隋 心，張榮濤 ，楊立賓 ，李夢莎 ，許 楠 ，劉贏男 ，柴春榮 ，王繼豐，付曉玲，鐘海秀，倪紅偉

（1.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學院 自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

應用 PLFA 技術分析氮沉降對三江平原小葉章濕地土壤微生物群落結構的影響

隋 心1,2，張榮濤2，楊立賓2，李夢莎2，許 楠2，劉贏男2，柴春榮2，王繼豐2，付曉玲2，鐘海秀2，倪紅偉2

（1.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學院 自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

為了研究氮沉降對三江濕地土壤微生物群落結構的影響，利用磷脂脂肪酸技術(PLFA)對三江平原小葉章濕地土壤微生物多樣性進行了分析。2010年5月，在黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所三江平原濕地生態(tài)定位研究站內的小葉章濕地中建立模擬氮沉降試驗平臺，設置3個氮沉降濃度梯度：N1(0 g N·m-2a-1)、N2(4 g N·m-2a-1)、N3(8 g N·m-2a-1)，于2014年6月用土鉆進行土壤樣品采集。結果表明：本研究共檢測到 PLFAs 75種，其中特征脂肪酸 29 種。不同氮沉降處理下，真菌群落的生物量較高，土壤微生物生物量的總量介于30～33 nmol·g-1。氮沉降增加對真菌群落數(shù)量的影響比較顯著（P＜0.05），但是對細菌和放線菌影響并不顯著。低氮時土壤微生物的數(shù)量最多，對照最低；高氮時土壤微生物群落的多樣性值和豐度值最高。根據(jù)典型性相關分析，得出銨態(tài)氮和硝態(tài)氮對土壤中真菌含量影響較為顯著。通過本研究可以得出，施氮增加了土壤微生物總量。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是影響土壤微生物數(shù)量的主要因子，低氮增加了土壤微生物多樣性，高氮則產生抑制作用。

氮沉降；磷脂脂肪酸；小葉章濕地；微生物多樣性

近半個世紀以來，隨著大量化石燃料的燃燒所導致的大氣氮沉降已經成為全球變化重要的現(xiàn)象之一，大氣氮沉降的增加給整個陸地生態(tài)系統(tǒng)的結構、功能以及生物地球化學循環(huán)都產生了重要的影響[1]。我國由于工業(yè)發(fā)展的需要以及農業(yè)氮肥的過量使用，使得氮沉降增加非常迅速，已經成為世界第三大氮沉降區(qū)，而且氮沉降逐漸從東南向西北開始蔓延，這給我國整個生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴重的影響[2-3]。三江平原濕地位于我國東北地區(qū)，是我國面積最大、分布最為集中的淡水濕地[4]，對維持該地區(qū)的氣候具有重要的作用，同時該地區(qū)也是氮沉降比較敏感的地區(qū)之一，由于農業(yè)上大量氮肥的使用，造成了濕地氮沉降量的顯著增加，給濕地生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能都產生了一定的影響[5-6]。

土壤微生物是地下生態(tài)系統(tǒng)的最為重要組成部分[7]，在凋落物的分解、營養(yǎng)元素的循環(huán)過程中具有重要的作用[8-9]，同時也對維持生態(tài)系統(tǒng)功能和穩(wěn)定上發(fā)揮著重要的作用[10]。目前關于大氣氮沉降對三江平原濕地生態(tài)系統(tǒng)的影響已經做了大量的研究，如植物生物量的變化[11]、植物生理生態(tài)[12]和營養(yǎng)物質循環(huán)等方面[13]，而有關氮沉降對三江平原小葉章Deyeuxia angustifolia濕地土壤微生物群落結構的研究還缺乏深入研究。

近年來，隨著生物學技術的快速發(fā)展，越來越多的新方法、新技術運用到微生物學的研究領域，使得我們可以很好的對土壤微生物進行深入的研究。例如末端限制性片段長度多樣性技術（T-RFLP）、磷脂脂肪酸技術(Phospholipid fatty acid，PLFA)、 宏 基 因 組 技 術 (Microbial Environmental Genome)等。磷脂脂肪酸是微生物細胞膜的一種主要成分，存在與所有的活體微生物之中，并且隨著細胞的死亡而迅速分解，所以不同樣品中土壤微生物中的磷脂脂肪酸的組成和含量是不同的[14]。所以，利用磷脂脂肪酸技術可以非常準確、定量的檢測出微生物群落結構組成和多樣性變化。因此，本研究利用黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所三江平原濕地生態(tài)定位研究站內的模擬氮沉降研究平臺，利用磷脂脂肪酸技術研究模擬氮沉降條件下，研究三江平原小葉章濕地土壤微生物多樣性的變化，為三江平原濕地生態(tài)系統(tǒng)在氮沉降背景下的變化提供科學依據(jù)，并為三江平原濕地的管理與保護提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究樣點設置在黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所三江平原濕地生態(tài)定位研究站－洪河國家級自然保護區(qū)內（圖1）。研究區(qū)域海拔55～65 m，多年平均氣溫1.9℃，≥10℃有效積溫2 165～2 624 ℃。年平均降水量為550～600 mm，50%～70%集中在6～9月份，無霜期125 d左右。主要植被類型為草甸和沼澤，優(yōu)勢植物有小葉章、狹葉甜茅Glyceriaspiculosa、毛果苔草Carexlasiocapa、漂筏苔草Carexpseudocuraica等[15]。

1.2 樣品采集

2010 年5 月在小葉章沼澤化草甸濕地設置9塊20 m×20 m的樣地，進行3種處理：對照組：N1（0 g N·m-2a-1）、低氮組：N2 (4 g N·m-2a-1) 和高氮組：N3 (8 g N·m-2a-1)，每種處理重復3次。每年5月份進行施氮處理，將NH4NO3溶于水，用花灑均勻噴施。于2014年6月采樣土壤樣品，土壤樣品為混合土樣，用直徑為4 cm的土鉆按混合采樣法采集0～20 cm 土層，每個土樣由5～10 個采集點的土壤混合，用四分法取適量于土袋中，迅速帶回實驗室。去除土樣中的植物和動物殘體等雜質，混合均勻后一部分保存在-80 ℃冰箱，用于分析土壤微生物群落結構。另一部分風干、磨細過100目篩，用于測定土壤理化性質。

1.3 土壤理化性質檢測

土壤pH測定的水土比為2.5∶1；土壤含水率采用烘干法測定；土壤有機碳利用碳氮分析儀測定（耶拿-2100S，德國）；土壤中全氮采用半微量凱氏定氮法測定；硝態(tài)氮采用酚二磺酸比色法測定；銨態(tài)氮采用氯化鉀浸提－靛酚藍比色法測定。

圖1 實驗區(qū)位置-洪河國家級自然保護區(qū)Fig. 1 Location of sampling sites in the Sanjiang plain-Honghe national nature reserve

1.4 磷脂脂肪酸檢測

磷脂脂肪酸的檢測采用氫氧化鉀－甲醇溶液甲酯化法來完成[16]，以十九烷酸為內標，在Agilent 6850 氣象色譜中檢測，采用Sherlock MIS 4.5 系統(tǒng)分析土壤樣品中的PLFA圖譜中磷脂脂肪酸的成分。每種脂肪酸的濃度基于碳內標19:0 的濃度來計算，脂肪酸濃度用nmol·g-1干土表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

土壤真菌量細菌量和革蘭氏陽性菌含量、革蘭氏陰性菌含量、放線菌含量和原生動物含量等特征脂肪酸參照已發(fā)表文獻[17-19]。然后后對樣品中PLFAs 含量按照下列公式進行計算[20]：

式（1）中：N代表為脂肪酸含量 (nmol·g-1)，Response為生物標記的響應值，19∶0為內標物c19∶0 ( ng·μL-1)，F(xiàn)AME為脂肪酸甲酯的摩爾質量(g·mol-1)，溶樣體積單位μL，樣品干質量單位g。

使用SPSS17.0計算單因素方差分析，顯著性為α=0.05，Shannon-Wiener多樣性指數(shù) (H)、Simpson多樣性指數(shù)(D)、豐度(S)、均勻度(J)采用excel進行計算，繪圖采用SigmaPlot軟件。

2 結果與分析

2.1 模擬氮沉降條件下土壤理化性質的變化特征

模擬氮沉降樣地的土壤理化性質分析結果見表2，樣地的土壤類型主要為草甸土，且不同樣地的pH值存顯著性差異（P＜0.05），其中高氮樣地的pH均值最低。不同樣地土壤的有機碳、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮存在顯著的差異（P＜0.05）。有機碳、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮呈現(xiàn)出隨著氮沉降的增加而升高的趨勢。

表2 模擬氮沉降條件下的土壤理化性質的比較?Table 2 The physical and chemical properties under different nitrogen concentration conditions

2.2 各處理對土壤微生物總生物量的影響

土壤微生物群落的生物量和結構可以利用土壤中磷脂脂肪酸的組成來表示，并且脂肪酸含量的高低可以反應出土壤微生物生物量的多少[21-22]。本研究中一共檢測出磷脂脂肪酸75種，其中特征微生物29種，C鏈長度11～24，包括了不同脂肪譜類型的特征微生物（表3）。

表3 不同氮沉降下土壤微生物特征磷脂脂肪酸標記分析?Table 3 Analysis of PLFA biomarkers in soil of different nitrogen deposition treatments

通過對3個氮沉降處理的PLFA分析可以看出，不同氮處理處理條件下，土壤微生物生物量的范圍為30～33 nmol·g-1（圖2）。氮沉降增加后，土壤中PLFA總量顯著升高，隨著氮沉降量的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在低氮處理達到最大值，高于對照處理8.89%。不同氮沉降濃度下革蘭氏陰性菌與PLFA總量變化趨勢相同，但革蘭氏陽性菌與PLFA總量變化趨勢不同，但變化幅度均略小。

圖2 不同氮沉降處理土壤微生物總的PLFA含量Fig.2 PLFA contents in different nitrogen deposition treatments

2.3 不同氮沉降條件下土壤細菌、真菌和放線菌含量變化

不同氮沉降條件下土壤細菌、真菌、放線菌的含量變化是不同的（圖3）。由圖2a可見，不同氮沉降濃度條件下土壤細菌含量差異不顯著。其中，低氮處理和高氮處理均低于對照樣地。隨著施氮量的增加，其變化趨勢為逐漸降低，在對照時達到最大值，高氮處理時最低，低氮處理比對照小5.71%，高氮處理比對照小10.05%。圖2b表明，不同氮沉降濃度見土壤真菌含量差異顯著。其中，各處理均高于對照樣地。隨著氮沉降的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在低氮處理時達到最大值，高于對照處理50.66%。圖2c表明，不同氮沉降條件下土壤中放線菌含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但差異不顯著。在低氮時達到最大值，高于對照3.43%，在高氮處理時達到最小值，低于對照8.93%。

2.4 不同處理對土壤微生物群落結構的影響

通過對PLFA的特征脂肪酸進行分析，可以得出不同氮沉降處理間的多樣性指數(shù)并不相同（表4）。低氮處理時，土壤微生物群落多樣性指數(shù)最高（Shannon指數(shù)和Simpson分別為2.325 9和0.480 8），微生物群落的豐富度為90，均勻度為0.988 2。所以，低氮處理時更利于微生物的生長，微生物多樣性較高，而高氮處理時，多樣性指數(shù)最低。

圖3 不同氮處理土壤中細菌(a)、真菌(b)和放線菌(c)的PLFA含量Fig.3 The PLFA content of bacteria (a), fungi (b) and actinomyces (c) in soil of different nitrogen treatments

表4 不同氮沉降處理下土壤微生物PLFA多樣性指數(shù)Table 4 Diversity indices of PLFA in soil of different nitrogen deposition

典型性相關分析可以很好的用來解釋環(huán)境因子對微生物群落結構的影響，U代表環(huán)境變量的標準化變量，V代表群落結構生物量的標準化變量。如表5所示，將U和V進行Bartlett的χ2檢驗，從獲得的4組相關系數(shù)來看，在α= 0.05時，第1組和第2組相關系數(shù)均小于0.05，第1組小于0.01，所以可以看出，前2組的典型相關系數(shù)是極顯著和顯著的。

表5 典型變量相關系數(shù)和顯著性檢驗Table 5 Canonical correlation coefficient and significant test

由表6 可知環(huán)境變量的典型變量相關系數(shù)。U1=0.148×pH值－0.357×有機碳含量＋0.207總氮含量－1.183×銨態(tài)氮含量＋2.397×硝態(tài)氮含量，由此可知，影響U1的主要因子為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。U2=0.461×pH值－2.091×有機碳含量－0.684總氮含量－4.396×銨態(tài)氮含量＋7.004×硝態(tài)氮含量，從上述方程可知U2的主要影響因子也為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。表7為微生物群落結構因子的典型變量，V1=-0.224×微生物總量－0.538×細菌含量＋0.878×真菌含量－0.377×放線菌含量，V1的主要代表因子為真菌；V2=0.887×微生物總量＋0.378×細菌含量－1.534×真菌含量＋0.198×放線菌含量，即V2的主要因子為真菌。

所以，根據(jù)U和V的典型相關關系分析得出，土壤銨態(tài)氮含量和硝態(tài)氮含量對微生物群落中真菌含量影響比較顯著。N沉降對土壤微生物群落中真菌的影響最大，細菌次之，放線菌最小。

表6 典型變量U與原始標準化變量X的相關系數(shù)Table 6 Canonical correlation coefficient and significant test

表7 典型變量V與原始標準化變量Y的相關系數(shù)Table 7 Canonical correlation coefficient and significant test

3 討 論

氮沉降增加會改變土壤微生物生物量和微生物群落結構。本研究表明，PLFAs表征的細菌生物量和放線菌生物量隨著氮沉降的增加并無顯著變化，但是對于真菌來看，施氮顯著增加了真菌生物量。施氮對微生物PLFAs總量影響比較顯著，但是對革蘭氏陰性菌和陽性菌的影響并不顯著。許多研究表明：在不同的生態(tài)系統(tǒng)中，施氮對土壤微生物的影響是不同的。例如，施瑤等[23]對內蒙古草原土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，氮添加會土壤微生物總量和細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量，但是真菌卻增加并不顯著；薛璟花等[24]在熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)中研究發(fā)現(xiàn)，氮沉降增加會增加細菌和放線菌生物量，但是會對真菌生物量產生明顯的抑制作用。但是也有研究表明氮沉降的增加會抑制細菌的生長[25]。而本研究的結果先發(fā)現(xiàn)，氮增加顯著增加了土壤真菌的含量，但是對細菌和放線菌的影響并不顯著。這可能是因為在三江濕地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤真菌屬于異養(yǎng)型微生物，利用土壤有機碳作為碳源，當對小葉章濕地進行施氮后，土壤有機碳增加，pH值下降，土壤真菌分泌物含量增加，從而引起真菌生物量增加或者群落發(fā)生改變，這與Smolander的研究結果是一致的[26]。但是對于不同生態(tài)系統(tǒng)和生境中，微生物生物量對氮沉降的響應是不同的和復雜的，這可能與土壤性質、溫濕度、氣候條件、地上植被組成以及凋落物性質等緊密相關，但是對其具體的影響機理和規(guī)律仍需要進一步的研究。

多樣性指數(shù)由物種豐富度和均與度兩部分組成，多樣性指數(shù)的高低表示土壤微生物群落多樣性的高低，是一種分析土壤微生物群落結構十分有效的方法[27-28]。本研究結果表明，不同氮沉降條件下土壤微生物的群落結構發(fā)生了顯著的變化，Shannon指數(shù)呈現(xiàn)出N2＞N3＞N1的趨勢（表2），可見，氮沉降會改變土壤微生物的多樣性，低氮較高，高氮略有下降，說明氮沉降增加微生物多樣性具有閾值限制性，即氮濃度增加到一定閾值時，微生物多樣性則由升高轉變?yōu)橄陆?。這可能是由于氮沉降增加了土壤中的營養(yǎng)物質，為微生物的生長提供了豐富的營養(yǎng)來源，因此，一定濃度的氮素會促進細菌的生長，這和劉彩霞等[29]的研究結果是一致的。但是在高氮水平下，氮增加改變了土壤中營養(yǎng)物質的有效性，這導致了某些微生物種群（如偏于利用植物殘體的種群）的生長，但是同時又抑制了其他種群，致使群落多樣性指數(shù)的下降?？偟膩碚f，氮沉降會對土壤微生物的群落結構具有一定促進作用。由此可以推斷，長期的高氮沉降必勢會對三江平原濕地土壤微生物群落產生深遠影響。

濕地由于其生態(tài)環(huán)境的特殊性，越來越受到科學家的重視。近年來，有關氮沉降對三江平原濕地生態(tài)系統(tǒng)的影響也做了大量而且深入的研究。例如模擬大氣氮沉降條件下，小葉章生物量及分配的變化[30]，氮素循環(huán)以及分配[31]、不同形式氮的季節(jié)性變化特征等[32]。而本研究更加深入的揭示了氮沉降條件下三江平原濕地土壤微生物數(shù)量、結構組成以及多樣性的變化規(guī)律，這更進一步豐富了大氣氮沉降條件下三江平原濕地土壤微生物生態(tài)學領域的研究。此外，本研究雖然利用PFLA技術對模擬氮沉降條件下土壤微生物數(shù)量和多樣性進行了研究，但是這種方法也存在著一些不足之處：（1）目前還不能確定所有特征脂肪酸和特定微生物或微生物群落的對應關系。（2）PLFA不能在種屬水平上進行鑒定。所以為了克服該方法的缺點，更加準確地獲取微生物結構功能方面的信息，未來需要采用多種技術相結合的方法，如利用高通量測序技術，biolog技術與PLFA技術想結合，從種屬水平，微生物活性水平和微生物量水平多角度進行分析，這樣就可以比較清楚的了解氮沉降對三江平原小葉章濕地土壤微生物群落結構、功能、數(shù)量的影響。

4 結 論

（1）研究表明，在3個氮沉降處理中單不飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸含量較低，多不飽和脂肪酸為優(yōu)勢脂肪酸類群，即各處理土壤中微生物群落結構中真核微生物為主要類群，真菌為其群落結構中的優(yōu)勢菌群，原核微生物所占比例較小。

（2）不同氮濃度條件下，土壤中PLFA 總的脂肪酸含量均高于對照樣地，但是，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌脂肪酸含量與對照樣地差異不大。細菌隨著施氮量的增加呈現(xiàn)下降趨勢，真菌和放線菌呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，低氮時最高，而原生動物隨著施氮量的增加而逐漸增加。根據(jù)典型性相關分析可知，土壤銨態(tài)氮含量和硝態(tài)氮含量對微生物群落中真菌含量影響比較顯著。

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Study on microbial diversity of Deyeuxiaangustifolia wetland under the simulation nitrogen depositions with the PLFA method in Sanjiang plain

SUI Xin1,2, ZHANG Rong-tao2, YANG Li-bin2, LI Meng-sha2, XU Nan2, LIU Ying-nan2, CHAI Chun-rong2,
WANG Ji-feng2, FU Xiao-ling2, ZHONG Hai-xiu2, NI Hong-wei2
(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China; 2. National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation Institute of Nature & Ecology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150040,Heilongjiang, China)

In order to understand the effects of nitrogen deposition on soil microbial community, this study analyzed the microbial diversity in Sanjiang Plain wetland by using the phospholipids fatty acids (PLFA) biomarkers. In May 2010, nitrogen deposition plat was established in the Sanjiang Plain fi eld experiment station of the institute of Nature & ecology, Heilongjiang Academy of Sciences.Nitrogen loadings were designed at 3 levels such as N1, N2, N3 at the doses of 0，4 and 8 g N·m-2a-1, respectively. After four years treatment, soil samples were collected with a soil drill. The result showed that a total of 75 PLFAs were detected，and among them the characteristic fatty acids were 29 kinds.The analysis on type and content of the characteristic fatty acids indicated that eucaryon microorganism was the predominant group in the plot soil treated with all nitrogen treatments.In different nitrogen treatment plots, the range of soil microbial biomass with characteristics of total PLFAs content was 30 ～ 33 nmol·g-1. The amount of fungus were signi fi cant different (P＜0.05) and the amount of bacteria were not (P＞0.05) in different nitrogen deposition treatments. In the low nitrogen deposition treatment, the PLFAs of soil microorganisms had the highest quantity and diversity, but in the high nitrogen deposition treatment the PLFAs of soil microorganisms had the lowest quantity and diversity. According to the Canonical Correlations, ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in soil were positively correlated with the fungus. In conclusion, adding nitrogen will promote the growth of microorganisms, lowest nitrogen treatment is highest and control is the lowest. Ammonium nitrogen and nitrate nitrogen were main factors in fl uence the amount of soil microorganism, which low nitrogen would promote soil microbial diversity and high nitrogen would restrain the soil microbial diversity.

nitrogen deposition; phospholipid fatty acids;Deyeuxiaangustifoliawetland; microbial diversity

S718.52+1.3

A

1673-923X(2016)12-0091-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.016

http: //qks.csuft.edu.cn

2016-02-21

國家自然科學基金項目（31470019，31400429，31500410）；十三五國家重點研發(fā)計劃（2016YFC0500405）；黑龍江省科學院項目（STJB16-01，STJB16-04，2015YZ01，2014ST05）；黑龍江省博士后基金（LBH-Z14184）；黑龍江省科研機構創(chuàng)新能力提升專項計劃（GY2014KC0039）；黑龍江省科學院青年創(chuàng)新基金資助

隋 心，副研究員，博士

倪紅偉，研究員，博士；E-mail：nihongwei2000@163.com

隋 心，張榮濤，楊立賓，等.應用PLFA 技術分析氮沉降對三江平原小葉章濕地土壤微生物群落結構的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016, 36(12): 91-97.

[本文編校：文鳳鳴]