王湘南，陳永忠，王 瑞，陳隆升，彭邵鋒，馬 力，羅 健，唐 煒

（湖南省林業(yè)科學(xué)院 國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

不同種源油茶良種花粉生活力研究

王湘南，陳永忠，王 瑞，陳隆升，彭邵鋒，馬 力，羅 健，唐 煒

（湖南省林業(yè)科學(xué)院 國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

采用TTC法和瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)法對(duì)來(lái)自湖南、江西、廣西種源的油茶主栽良種進(jìn)行了花粉生活力和萌發(fā)力的測(cè)定。結(jié)果表明：（1）油茶不同種源良種之間花粉生活力存在較大差異，本實(shí)驗(yàn)良種中的花粉生活力較高，花粉活力值范圍在87.51%～66.98%之間，花粉萌發(fā)力值范圍在87.91%～70.47%之間，顯示了良種的優(yōu)良特性；（2）湖南種源油茶良種花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基為1%瓊脂+10%蔗糖+0.015%硼酸，江西和廣西種源的良種通過(guò)調(diào)整蔗糖和硼酸濃度可使花粉萌發(fā)達(dá)最佳。采用TTC法和瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)法同時(shí)檢測(cè)花粉生活力可以相互校驗(yàn)；（3）花粉生活力大小與品種內(nèi)在遺傳特性有關(guān)，也與立地和氣候有一定關(guān)系。

油茶；良種；花粉；培養(yǎng)基；花粉生活力；萌發(fā)力

油茶Camellia oleifera屬灌木或喬木[1-2]，是我國(guó)南方重要木本油料樹(shù)種之一，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南的大部分地區(qū)[3-4]，其主要產(chǎn)品油茶籽油營(yíng)養(yǎng)豐富，油酸、亞油酸含量高達(dá)90%，是一種優(yōu)質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)、保健的高級(jí)植物食用油[4-9]。其副產(chǎn)物茶粕、果殼等經(jīng)加工也是重要的醫(yī)藥、化工等工業(yè)原料[10-14]。油茶生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，生命周期長(zhǎng)，秋冬開(kāi)花來(lái)年秋冬果熟，常花果同期，這是油茶植物生殖過(guò)程的一大特征。油茶品種花粉生活力關(guān)系到油茶授粉受精以及品種配置，直接影響到油茶產(chǎn)量和效益，因此了解和掌握油茶不同品種間的花粉生活力對(duì)充分了解其品種特性、提高油茶授粉坐果率從而提高油茶產(chǎn)量具有重要指導(dǎo)作用。

花粉是植物遺傳信息的載體和遺傳信息交流的工具?；ǚ凵盍κ求w現(xiàn)其具備萌發(fā)和受精能力的指標(biāo)之一[15]?；ǚ凵盍σ蛑参锓N類不同而差異很大。在自然條件下，大多數(shù)植物的花粉從花藥散出后只能存活幾小時(shí)，幾天或幾個(gè)星期。一般木本植物花粉壽命比草本植物的長(zhǎng)[16]?；ǚ劬哂忻劝l(fā)活力，這是完成受精的必要條件[17]。有關(guān)油茶品種花粉生活力報(bào)道不多，李開(kāi)祥等[18]報(bào)道油茶岑軟2、3號(hào)等8個(gè)無(wú)性系在開(kāi)花當(dāng)天花粉生活力均達(dá)50%以上，其中岑軟2、3號(hào)是來(lái)自廣西北回歸線以南種源地最主要的良種。王湘南[19]所測(cè)定的30個(gè)不同種源油茶種質(zhì)的花粉生活力在38.51%～91.85%之間，雄性不育系除外僅為0～0.4%。王玉娟等[20]測(cè)定油茶贛無(wú)26個(gè)無(wú)性系花粉活力在45.87%～93.16%之間。全國(guó)油茶無(wú)性系良種有200余個(gè)，分布區(qū)域范圍廣，不同立地與氣候?qū)τ筒璧拈_(kāi)花授粉、花粉生活力會(huì)產(chǎn)生一定影響。本實(shí)驗(yàn)以湖南、江西、廣西3省不同種源優(yōu)良品種為材料，在相同立地條件下同時(shí)對(duì)它們進(jìn)行花粉活力及萌發(fā)力檢測(cè)比較，掌握眾多油茶良種中尤其是不同種源地的油茶良種其花粉活力的特性，為油茶的良種篩選及品種配置、提高油茶授粉坐果率等生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題提供科學(xué)的分析測(cè)試數(shù)據(jù)及指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 取樣地概況

試驗(yàn)材料取自湖南省林科院試驗(yàn)林場(chǎng)國(guó)家級(jí)油茶種質(zhì)資源收集保存圃。資源圃位于長(zhǎng)沙市南郊，地理位置東經(jīng) 113°01′E，北緯 28°06′N，海拔高度100 m左右。土壤為第四紀(jì)酸性紅壤，土層厚度60～100 cm，有機(jī)質(zhì)含量1.61%，pH值4.84。氣候?qū)僦衼啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，四季分明，夏秋高溫常旱，全年無(wú)霜期約275 d，年平均氣溫16.8～17.2 ℃，年降水量1 422 mm。

1.1.2 供試材料

供試種源材料分別來(lái)自湖南、江西、廣西三省生產(chǎn)上主推應(yīng)用的良種“湘林”系列、“贛無(wú)”系列和“岑軟”及“桂無(wú)”系列共9個(gè)品種，分別是湖南的湘林1、湘林27、湘林97，江西的贛興46、贛石83-4、贛永6，廣西的岑軟2、岑軟3和桂無(wú)2。為了研究其樹(shù)齡與花粉活力的關(guān)系，采樣植株分為中幼林與換冠嫁接大樹(shù)成林。⑴中幼林樹(shù)：2006年春以1～2年生無(wú)性系嫁接苗和實(shí)生家系苗造林的植株，2010年底平均樹(shù)高2.0 m，平均冠幅2.8 m2；⑵成林樹(shù)：2004年通過(guò)大樹(shù)高接換冠的換冠林植株，樹(shù)冠完全恢復(fù)，2010年底平均樹(shù)高2.7 m，平均冠幅4.3 m2。2011年以后每年進(jìn)行適當(dāng)輕度修剪，其它按照油茶正常撫育管理水平進(jìn)行管理。

1.2 研究方法

1.2.1 花粉采集與預(yù)處理

花粉樣品于每年油茶花期的11月下旬至1月上旬連續(xù)5次采集，不同年份重復(fù)對(duì)比。采集時(shí)間段為當(dāng)日上午11:00～12:00。取樣時(shí)選取帶有大花蕾時(shí)期的花枝若干，選取花蕾成熟度和大小基本一致，成熟度最好基本能夠在同一天開(kāi)放?；ò鷺悠凡杉螅⒓磶Щ貙?shí)驗(yàn)室，進(jìn)行25 ℃生化培養(yǎng)箱恒溫水培，水培時(shí)，根據(jù)自然光線強(qiáng)度補(bǔ)充適宜光照。水培至花蕾開(kāi)放，花藥開(kāi)裂后，用頭發(fā)絲小心剝落花粉，不同省源不同品種的花粉隔離處理，以免花粉相互污染。將所得花粉在硫酸紙上充分陰干后，小心收集于細(xì)口棕色瓶中，貼上標(biāo)簽備用。

1.2.2 花粉生活力測(cè)定

油茶花粉生活力測(cè)定采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑法（TTC法）與瓊脂培養(yǎng)法。

（1）TTC法是一種快速測(cè)定花粉生活力的方法。具有生活力的花粉，在呼吸代謝過(guò)程中，花粉細(xì)胞內(nèi)部的脫氫酶在催化脫氫的過(guò)程中，把氫轉(zhuǎn)移到TTC上，而TTC與氫結(jié)合后，使有生活力的花粉變成紅色；而喪失生活力或者敗育的花粉沒(méi)有呼吸代謝作用，TTC不被還原，因而花粉不被著色。

測(cè)定時(shí)用毛筆小心播撒適量花粉于潔凈的載玻片上，在花粉上小心滴加1～2滴0.5%的TTC溶液并涂抹均勻，之后小心蓋上蓋玻片。25 ℃恒溫箱中放置15～30 min，然后在10×10倍顯微鏡下進(jìn)行視野中總花粉粒及顯紅色（粉紅色）花粉粒數(shù)目觀察，每樣做3個(gè)平行玻片，每玻片選取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。選取視野時(shí)，要選取花粉粒分布均勻且花粉粒數(shù)目不少于50粒的視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

（2）瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)法。參考何春燕、袁德義等[21-24]采用的油茶花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基配方進(jìn)行試驗(yàn)。用玻璃棒蘸取適量加熱完全融化的培養(yǎng)基懸滴在潔凈的單凹載玻片上，使之厚薄均勻，接近圓形，培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)氣泡。之后用毛筆小心播撒適量花粉于培養(yǎng)基表面。置于25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，4 h后在10×10倍顯微鏡下開(kāi)始鏡檢計(jì)數(shù)，24 h后仍未萌發(fā)的花粉粒可以定為不會(huì)萌發(fā)的花粉。計(jì)數(shù)時(shí)，以花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。每樣做5平行玻片，每玻片取3個(gè)視野。選取視野時(shí)，要選取花粉粒分布均勻且花粉粒數(shù)目不少于50粒的視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

花粉萌發(fā)率=視野中已萌發(fā)的花粉粒數(shù)目/該視野中總的花粉粒數(shù)目×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種測(cè)定花粉生活力的方法比較

用TTC法對(duì)不同種源花粉生活力的測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)0.5%的TTC溶液染色后，各品種花粉的顏色均有明顯變化，出現(xiàn)紅色或粉紅色，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，紅色會(huì)逐漸加深至深紅色或暗紅色（見(jiàn)圖1）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各主推應(yīng)用良種的油茶花粉均有較高的生活力，不同種源之間存在一定差異。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選，篩選出適合本實(shí)驗(yàn)良種最適花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配方，其中湖南種源油茶良種花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基為1%瓊脂+10%蔗糖+0.015%硼酸，江西的為1%瓊脂+8%蔗糖+0.01%硼酸，廣西的為1%瓊脂+10%蔗糖+0.012%硼酸。在以上培養(yǎng)基上3省種源的油茶良種的花粉均有較好的萌發(fā)（見(jiàn)圖2），通過(guò)5次平行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)率較為穩(wěn)定，且RSD值較TTC法測(cè)定結(jié)果偏?。ㄒ?jiàn)表2）。瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)法操作較為簡(jiǎn)單、快速且結(jié)果較為直觀，只需要一般的顯微鏡即可進(jìn)行花粉萌發(fā)率的測(cè)定，該法可以有效測(cè)定山茶屬植物花粉的生活力。

圖1 TTC法檢測(cè)花粉生活力Fig.1 Pollen viability examination by TTC

表1 3省種源油茶品種TTC法花粉生活力測(cè)定結(jié)果Table 1 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of three provinces by TTC method

圖2 瓊脂培養(yǎng)基花粉離體萌發(fā)Fig.2 Pollen germination in vitro

表2 3省種源油茶品種瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)法花粉生活力測(cè)定結(jié)果Table 2 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of three provinces using agar vitro germination

2.2 不同種源油茶花粉生活力比較

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的3省種源油茶良種花粉生活力的連續(xù)取樣測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種源油茶良種花粉生活力之間存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)中湖南種源3個(gè)湘林號(hào)品種花粉生活力均值較高，其不同品種間存在一定差異（見(jiàn)圖3）；江西種源的花粉生活力5次不同花期采樣測(cè)定的數(shù)值相對(duì)較穩(wěn)定，其品種之間的差異相對(duì)較?。ㄒ?jiàn)圖4）；廣西種源的花粉生活力值相比湖南和江西種源的花粉生活力值略小，其品種間差異在三者中最大（見(jiàn)圖5）。

圖3 湖南種源油茶品種花粉生活力測(cè)定結(jié)果Fig. 3 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of Hunan province

圖4 江西種源油茶品種花粉生活力測(cè)定結(jié)果Fig. 4 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of Jiangxi province

圖5 廣西種源油茶品種花粉生活力測(cè)定結(jié)果Fig. 5 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of Guangxi province

3 結(jié)論與討論

（1）通過(guò)對(duì)湖南、江西和廣西3?。▍^(qū)）種源油茶主推良種在相同立地條件下進(jìn)行花粉生活力和萌發(fā)力檢測(cè)結(jié)果得出，它們的花粉活力值在87.51%～66.98%之間，花粉萌發(fā)力值在87.91%～70.47%之間，表現(xiàn)出了較高的花粉生活力，但種源間存在顯著差異。不同林齡、不同年份檢測(cè)的結(jié)果相近?；ǚ凵盍Ω叩团c品種內(nèi)在遺傳特性有關(guān)，同時(shí)也受其立地及氣候的影響。湖南、江西、廣西種源的油茶良種花粉生活力既有種質(zhì)遺傳差異，也與是否適地適樹(shù)有一定相關(guān)。如李開(kāi)祥等[18]在廣西實(shí)驗(yàn)地對(duì)油茶不同無(wú)性系花粉活力檢測(cè)結(jié)果顯示：廣西種源無(wú)性系其花粉活力表現(xiàn)要比來(lái)自湖南種源湘林無(wú)性系花粉生活力高。導(dǎo)致這一結(jié)論的原因除了實(shí)驗(yàn)中所選擇的無(wú)性系不同其花粉生活力不同外，另一個(gè)重要原因應(yīng)是湖南種源的無(wú)性系引種到廣西該地區(qū)存在適應(yīng)性問(wèn)題。據(jù)王湘南[19]對(duì)湖南長(zhǎng)沙油茶資源圃測(cè)定30個(gè)油茶種質(zhì)的花粉生活力在38.51%～91.85%之間，其中湖南油茶良種湘林1號(hào)花粉生活力高達(dá)90%以上，而所測(cè)定的花粉活力低的只有38.51%?？梢?jiàn)油茶不同種質(zhì)、品種間其花粉活力差異非常顯著。本實(shí)驗(yàn)中的油茶良種花粉生活力明顯較高，顯示出了良種的優(yōu)良特性。

（2）湖南種源油茶良種花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基為1%瓊脂+10%蔗糖+0.015%硼酸，江西和廣西種源良種通過(guò)調(diào)整蔗糖和硼酸濃度可使花粉萌發(fā)達(dá)最佳狀態(tài)。不同種源品種花粉瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)需多次實(shí)驗(yàn)，調(diào)整培養(yǎng)基配方，做到花粉充分萌發(fā)而使檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。

（3）采用TTC法和瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)法同時(shí)檢測(cè)花粉生活力可以起到相互校驗(yàn)而讓檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。按常規(guī)用TTC染色法檢測(cè)花粉生活力值應(yīng)該比用瓊脂培養(yǎng)基離體萌發(fā)法檢測(cè)的花粉萌發(fā)力值略高，因?yàn)榇嬖诨ǚ塾谢盍Φ灰欢軌蛎劝l(fā)的現(xiàn)象。但從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示它們之間沒(méi)有很明顯的必然規(guī)律，有略高也有略低。分析有可能是實(shí)驗(yàn)操作中不可控因素造成。采用這2種方法同時(shí)檢測(cè)起到較好的校驗(yàn)和修正作用。

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Study on pollen viability of Camellia oleifera improved varieties from different species

WANG Xiang-nan, CHEN Yong-zhong, WANG Rui, CHEN Long-sheng, PENG Shao-feng, MA Li, LUO Jian, TANG Wei
(National Engineering Research Center for Oil-tea Camellia, Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

Pollen viability and germination ability were studied on ordinaryCamellia oleiferacultivars from Hunan, Jiangxi and Guangxi provinces, by TTC method and agar in vitro germination. The result showed: Firstly, the pollen viability of differentCamellia oleiferacultivars from different regions were differences, pollen viability of improved varieties from Hunan ware higher in this experiment at about 87.51%-66.98%, pollen germination capacity range from 87.91%-70.47%, displayed the excellent characteristics of the improved varieties; Secondly, provenance ofCamellia oleiferafrom Hunan optimal pollen germination medium was 1% agar+10%sucrose+0.015% boric acid, provenance ofCamellia oleiferafrom Jiangxi and Guangxi ware slightly changed the concentration of sucrose and boric acidity before achieving the best pollen germination. TTC method using an agar medium and germinated in vitro method for simultaneous detection of pollen viability can check each other; Thirdly, the level of pollen viability related to inherent genetic characteristics of the species, and is relevant with site and weather conditions.

Camellia oleifera; improved varieties; pollen; medium; pollen viability; pollen germination rate

S794.4

A

1673-923X(2016)12-0001-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.001

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-08-14

湖南省科技廳重大專項(xiàng)“油茶高產(chǎn)、高含油、高抗逆良種組合篩選”（2013FJ1006-1）

王湘南，研究員，碩士

陳永忠，博士生導(dǎo)師，博士；E-mail：chenyongzhong06@163.com

王湘南，陳永忠，王 瑞，等. 不同種源油茶良種花粉生活力研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016, 36(12): 1-5.

[本文編校：文鳳鳴]