母液使其終濃度為5μmol/L，37℃避光孵育30min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，1 000r/min離心5min，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0及GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差為齊性者采用LSD－t法，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)表示，多組間比較采用Kruska-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi法檢驗(yàn)；相關(guān)關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 各組ASMCs增殖水平的比較 結(jié)果顯示，正常組OD值為0.87±0.11，哮喘組為1.01±0.16，10 μg/L TGF-β1組為1.11±0.15，10 μg/L TGF-β1+β-CD組為1.25±0.13，哮喘組細(xì)胞OD值較正常組明顯增加（P＜0.05）；TGF-β1組OD值較正常組、哮喘組明顯增加（P＜0.05）；TGF-β1+ β-CD組OD值較TGF-β1組明顯增加（P＜0.05）。

2.2 各組ASMCs上微囊蛋白1含量的比較 TGF-β1組較正常組和哮喘組微囊蛋白1含量減少（P＜0.05）；TGF-β1+β-CD組較TGF-β1組微囊蛋白1含量減少（P＜0.05），詳見圖1。

圖1 各組ASMCs上微囊蛋白1含量的比較（與正常組比較，*P＜0.05；與哮喘組比較，△P＜0.05；與TGF-β1組比較，▲P＜0.05）

2.3 各組ASMCs細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度的比較TGF-β1組較正常組和哮喘組胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增加（P＜0.05）；TGF-β1+β-CD組較TGF-β1組胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增加（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組ASMCs細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度的比較（與正常組比較，*P＜0.05；與哮喘組比較，△P＜0.05；與TGF-β1組比較，▲P＜0.05）

2.4 相關(guān)性分析 細(xì)胞增殖與微囊蛋白1蛋白含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.51，P＜0.05），細(xì)胞增殖與鈣離子熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)（r=0.60，P＜0.05），微囊蛋白1蛋白含量與鈣離子熒光強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.87，P＜0.05）。

3 討論

近年研究表明，TGF-β1是導(dǎo)致氣道重塑的重要細(xì)胞因子[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在一定濃度和作用時(shí)間范圍內(nèi)，10μg/L為TGF-β1的最佳干預(yù)濃度[9]。故本實(shí)驗(yàn)選取10μg/L TGF-β1進(jìn)行哮喘組細(xì)胞干預(yù)。結(jié)果顯示，TGF-β1可以促進(jìn)哮喘ASMCs的增殖。

微囊是存在于細(xì)胞膜上燒瓶樣的內(nèi)陷微結(jié)構(gòu)，它參與細(xì)胞的眾多生命活動(dòng)。微囊蛋白1是微囊最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與平滑肌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[2]。研究證實(shí)微囊上有TGF-β受體（transforming growth factor-βreceptor，TβR）的存在[10]。TGF-β1主要通過與微囊上的TβR結(jié)合發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，脂筏介導(dǎo)的TβR內(nèi)在化和或）微囊蛋白1介導(dǎo)的TβR內(nèi)吞作用可促進(jìn)受體降解，進(jìn)而抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1促進(jìn)ASMCs增殖過程中，微囊蛋白1表達(dá)量明顯下降，使用膽固醇剔除劑β-CD破壞微囊后，微囊蛋白1的表達(dá)進(jìn)一步減少，ASMCs的增殖明顯增加，相關(guān)關(guān)系分析顯示細(xì)胞增殖與微囊蛋白1含量呈負(fù)相關(guān)。因此本研究表明微囊蛋白1在TGF-β1誘導(dǎo)ASMCs增殖過程中發(fā)揮著負(fù)性調(diào)控作用。

鈣離子信號(hào)是維持ASMCs功能的重要機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高可促進(jìn)氣道平滑肌增生肥厚[14]。Sathish等[15-16]發(fā)現(xiàn)，微囊蛋白1在調(diào)節(jié)人ASMCs細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1刺激ASMCs后胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于哮喘組和正常組，而使用β-CD干預(yù)后，其較單獨(dú)TGF-β1刺激，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增加更為明顯,且與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，提示微囊蛋白1表達(dá)的缺失，可引起ASMCs胞內(nèi)游離鈣離子的增加，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但微囊蛋白1調(diào)節(jié)ASMCs胞內(nèi)鈣離子的機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，微囊蛋白1可抑制TGF-β1引起的ASMCs增殖，在哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要作用，該過程可能部分是通過減少胞內(nèi)游離鈣離子實(shí)現(xiàn)的。

[1] Munakata M.Airway remodeling and airway smooth muscle in asthma[J].AllergolInt,2006,55(3):235-243.

[2] Peterson TE,GuicciardiM E,GulatiR,et al.Caveolin-1 can regulate vascular smooth muscle cell fate by switching platelet-derived growth factor signaling from a proliferative to an apoptotic pathway[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(9):1521-1527.

[3] 曾濰賢,戴元榮.微囊蛋白1對(duì)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的抑制機(jī)制及羅紅霉素的調(diào)控作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013,93(34):2750-2754.

[4] 王瑞麗,陳慧君,戴元榮,等.caveolin-1和p42/p44MAPK在哮喘大鼠氣道重塑中的作用及羅紅霉素對(duì)其表達(dá)的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,43(3):166-170.

[5] Zou J J,Gao Y D,Geng S,et al.Role of STIM1/Orai1-mediated store-operated Ca2+entry in airway smooth muscle cell proliferation[J].J ApplPhysiol(1985),2011,110(5):1256-1263.

[6] Prakash Y S,Thompson M A,Vaa B,et al.Caveolins and intracellular calcium regulation in human airway smooth muscle[J].Am J PhysiolLung CellMolPhysiol,2007,293(5):L1118-L1126.

[7] Palmans E,Kips J C,Pauwels R A.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2 Pt 1):627-635.

[8] Prakash Y S.Airway smooth muscle in airway reactivity and remodeling:what have we learned[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2013,305(12):L912-L33.

[9] 吳立琴,戴元榮,李鳳琴,等.TGF-β1對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2014,36(13):1133-1136.

[10] Miyasato S K,Loeffler J,Shohet R,et al.Caveolin-1 modulates TGF-β1 signaling in cardiac remodeling[J].Matrix Biol,2011, 30(5-6):318-329.

[11] Derynck R,Zhang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling[J].Nature,2003, 425(6958):577-584.

[12] Schmierer B,Hill C S.TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and function flexibility[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(12):970-982.

[13] Zhao B,Wang Q,Du J,et al.PICK1 promotes caveolin-dependent degradation of TGF-βtypeⅠreceptor[J].Cell Res,2012, 22(10):1467-1478.

[14] 高亞東,楊炯.鈣池操縱的鈣通道與支氣管哮喘氣道平滑肌功能調(diào)控[J].國(guó)際呼吸雜志,2012,32(5):393-397.

[15] Sathish V,Abcejo A J,VanOosten S K,et al.Caveolin-1 in cytokine-induced enhancement of intracellular Ca2+in human airway smooth muscle[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2011,301(4):607-614.

[16] Sathish V,Thompson M A,Sinha S,et al.Inflammation,caveolae and CD38-mediated calcium regulation in human airwaysmooth muscle[J].Biochim Biophys Acta,2014,1843(2):346-351.

Effect of caveolin-1 and intracellular Ca2+on the TGF-β1-induced ASMCs proliferation in asthmatic rats

WANG Ruili,DAI Wei, LI Fengqin,et al.Department of Critical Care,the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027, China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of caveolin-1 and intracellular Ca2+([Ca2+](i))on TGF-β1-induced proliferation of airway smooth muscle cells(ASMCs)in asthmatic rats. Methods ASMCs ofrats were isolated and cultured in vitro. CCK-8 method was used to detect cell proliferation and Western blot method was used to detect the expression of caveolin-1 protein.FCMwas used to detect[Ca2+](i). Results OD value in asthma group was higher than that in normal group (P＜0.05), OD value in TGF-β1 group was higher than that in normal group and asthma group(P＜0.05),OD value in TGFβ1+β-CD group was higher than that in TGF-β1 group(P＜0.05).The expression of caveolin-1 in TGF-β1 group was significantly lower than that in normal group and asthma group(P＜0.05),the expression of caveolin-1 in TGF-β1+β-CD group was significantly lower than that in TGF-β1 group(P＜0.05).The[Ca2+](i)of ASMCs in TGF-β1 group was higher than that in normal group and asthma group(P＜0.05),the[Ca2+](i)of ASMCs in TGF-β1+β-CD group was higher than that in TGF-β1 group(P＜0.05).There was negative correlation between cell proliferation and the expression of caveolin-1 protein(r=-0.51,P＜0.05),cell proliferation was positively correlated with the[Ca2+](i)(r=0.60,P＜0.05),caveolin-1 protein was negatively correlated with the[Ca2+](i)(r=-0. 87,P＜0.05). Conclusion Caveolin-1 cab suppress TGF-β1-induced ASMCs proliferation in asthmatic rats,which is associated with the decrease of[Ca2+](i).

Asthma Airway smooth muscle cells Proliferation Caveolins TGF-β1 Ca2+Beta-cyclodextrins Rats

2016-03-21）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃（2009A144）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（王瑞麗、戴威），呼吸內(nèi)科（李鳳琴、吳立琴、戴元榮）

戴元榮，E-mail：daiyr@126.com