黃虹 江纓 袁放 鄭和昕 阮園 吳天鳳

大蒜素對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用的實驗研究

黃虹 江纓 袁放 鄭和昕 阮園 吳天鳳

目的 探討大蒜素對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用及其機制。方法 將60只雄性SD大鼠采用腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立糖尿病腎病大鼠模型，造模成功的大鼠采用隨機數(shù)字表法分為低、中、高劑量組[分別采用15、30、45mg/（kg·d）大蒜素混懸液灌胃]、貝那普利組[貝那普利17.5 mg/（kg·d）灌胃]和模型組（0.9%氯化鈉溶液灌胃），各12只，另以10只SD大鼠0.9%氯化鈉溶液灌胃為正常對照組,分別于用藥的0、4、8、12周末檢測大鼠空腹血糖（FBG）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）和24h尿白蛋白排泄率（UAE）水平，12周末時檢測大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量；采用電鏡及Masson染色觀察大鼠腎組織病理學變化；采用Western blot法檢測腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、I型膠原（Collagen I）及p-ERK1/2蛋白的表達強度。結(jié)果 12周末時，高劑量組大鼠的腎質(zhì)量/體質(zhì)量、FBG、Scr、BUN、UAE低于模型組（均P＜0.05），且腎小球肥大、系膜細胞增生、腎小球變形病變明顯減輕，TGF-β1、Collagen I及p-ERK1/2的蛋白表達均顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論 大蒜素可降低糖尿病腎病大鼠腎組織TGF-β1、Collagen I及p-ERK1/2的表達，具有一定的腎保護作用。

大蒜素 糖尿病腎病 TGF-β1 p-ERK1/2

【 Abstract】 Objective To investigate the renal protective effect and mechanism of allicin on rats with diabetic nephropathy. Methods Diabetic nephropathy model were established by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)in 60 male SD rats,then the animals were randomly divided into 5 groups with 12 in each group.Rats in low,middle and high dose allicin groups were given 15,30,45 mg/kg·d allicin,respectively,rats in benazepril group were given 17.5 mg/kg·d benazepril by gavage and no drug was given to rats in model group.Ten SD male rats were included in experiment as normal control group. Fasting blood glucose(FBG),serum urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr)and 24-h urine albumin excretion(UAE)were detected at the 4,8,12th weeks.At the end of 12 weeks animals were sacrificed,the body mass,kidney mass,and the ratio of kidney mass/body mass of rats were detected.Histopathological changes of kidney were observed by light microscope,electron microscope,and Masson staining.Expression of collagen I,transforming growth factor-β1(TGF-β1)and phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1/2(p-ERK1/2)were examined by Western blot. Results Compared with model group,the kidney mass/body mass,FBG,Scr,BUN and 24-h UAE in high dose allicin group were significantly decreased at the end of wk 12(P＜0.05),the glomerular hypertrophy,mesangial cell proliferation,glomerular deformation lesions were significantly attenuated, and the expression of TGF-β1,collagen I and p-ERK1/2 protein were decreased significantly(P＜0.01). Conclusion Allicin may have a protective role in diabetic nephropathy rats,which is associated with the down-regulation of TGF-β1,collagen I and p-ERK1/2 expression.

【 Key words】 Allicin Diabetic nephropathy Transforming growth factor-β1 Phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1/2

糖尿病腎病是糖尿病常見、嚴重的慢性并發(fā)癥，也是導致終末期腎病的主要原因。我國終末期腎病患者的比例正逐年增加[1]，探討糖尿病腎病的發(fā)病機制，尋找有效治療的新靶點，對防治糖尿病腎病、延緩終末期腎病的進程具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用，對腎細胞的分化、增生和細胞外基質(zhì)的合成及降解具有很強的調(diào)控作用[2]；大蒜素為大蒜的主要有效成分，具有抗肺、肝及心肌纖維化的作用[3-6]，但鮮有關(guān)于大蒜素對糖尿病腎病干預作用的報道。本研究通過檢測大蒜素對糖尿病腎病大鼠模型腎組織TGF-β1及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響，探討大蒜素對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用及可能機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗大鼠：選擇雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量200～220g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[動物許可證號：SCXK（浙）2008-0016]。（2）主要藥物、試劑和儀器：大蒜素注射液（規(guī)格30mg/2ml，生產(chǎn)批號：8239401）購自上海禾豐制藥有限公司；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司；枸櫞酸緩沖液（0.1mol/L，pH 4.5）由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心配制；貝那普利（10mg/片，生產(chǎn)批號：20110513）購自北京諾華制藥有限公司。尿微量白蛋白（UAE）ELISA試劑盒購自美國Exocell公司；Masson染色試劑盒購自南京建成科技有限公司。兔抗鼠TGF-β1、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗鼠CollagenⅠ抗體購自Abcam公司；p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體購自Cell Signal Technology公司。日立7170自動生化分析儀由日本日立公司提供，Sigma高速冷凍離心機由德國SIGMA公司提供，血糖儀由美國羅氏公司提供。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病腎病大鼠模型制備 參考文獻[7]，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常對照組（10只）外，其余60只大鼠均行STZ60 mg/kg單次腹腔注射（使用前用枸櫞酸緩沖液溶解），注射72h后，尾靜脈采血測血糖，連續(xù)3d隨機血糖≥16.7mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。糖尿病大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)1周，以1周后隨機血糖≥16.7mmol/L，24h尿量大于造模前50%、24h尿白蛋白大于造模前50%為糖尿病腎病模型制備成功。

1.2.2 實驗分組及給藥方法 60只糖尿病腎病模型大鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組（每組12只），其中低、中、高劑量組分別予大蒜素15、30、45mg/（kg·d），貝那普利組予貝那普利17.5 mg/（kg·d），均用0.9%氯化鈉溶液稀釋至3ml，模型組及正常對照組予3ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃[8-9]。大鼠單籠飼養(yǎng)，每日上午給藥1次，連續(xù)12周。實驗期間大鼠自由飲水、標準飲食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2.3 標本的收集 分別于實驗的0、4、8、12周末給每組大鼠稱重，之后股靜脈采血，分離血清測定空腹血糖（FBG）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等生化指標，用代謝籠留取大鼠24h尿液并記錄，取10ml，5 000r/min離心10min，去除沉渣，于-20℃冰箱保存待測。給藥12周末時，稱重后處死大鼠，以10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，剪開大鼠腹腔，采用10ml注射器進行心臟取血，室溫靜置1h后，5 000r/min離心15min，吸取上層血清，于-20℃冰箱保存待測。大鼠處死后迅速取出腎臟，經(jīng)4℃預冷的0.9%氯化鈉溶液灌洗，至整個腎臟顏色變蒼白后游離，去除包膜稱腎質(zhì)量，取部分腎皮質(zhì)置于40g/L多聚甲酚固定，以備組織病理檢測。

1.2.4 生化指標測定 采用日立7170全自動生化分析儀測定FBG、Scr、BUN。24h尿微量白蛋白檢測采用NephratⅡELISA試劑盒操作說明進行。

1.2.5 腎組織病理檢測 將4%多聚甲醛溶液固定的腎組織石蠟包埋，常規(guī)組織切片（3μm），行Masson染色，于光鏡下觀察腎組織病理變化，并采用電鏡觀察腎組織的病變情況。

1.2.6 Western blot檢測 分別采用總蛋白抽提試劑盒、膜蛋白抽提試劑盒提取腎臟組織總蛋白和膜蛋白。蛋白含量采用紫外分光光度法在280nm處進行濃度測定。取總蛋白30g進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)至硝酸纖維素膜上，用立春紅染色觀察轉(zhuǎn)印效果，然后用含5%脫脂牛奶的Tris緩沖液4℃封閉2h，洗膜后分別加入兔抗鼠TGF-β1（1∶500）、CollagenⅠ（1∶5 000）、p-ERK1/2（1∶2 000）、ERK1/2（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000）進行雜交過夜。再用1∶2 000HRP標記的羊抗兔IgG進行二抗雜交。加入顯色劑顯色并曝光成像。掃描圖像作計算機信號吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差，進一步行兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 12周末時各組大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量 見表1。

表1 12周末時各組大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量的比較

由表1可見，高劑量組及貝那普利組的腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯低于模型組（t=2.933、3.067，均P＜0.01）；低、中、高劑量組、貝那普利組及模型組大鼠體質(zhì)量均低于正常對照組（t=21.869、21.316、20.781、20.883、22.124，均P＜0.01），腎質(zhì)量/體質(zhì)量均高于正常對照組（t=-17.063、-15.875、 -14.812、-14.688、-17.563，均P＜0.01）。

2.2 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學改變 光鏡下所見如圖1，電鏡下所見如圖2。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)變化光鏡下所見（a：低劑量組；b：中劑量組；c：高劑量組；d：貝那普利組；e：模型組；f：正常對照組；Masson染色，×200）

圖2 各組大鼠腎組織電鏡下所見（a：低劑量組；b：中劑量組；c：高劑量組；d：貝那普利組；e：模型組；f：正常對照組，×50 000）

由圖1可見，模型組大鼠腎小球肥大、變形，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，系膜區(qū)明顯增寬，腎小管管腔變窄，上皮細胞腫脹、空泡樣變性，腎間質(zhì)明顯纖維化，亮綠色纖維組織增生，彌漫性淋巴細胞浸潤和成纖維細胞增生及膠原纖維形成。低、中、高劑量組大鼠上述病理改變均有不同程度改善，以高劑量組尤為明顯，腎小球有所減小，基底膜增厚減輕，系膜輕度增生，細胞外基質(zhì)輕度增多，腎小管上皮細胞腫脹、空泡樣變性及間質(zhì)纖維化程度和炎癥細胞浸潤顯著改善。貝那普利組與高劑量組無明顯差別。正常對照組大鼠腎組織形態(tài)正常，腎小球、腎小管間質(zhì)未見異常改變。

由圖2可見，電鏡下模型組大鼠腎臟腎小球顯示不規(guī)則，基底膜彌漫性均勻增厚，系膜區(qū)電子致密物沉積，系膜區(qū)基質(zhì)明顯增多，足突廣泛融合；低、中劑量組腎小球基底膜稍增厚，系膜區(qū)基質(zhì)稍增多，足突少量融合；高劑量組腎小球基底膜厚度尚均勻，未見明顯增厚，足突細胞未見明顯融合；貝那普利組與高劑量組無明顯差別；正常對照組大鼠腎小球正常，基底膜厚度適中，足突細長整齊，無融合。

2.3 各組大鼠生化指標的比較 見表2。

表2 各組大鼠代謝指標的比較

由表2可見，造模4、8、12周時，中、高劑量組、貝那普利組FBG均低于模型組（t=4.244、4.156、2.404，2.338、2.721、2.976，2.528、2.969、2.328，均P＜0.05），模型組的FBG均高于正常對照組（t=-16.671、-14.371、-16.680，均P＜0.01）。造模4周時，高劑量組、貝那普利組大鼠的UAE和Scr水平均明顯低于模型組（t=5.213、2.356，5.574、2.956，P＜0.05或0.01），此外，貝那普利組BUN水平亦低于模型組（t=3.675，P＜0.05），低劑量組、中劑量組上述指標較模型組則無明顯改善（P＞0.05）。模型組的UAE、BUN和Scr水平均高于正常對照組（t=-10.750、-8.669、-3.376，均P＜0.01）。造模8周時，高劑量組、貝那普利組的的UAE、BUN和Scr水平均低于模型組（t= 2.602、2.344、2.557，3.796、2.851、2.607，均P＜0.05），模型組UAE、BUN和Scr水平均高于正常對照組（t=-6.149、-8.387、-3.232，均P＜0.01）。造模12周時，高劑量組、貝那普利組的UAE、BUN和Scr水平均低于模型組（t= 3.360、3.544、4.968，4.809、3.723、5.749，均P＜0.05），中、低劑量組的Scr、中劑量組BUN亦低于模型組（t=4.225、2.980、3.185，均P＜0.05），模型組大鼠UAE、BUN和Scr水平均明顯高于正常對照組（t=-8.054、-10.849、-7.095，均P＜0.01）。

2.5 各組大鼠腎臟TGF-β1、CollagenⅠ、p-ERK1/2蛋白表達的比較 見圖3-5、表3。

圖3 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達（1：正常對照組，2：模型組，3：低劑量組，4：中劑量組，5：高劑量組，6：貝那普利組）

圖4 各組大鼠腎臟CollagenⅠ蛋白的表達（1：正常對照組，2：模型組，3：低劑量組，4：中劑量組，5：高劑量組，6：貝那普利組）

圖5 各組大鼠腎臟p-ERK1/2蛋白的表達（1：正常對照組，2：模型組，3：低劑量組，4：中劑量組，5：高劑量組，6：貝那普利組）

由表3可見，低、中、高劑量組及貝那普利組TGF-β1蛋白水平表達均低于模型組，其中中、高劑量組、貝那普利組更為顯著（t=18.439、24.305、24.154，均P＜0.01），中、高劑量組、貝那普利組的CollagenⅠ、p-ERK1/2蛋白水平表達均低于模型組，其中高劑量組、貝那普利組為顯著（t=15.444、24.278、18.538、26.867，均P＜0.01）；模型組大鼠腎組織TGF-β1、CollagenⅠ、p-ERK1/2蛋白水平表達均明顯高于正常對照組（t=-28.141、-19.447、-30.225，均P＜0.01）。

表3 各組大鼠腎臟TGF-β1、CollagenⅠ、p-ERK1/2蛋白表達量比較

3 討論

糖尿病腎病主要的特征是腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化、蛋白尿以及Scr的升高，腎組織纖維化是糖尿病腎病進展至終末期腎病的病理特征，其發(fā)病機制是由多因素共同作用的結(jié)果，其中以高血糖是最關(guān)鍵的因素，糖代謝紊亂是糖尿病慢性并發(fā)癥包括糖尿病腎病的啟動因素，也是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的基本因素。腎組織系膜外基質(zhì)過度積聚是糖尿病腎病時腎臟形態(tài)學改變的病理基礎(chǔ)，最終可導致腎小球硬化。本研究采用經(jīng)典的STZ誘導糖尿病腎病模型，發(fā)現(xiàn)在造模12周后，大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量增加，生化指標如血糖、24h尿白蛋白定量、BUN及Scr均較正常對照組有不同程度的升高，病理學檢查結(jié)果提示糖尿病腎病模型大鼠腎臟出現(xiàn)了早期糖尿病腎病的病理改變，腎小球體積增大，部分近端腎小管上皮細胞腫脹、空泡樣變性，管腔變窄，腎小球系膜區(qū)擴大，基質(zhì)增多，毛細血管基底膜彌漫性增厚，系膜細胞增生，與以往研究一致[10]。CollagenⅠ是細胞外基質(zhì)的重要組成部分，正常情況下由系膜細胞產(chǎn)生。在病理情況下系膜細胞可表型轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，大量表達CollagenⅠ等細胞外基質(zhì)組成成分。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織CollagenⅠ蛋白表達較正常組明顯增強。

大蒜素為大蒜的主要有效成分，具有廣泛的生物活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對STZ所致糖尿病大鼠胰島具有劑量依賴性的保護作用，可降低糖尿病大鼠的血糖,其作用機制可能與大蒜素能有效改善抗氧化酶活性、提高自由基清除能力、抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大蒜素可顯著降低糖尿病腎病大鼠的血糖，與報道相一致[11]。另有研究報道，大蒜素有抗肺、肝及心肌纖維化作用，主要與其抑制成纖維細胞增殖，抑制促纖維化因子的分泌及減少細胞外基質(zhì)的合成等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素干預12周后，與模型組比較，各不同劑量大蒜素組大鼠的腎質(zhì)量/體質(zhì)量（即腎臟肥大指數(shù)，糖尿病腎病發(fā)生的重要危險因子）有所下降，且UAE、BUN和Scr呈不同程度地降低，腎臟結(jié)構(gòu)有所改善，腎小球體積減小，系膜增生有所緩解，腎小球基底膜增厚程度減輕，腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性等變化的程度較輕，尤以大蒜素高劑量組表現(xiàn)明顯，且與貝那普利組無明顯差異，提示大蒜素對糖尿病腎病大鼠腎損害具有一定的保護作用。

TGF-β1作為公認的關(guān)鍵致纖維化因子，可通過不同信號傳導途徑產(chǎn)生多種重要的生物學效應(yīng)，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮了核心作用[12]。TGF-β1參與細胞外基質(zhì)成分的進行性積聚過程，如刺激細胞外基質(zhì)中膠原、纖維連接蛋白等合成，減少蛋白酶表達和增加蛋白酶抑制合成，上調(diào)細胞外基質(zhì)受體整合素的表達，促進細胞與間質(zhì)黏附和基質(zhì)沉積等。有研究表明，糖尿病大鼠腎小管上皮細胞存在轉(zhuǎn)分化，在腎臟局部過度表達的TGF-β1在腎間質(zhì)纖維化過程中可能發(fā)揮了重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病組大鼠腎組織TGF-β1表達顯著高于正常對照組，提示TGF-β1表達增加可能參與糖尿病腎病的早期發(fā)病機制，其表達水平高低在一定程度上反映糖尿病腎病腎小球硬化和間質(zhì)損害的嚴重程度。與模型組比較，大蒜素干預12周后，大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達下降，且隨著藥物劑量增高，TGF-β1的表達降低越明顯，呈劑量依賴性，且腎臟病理形態(tài)學改變亦有明顯改善，表明大蒜素可能通過下調(diào)TGF-β1的表達減少細胞外基質(zhì)沉積，尿蛋白減少，腎功能得到改善，延緩糖尿病腎病腎臟損害的進程。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是廣泛存在于細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑，由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成。有研究提示，在MAPK家族中，細胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路是細胞信號中傳遞絲裂原信號的關(guān)鍵激酶，與腎臟纖維化密切相關(guān)[14-15]。另有研究表明，無論在糖尿病大鼠模型還是糖尿病患者的腎組織中，ERK的蛋白含量及活性均明顯高于正常對照；腎臟細胞增生、肥大、細胞外基質(zhì)增多等糖尿病腎病的典型病理改變與ERK通路的激活關(guān)系密切[16-17]。本研究提示p-ERK1/2在正常對照組大鼠腎組織僅少量表達，而在模型組大鼠腎組織的表達明顯增加，經(jīng)大蒜素干預后，腎組織p-ERK1/2的表達較模型組明顯減少。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病大鼠模型中，大蒜素對緩解腎臟損害、保護腎臟具有一定的療效，其作用除與降低糖尿病腎病大鼠血糖、改善腎功能、減少尿蛋白有關(guān)外，還下調(diào)腎組織TGF-β1、CollagenⅠ和p-ERK1/2的表達，其作用機制是否與抑制ERK通路有關(guān)還有待進一步研究。

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Renal protective effect of allicin on rats with experimental diabetic nephropathy

HUANG Hong,JIANG Ying,YUAN Fang,et al. Department of Endocrinology,Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

2015-09-07）

（本文編輯：楊麗）

浙江省自然科學基金項目（Y2110918）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2011ZA008）

310013 杭州，浙江醫(yī)院內(nèi)分泌科

吳天鳳，E-mail：wwttffzjyy@126.com