陳義明 余澤珍 周強(qiáng) 李強(qiáng) 池麗芬 易興陽

花生四烯酸細(xì)胞色素P450酶代謝通路基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性研究

陳義明 余澤珍 周強(qiáng) 李強(qiáng) 池麗芬 易興陽

目的 探討花生四烯酸（AA）細(xì)胞色素P450酶（CYP）代謝通路基因多態(tài)性及基因-基因交互作用與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。方法 選擇經(jīng)頭顱CT和/或MRI檢查確診、起病72h內(nèi)入院、首次發(fā)病的腦梗死患者300例為病例組，同期健康體檢者298例為對照組。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS）檢測CYP2C8基因rs17110453、rs1934980，CYP2J2基因rs10889160，CYP4A11基因rs2269231、rs9333025和CYP4F2基因rs3093135的單核苷酸多態(tài)性（SNP），應(yīng)用廣義多因子降維法（GMDR）檢測基因-基因交互作用。結(jié)果 單基因分析發(fā)現(xiàn)，兩組間6個基因位點的基因型分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。GMDR分析發(fā)現(xiàn)，rs17110453和rs9333025兩個基因位點具有交互作用，最優(yōu)模型為rs17110453和rs9333025兩個基因位點聯(lián)合作用模型，交叉檢驗一致性為10/10，符號檢驗為9（P=0.011 2）；交互作用風(fēng)險較大的組合依次為rs17110453CC+ rs9333025GG、rs17110453 CC+rs9333025GG/AG、rs17110453CC+rs9333025AG。多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)調(diào)整年齡、高血壓、糖尿病因素后，rs17110453和rs9333025的高風(fēng)險交互變量與腦梗死發(fā)病風(fēng)險相關(guān)（OR=2.96，95%CI：1.58～8.26，P=0.000）。結(jié)論rs17110453和rs9333025兩基因位點聯(lián)合交互作用可明顯增加腦梗死發(fā)病的風(fēng)險。

花生四烯酸 細(xì)胞色素P450酶 單核苷酸多態(tài)性 腦梗死 相關(guān)性

【 Abstract】 Objective To investigate the association of single nucleotide polymorphisms(SNP)in arachidonic acid(AA) cytochrome P450(CYP)pathway genes with the risk of cerebral infarction(CI). Methods Three hundred patients with CI and 298 health subjects were enrolled in the study.CYP2C8 rs17110453,CYP2C8 rs1934980,CYP2J2 rs10889160,CYP4A11 rs2269231, CYP4A11 rs9333025 and CYP4F2 rs3093135 genes SNP were examined using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)method.Gene-gene interactions were analyzed using generalized multifactor dimensionality reduction(GMDR)methods. Results Single gene variant analysis found that there were no significant differences in genotype distributions between patients and controls.However,GMDR analysis showed a significant gene-gene interaction between rs17110453 and rs9333025 with a score of 10/10 for the cross-validation consistency and 9 for sign test(P=0.0112). Patients with combination of rs17110453CC+rs9333025GG,rs17110453CC+rs9333025GG/AG,rs17110453 CC+rs9333025AG had a significantly higher risk for CI.Logistic regression analysis showed that the high-risk interactive genotypes among rs17110453 and rs9333025 were independent risk factors of CI after adjustment for age,hypertension and diabetes mellitus factors (OR=2.96,95%CI:1.58-8.26,P=0.000). Conclusion The interaction of two gene-loci rs17110453 and rs9333025 significantly increases the risk of CI.

【 Key words】 Arachidonic acid Cytochrome P450 enzyme Single nucleotide polymorphism Cerebral infarction Correlation

腦梗死是由多種病因和發(fā)病機(jī)制構(gòu)成的一組綜合征。即使在良好控制高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙等傳統(tǒng)危險因素的情況下，部分患者仍不可避免發(fā)生或復(fù)發(fā)腦梗死，提示腦梗死的發(fā)病可能與個體的遺傳易感性有關(guān)。花生四烯酸（AA）在細(xì)胞色素P450酶（CYP）代謝通路的代謝產(chǎn)物與腦梗死發(fā)病密切相關(guān)，國內(nèi)外已有較多相關(guān)報道，但研究結(jié)果差異較大[1-10]。而本文通過病例對照來探討中國人群CYP代謝通路基因多態(tài)性以及基因-基因交互作用與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 根據(jù)基因-基因交互作用樣本量計算方法[11]，假設(shè)有基因-基因交互作用者和無交互作用者CI差異率5%，計算出腦梗死患者和對照者各290例能提供80%的檢驗效能。故本研究選擇腦梗死患者300例、對照者298例以滿足該檢驗效能。選擇2012年9月至2014年8月起病、72h內(nèi)入住溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院、首次發(fā)病的腦梗死患者300例為病例組，其中男164例，女136例；年齡40～90（69.12±11.13）歲；均經(jīng)頭顱CT和/或MRI檢查確診；病因?qū)W分型包括動脈粥樣硬化血栓型（AT）和小動脈病變型（SAD）腦梗死[12]；均無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心源性腦栓塞、其他病因的腦梗死、病因不明確的腦梗死患者；（2）既往有卒中史者；（3）伴有其他遺傳病者。選擇同期同一家醫(yī)院健康體檢的志愿者298例為對照組，其中男163例，女135例；年齡40～89（63.89±10.42）歲；經(jīng)病史、體檢及頭部CT檢查證實無顱內(nèi)病變，無腦血管病家族史，無遺傳病史，無血緣關(guān)系。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 危險因素的評估 評估所有研究對象的傳統(tǒng)危險因素，包括既往病史、個人史和常見危險因素（吸煙、酗酒，高血壓、糖尿病、冠心病患病情況，腦卒中史，血常規(guī)、凝血功能、血生化等檢查結(jié)果）。

1.2.2 研究基因位點的選擇 參考國外研究位點，并登錄NCBI數(shù)據(jù)庫最新登記的各基因人類單核苷酸多態(tài)性（SNP，網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP），查找標(biāo)簽SNP（http://www.hapmap.org），設(shè)置最小等位基因頻率（MAP）≥0.05，獲得各基因的標(biāo)簽SNP，即本研究各基因研究的位點。據(jù)此確定以下4個基因6個檢測位點：CYP2C8基因rs17110453，rs1934980；CYP2J2基因rs10889160；CYP4A11基因rs2269231，rs9333025；CYP4F2基因rs3093135。

1.2.3 血標(biāo)本采集與DNA制備 清晨采集空腹靜脈血3ml，EDTA抗凝，分離血漿。采用Axyprep-96全血基因組DNA試劑盒（美國AXYGEN公司）提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，標(biāo)化DNA濃度值為5mg/L，-80℃保存。

表1 每個SNP基因型的擴(kuò)增和延長引物

1.2.4 CYP代謝通路調(diào)控基因SNP檢測 委托上海生工生物工程股份有限公司，采用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）檢測技術(shù)[13]（美國Sequenom公司）對上述4個基因6個位點SNP進(jìn)行檢測分型。通過PCR擴(kuò)增第1個靶序列，然后加入特異性延伸產(chǎn)物將擴(kuò)增的片段SNP連接。參照基因文庫GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/），利用Mass ARRAY Assay Design 2.0軟件（美國Sequenom公司），選擇每個基因上符合條件的SNP設(shè)計多重PCR引物（美國Sequenom公司），見表1。檢測步驟包括多重PCR擴(kuò)增、堿性磷酸酶純化、延伸反應(yīng)、樹脂純化、點樣芯片和質(zhì)譜檢測；此外，對部分基因位點的PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測與鑒定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。基因頻率采用基因計數(shù)法，用χ2擬合優(yōu)度檢驗Hardy-Weinberg平衡，病例組與對照者等位基因和基因型的頻率分布比較采用χ2檢驗；計量資料用表示，組間比較采用t檢驗。應(yīng)用廣義多因子降維法（GMDR）Beta V 0.7軟件計算基因-基因交互作用與腦梗死的相關(guān)性[13]；采用多因素logistic回歸調(diào)整傳統(tǒng)危險因素的影響，計算基因-基因交互作用、等位基因和基因型與腦梗死發(fā)病的相對風(fēng)險率，用OR值及95%CI表示。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組危險因素比較 病例組高血壓、糖尿病患病率為75.0%、35.6%，分別高于對照組的28.3%、27.5%（均P＜0.05）。兩組高脂血癥患病率、吸煙發(fā)生率、酗酒發(fā)生率分別為19.0%、43.3%、43.3%和 23.8%、40.3%、43.0%，兩組TC、LDL-C、HDL-C和TG分別為（4.879±1.655）、（3.046±1.329）、（1.168±0.660）、（1.794±1.102）mmol/L和（4.893±1.032）、（2.947±0.484）、（1.848±1.107）mmol/L，兩組PLT分別為（190.2±162.3）× 109/L和（197.7±54.2）×109/L，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 病例組與對照組基因型分布的比較 兩組中6個基因位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。等位基因與基因型的觀察值、期望值吻合良好。單個基因分析發(fā)現(xiàn)，兩組間6個基因位點各基因型比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。分層分析發(fā)現(xiàn)，6個基因位點各基因型在不同病因?qū)W分型，不同年齡分組（65歲為界），有無高血壓、糖尿病方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 病例組和對照組基因型分布的比較[例（%）]

2.3 基因-基因交互作用與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性 用GMDR分析基因-基因交互作用與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性，最優(yōu)模型為rs17110453和rs9333025兩個基因位點聯(lián)合作用模型，交叉檢驗一致性為10/10，符號檢驗為9（P=0.011 2），見表3。

表3 基因-基因交互作用與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性的GMDR模型分析

用GMDR得出最優(yōu)模型后，再用logistic回歸評估rs17110453和rs9333025兩個基因位點9種基因型組合與腦梗死發(fā)病的相對風(fēng)險。結(jié)果表明交互作用風(fēng)險較大的組合依次為rs17110453CC+rs9333025GG、 rs17110453CC+rs9333025GG/AG、rs17110453CC+ rs9333025AG，見表4。

2.4 影響腦梗死發(fā)病的多因素logistic回歸分析 根據(jù)表4結(jié)果，將rs17110453和rs9333025兩個基因位點9種基因型組合設(shè)為交互變量，分為高危、低危2類（高危=1，低危=0）。調(diào)整年齡、高血壓、糖尿病因素后，多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示rs17110453和rs9333025的高風(fēng)險交互變量與腦梗死發(fā)病風(fēng)險呈正相關(guān)（OR= 2.96，95%CI：1.58～8.26，P=0.000），見表5。

表4 rs17110453和rs9333025各種基因型組合與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性

3 討論

AA是人體內(nèi)多種重要心腦血管活性物質(zhì)的前體，AA代謝產(chǎn)物與腦梗死發(fā)病密切相關(guān)[1]。國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)論差異較大：國內(nèi)學(xué)者Yi等[13]通過對CYP代謝通路10個基因位點進(jìn)行研究，未發(fā)現(xiàn)單個基因位點多態(tài)性與腦梗死發(fā)病風(fēng)險相關(guān)；日本Fu等[2，5]研究結(jié)果表明CYP4F2基因rs3093135多態(tài)性與腦梗死發(fā)病無相關(guān)性，但CYP4A11基因rs9333025的GG基因型與日本男性腦梗死發(fā)病的風(fēng)險有關(guān)；Fava等[3]研究表明瑞典人群CYP4A11基因F434S和 CYP4F2基因V433M的SNP是獨立于高血壓外、與男性腦梗死發(fā)病相關(guān)的危險因素。Ding等[4]發(fā)現(xiàn)CYP4F2基因V433M會增加男性缺血性中風(fēng)的發(fā)病率；Fava等[6]研究發(fā)現(xiàn)瑞典人群CYP2J2基因50G＞T（rs890293）與腦缺血性事件無明顯相關(guān)性；美國Marciante等[7]研究發(fā)現(xiàn)CYP2J2基因rs10889160、rs11572325與腦梗死發(fā)病無關(guān)；Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)中國漢族人群的CYP2J2-50T等位基因與腦缺血性事件無明顯相關(guān)性；Kaur-Knudsen等[9]、Chi等[10]研究顯示 CYP2C9（*）2（rs1799853）、CYP2C9（*）3（rs1057910）和CYP2C8基因多態(tài)性與缺血性心腦血管病發(fā)病無相關(guān)性。造成以上研究結(jié)果差異較大的原因可能如下：（1）研究對象的種族和納入標(biāo)準(zhǔn)不同、樣本量不一、研究基因位點少等；（2）腦梗死是多基因遺傳的復(fù)雜疾病，并不遵從孟德爾遺傳模式，單個基因效應(yīng)微弱或不顯示效應(yīng)，因此單基因連鎖分析對多基因遺傳的疾病進(jìn)行研究并不適合[13]。

本研究對病例組與對照組CYP代謝通路4個基因6個位點的多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組間6個基因位點的基因型分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，即未發(fā)現(xiàn)單個基因位點與腦梗死發(fā)病風(fēng)險獨立相關(guān)。GMDR分析發(fā)現(xiàn)這6個基因位點間存在交互作用，最優(yōu)模型為rs17110453和rs9333025兩個基因位點聯(lián)合作用模型，rs17110453和rs9333025的高風(fēng)險交互與腦梗死發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，OR=2.96，95%CI：1.58～2.96。

目前就rs17110453和rs9333025兩個基因位點交互作用會增加腦梗死發(fā)病風(fēng)險的機(jī)制尚未清楚，可能與這兩個基因位點以相互拮抗的方式調(diào)控AA代謝有關(guān)。rs17110453編碼CYP2C8酶的活性，CYP2C8作為一種CYP表氧化酶，能夠轉(zhuǎn)化AA生成環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）[13]，而EETs具有舒張血管、調(diào)節(jié)離子通道、抗血小板集聚、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用，EETs再經(jīng)可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH）作用下水解生成生物活性較弱的二羥基二十碳三烯酸（DHETs）。rs9333025編碼CYP4A11的活性，CYP4A11作為一種CYP羥化酶，能夠轉(zhuǎn)化AA生成19-羥基二十碳四烯酸（HETEs）和20-HETEs發(fā)病風(fēng)險，HETEs具有縮血管、損傷血管內(nèi)皮功能、促動脈粥樣硬化等作用[12,14]。因此，rs17110453和rs9333025兩個基因位點交互作用可使循環(huán)中EETs水平降低和HETEs水平增高，AA代謝的動態(tài)平衡破壞，交互作用下可能導(dǎo)致動脈粥樣病變，進(jìn)而增加腦梗死發(fā)病風(fēng)險[12]。

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Association ofpolymorphismsin arachidonic acid cytochrome P450 metabolic pathway geneswith susceptibility ofcerebral infarction

CHEN Yiming，YU Zezhen，ZHOU Qiang，et al.Department of General Internal Medicine,the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325200，China

2016-01-10）

（本文編輯：陳丹）

325200 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普內(nèi)科（陳義明），體檢中心（余澤珍），神經(jīng)內(nèi)科（周強(qiáng)、池麗芬），檢驗科（李強(qiáng)）；四川省德陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（易興陽）

陳義明，E-mail：chenym579@163.com