林小莉，李 寧，霍 峰，董艷峰，彭 瑋

(哈爾濱市獸藥飼料監(jiān)察所，黑龍江 哈爾濱 150010)

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氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定飼料中6種雌激素類藥物

林小莉*，李 寧，霍 峰，董艷峰，彭 瑋

(哈爾濱市獸藥飼料監(jiān)察所，黑龍江 哈爾濱 150010)

建立了固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)同時測定飼料中己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、17β-雌二醇、雌三醇的檢測方法。飼料樣品經(jīng)乙醚提取后，HLB固相萃取柱凈化、衍生化后用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，己烷雌酚在2.5～250 ng/mL，其它5種雌激素類藥物在5～500 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不小于0.99，檢出限為3～8 μg/kg，樣品的平均加標(biāo)回收率為75.9%～96.3%。該方法檢出限低，能夠準(zhǔn)確進行定性和定量測定，可同時測定飼料中的6種雌激素類藥物。

氣相色譜-質(zhì)譜；己烷雌酚；己烯雌酚；雙烯雌酚；雌酮；雌二醇;雌三醇；飼料

近年來，我國食品安全問題日益突出，而動物源性食品的激素類藥物殘留問題已成為目前國內(nèi)外食品安全的一個熱點問題。飼料是各種畜禽動物攝入外源性激素的主要途徑，這些激素類藥物不僅會引起動物自身生理特征的變化，而且在動物生長發(fā)育的過程中會殘留于動物體內(nèi)，通過食物鏈進入人體，人類長時間食用這些食品，會產(chǎn)生如性早熟、第二特征異常、各種癌癥和腫瘤等疾病，最終影響人體健康[1-5]。因此，飼料的質(zhì)量安全是保障人類食品安全的重要基礎(chǔ)。農(nóng)業(yè)部陸續(xù)發(fā)布了如235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》和176號公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》等政府文件，明確規(guī)定禁止在食用動物飼養(yǎng)及飲用水中使用如己烷雌酚、己烯雌酚等激素類藥物促進動物快速生長發(fā)育或其它相關(guān)用途[6-7]。當(dāng)前文獻報道的激素殘留檢測主要針對動物源食品[8-12]，關(guān)于飼料方面的報道較少[13-14]。本文建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定飼料中6種雌激素的方法，具有檢出限低、準(zhǔn)確度高、可同時測定多種雌激素類藥物等特點，適用于飼料中雌激素類藥物的檢測。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

己烷雌酚、乙烯雌酚品、雙烯雌酚、17β-雌二醇、雌三醇、雌酮標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)；N，O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99+1)衍生劑；甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，F(xiàn)isher 公司)；氨水、乙酸銨、鹽酸、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、三氯甲烷、氫氧化鈉(分析純，科密歐試劑公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國 Agilent 公司)：單四極桿，配分流/不分流毛細管柱進樣器、GC-MS化學(xué)工作站和 EI 電離源;HP-5 MS石英毛細管柱，固定相(5%苯基)-甲基聚硅氧烷，25 mm×0.32 mm×0.52 μm,購自美國 Agilent 公司；12通道半自動固相萃取裝置(美國Gilson公司)；AB204-N型電子分析天平(精度 0.000 1 g)、AB265-S型電子分析天平(精度 0.000 01 g)和DELTA320精密 pH 計(德國梅特勒-托利多儀器有限公司)；HLB固相萃取柱(500 mg/3 mL，美國Waters公司)；VELOCITY 18R高速冷凍離心機(澳大利亞Jouan 公司);N-EVAP-24氮吹濃縮裝置(美國Organomation公司)。

1.3 樣品測定

1.3.1 樣品前處理及測定 準(zhǔn)確稱取5 g動物飼料于50 mL離心管中，加入10 mL 0.2 mol/L的乙酸銨緩沖溶液，勻質(zhì)1 min，加入10 mL乙醚，旋渦振蕩提取3 min，10 000 r/min離心5 min，吸取乙醚層于另一試管中，用乙醚重復(fù)提取1次，合并乙醚相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入5 mL三氯甲烷溶解殘余物，旋渦振蕩1 min，加入5 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，旋渦振蕩1 min，于10 000 r/min離心5 min，上層水相移入另一試管中，用氫氧化鈉溶液重復(fù)提取1次，合并氫氧化鈉溶液提取液。加入1 mL甲醇，用HCl調(diào)pH值為6.0～6.5。

依次用5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇和5 mL鹽酸溶液(pH 3.0)活化HLB固相萃取柱，取全部備用液過柱，控制流速不超過2 mL/min，再依次用5 mL水-甲醇(體積比為9∶1)和5 mL正己烷淋洗小柱，將固相萃取柱抽干，最后用5 mL甲醇洗脫，50 ℃氮氣吹干。

于試管中加入100 μL N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99+1)衍生化試劑，于振蕩器上混勻，在70 ℃烘箱中加熱1 h，放置冷卻后用氮氣吹干，加入200 μL異辛烷溶解，上機測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確量取25 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，裝入50 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，所得每種標(biāo)準(zhǔn)溶液中含己烷雌酚為5 μg/mL，其它雌激素為10 μg/mL，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋成己烷雌酚濃度分別為2.5，5.0，12.5，25，50，250 ng/mL，其它雌激素濃度為5.0，10，25，50，100，500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化 吸取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在40 ℃下用氮氣吹干，與上述樣品衍生化同樣處理，上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 升溫程序：初始柱溫 150 ℃,保持 0 min，以10 ℃/min升至180 ℃(保持10 min)，以5 ℃/min升至250 ℃，保持2 min,再以30 ℃/min升至300 ℃(保持1 min)。載氣：高純氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；接口溫度：280 ℃。進樣方式及進樣量：不分流進樣，1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：EI 源，離子源溫度：250 ℃；四極桿溫度：100 ℃；溶劑延遲：22 min；選擇離子監(jiān)測(m/z)：己烷雌酚(179,207,208,399)、己烯雌酚(383,397,412,413)、雙烯雌酚(381,395,410,411)、雌酮(218,257,342,343)、17β-雌二醇(232,285,416,417)、雌三醇(311,345,386,504)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理試劑的選擇

文中6種雌激素在弱極性或中等極性的有機溶劑中有較高的溶解性，因此分別用乙醚、乙酸乙酯、乙腈進行提取。結(jié)果顯示，以上述3種溶劑作為提取劑時，樣品的回收率分別為85%～95%,51%～75%和52%～65%。其中，使用乙醚作為提取劑的回收率最高，且提取完全、除脂效果好。由于飼料中的蛋白質(zhì)含量高，所以溶液蒸干后需去除蛋白質(zhì)。分別考察了三氯甲烷、四氯化碳、正己烷、二氯甲烷4種有機溶劑對蛋白質(zhì)的去除效果，結(jié)果表明，三氯甲烷的除蛋白效果優(yōu)于其他有機溶劑。本實驗采用乙醚作為樣品提取溶劑，并用三氯甲烷去除飼料中的蛋白。

2.2 固相萃取柱的選擇

飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的色素、有機酸等，不僅會干擾目標(biāo)物的分析，而且對色譜柱和質(zhì)譜會造成影響[14]。本實驗對HLB柱、PEP柱、Max柱和PAX柱4種固相萃取柱的凈化效果進行比較，結(jié)果表明，使用HLB柱時6種雌激素類藥物的回收率最高，為89%～102%，使用其他固相萃取柱獲得的回收率均偏低。HLB柱不僅能同時除去飼料中的色素及有機酸等基質(zhì)，而且能夠獲得較高的回收率。因此采用HLB柱對飼料樣品進行凈化處理。

2.3 衍生化試劑的選擇

常用的衍生化方法有硅烷化、酰化、烷基化和肟化。實驗選用七氟丁酸酐(HFBA)、BSTFA(99+1)和三甲基苯胺(TMAH) 3種衍生化試劑進行比較。由于BSTFA(99+1)是將硅烷基引入到分子中，一般取代活性氫，進而使得含活性氫反應(yīng)位點數(shù)目減少，化合物的穩(wěn)定性得以加強。另一方面，由于生成的硅烷化衍生物的極性減弱，導(dǎo)致其被測能力增強，熱穩(wěn)定性提高[15]。本實驗的結(jié)果表明，HFBA不穩(wěn)定，易變色失效；使用BSTFA(99+1)作為衍生化試劑時樣品的回收率為86%～98%，而使用TMAH時的回收率為73%～89%，表明TMAH的衍生效果不如BSTFA(99+1)好。因此,實驗使用BSTFA(99+1)作為衍生化試劑。

2.4 衍生化反應(yīng)溫度及時間的選擇

衍生化反應(yīng)需在一定的溫度條件下進行，否則重復(fù)性差。實驗分別在60，70，80 ℃進行衍生化，結(jié)果表明，樣品在70 ℃下衍生效果最好，回收率可達82%～96%，而在60 ℃和80 ℃時雌酮和雌三醇的回收率均低于60%。實驗最終確定衍生化溫度為70 ℃。采用60 min的反應(yīng)時間時，衍生反應(yīng)比較完全。若衍生時間過短，反應(yīng)不完全，而時間過長，則反應(yīng)副產(chǎn)物增加，回收率降低。因此本實驗采用60 min作為最佳反應(yīng)時間。

圖1 采用HP-5 MS色譜柱時6種雌激素類藥物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of six extrogenous hormones on a HP-5 MS column peak No.(1-6) was the same as those in Table 1

2.5 色譜-質(zhì)譜實驗條件的確定

2.5.1 色譜系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 雌激素類藥物衍生物的極性低，相對分子質(zhì)量大，實驗采用固定相為5%苯基-甲基聚硅氧烷的HP-5 MS石英毛細管柱進行分離，為使目標(biāo)峰與衍生副產(chǎn)物峰及其它干擾峰分開，采用程序升溫進行GC分離。在上述色譜條件下，向空白飼料樣品中添加100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，得到的色譜圖如圖1所示。由圖可以看出各待測物的分離良好，峰形尖銳且對稱。

2.5.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 在全掃描模式下，分別獲得雌激素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)衍生物的總離子流色譜圖，確定被測物的保留時間。同時，扣除本底后，根據(jù)對全掃描平均質(zhì)譜圖的分析，確定被測物的特征離子及離子間的相對強度。本實驗選擇4個特征離子進行定性。如表1所示，采用GC-MS的全掃描方式，對目標(biāo)物的定性離子掃描，從而提高了靈敏度,改善了峰形和精確度，完全能滿足痕量分析的要求。

表1 6種雌激素類藥物的保留時間、特征離子與相對豐度

Table 1 Retention times,characteristic ions and relative abundances of six extrogenous hormones

PeakNo．CompoundRetentiontime(min)Characteristicions(relativeabundance/%)1Hexoestrolum(己烷雌酚)2566～2725207?(1000)，179(70)，208(190)，399(20)2Diethylstilbestrol(己烯雌酚)2603～2779412?(1000)，383(220)，397(180)，413(370)3Dienestrol(雙烯雌酚)2618～2780410?(1000)，381(240)，395(690)，411(390)4Estrone(雌酮)3266～3468342?(1000)，218(360)，257(410)，343(370)517β?Estradiol(17β?雌二醇)3407～3617285?(1000)，232(330)，416(950)，417(390)6Estriol(雌三醇)3940～4185345?(1000)，311(980)，386(530)，504(750)

*quantitative ion

2.6 回收率與精密度

采集濃縮飼料、配合飼料和預(yù)混合飼料空白樣品各5份，經(jīng)粉碎處理后，在樣品中按高、中、低3個濃度水平添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行回收實驗及精密度實驗。按照“1.3”進行樣品處理，采用GC-MS測定，回收率結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：濃縮飼料、配合飼料和預(yù)混合飼料的平均回收率分別為76.3%～96.3%，77.4%～90.1%和75.9%～87.4%。6種雌激素類藥物的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 為5.1%～16.9%，批間RSD為6.7%～22.7%,表明本方法具有良好的精密度。

表2 飼料中雌激素類藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of six estrogens spiked in feed samples

CompoundConcentratedfeed(濃縮飼料)Compoundfeed(配合飼料)Premixedfeed(預(yù)混合飼料)Spiked(ng/mL)Recovery(%)Intra?RSD(%)Inter?RSD(%)Spiked(ng/mL)Recovery(%)Intra?RSD(%)Inter?RSD(%)Spiked(ng/mL)Recovery(%)Intra?RSD(%)Inter?RSD(%)Hexoestr?olum751502508889638571261381331031531467515025090185282711711086131214152751502508438208479411684158163134Diethyls?tilbestrol1252504008408118751261145217815714912525040083777483011071102206108124125250400830833874995751154137135Dienestrol2503505007968688118856991167610925035050079881282611362105103102100250350500810881803118529679119103Estrone1252504008307998631699956209146154125250400769790843127128771711011101252504007598048268162961159411417β?estra?diol1252504007638078301031251282271361381252504008068138051386594133100110125250400835808869113817710910195Estriol250350500831802843103938514910614525035050077578983197598584871052503505007928548137760768067111

2.7 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢出限

按“1.3.2”方法將混合標(biāo)準(zhǔn)液逐級稀釋，配成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照本方法依次進行測定，以得到的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的溶液濃度(x,ng/mL)為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線(結(jié)果見表3)。

表3 6種雌激素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

Table 3 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients(r2) and limits of detection of six estrogens

EstrogenRegressionequationLinearrange(ng·mL-1)r2LOD(μg/kg)Hexoestrolumy=4177x+167725～250099903Diethylstilbestroly=1114x+11955～500099905Dienestroly=7162x+33175～500099908Estroney=2964x+99955～50009990517β?Estradioly=3664x-23345～500099905Estrioly=1166x-24115～500099918

圖2 實際樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of a real sample1.hexoestrolum,2.diethylstilbestrol

由表3可知：該方法的線性范圍寬，相關(guān)系數(shù)均在 0.99以上。在空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)液，以信噪比S/N≥3時空白樣品中的添加濃度確定分析物的檢出限(LOD)[15]。每次平行操作7次，記錄對應(yīng)的待測物濃度，求出平均濃度。結(jié)果表明，本方法的檢出限為3～8 μg/kg，適用于飼料中6種雌激素類藥物的測定。

2.8 樣品的測定

依據(jù)本文建立的測定方法，對監(jiān)督檢測、企業(yè)委托的100份飼料進行了測定，其中1份飼料樣品中檢出己烷雌酚和己烯雌酚，其檢出含量分別為0.37%和0.21%。其它化合物則均未檢出，檢出樣品的圖譜見圖2。

3 結(jié) 論

本文建立了氣相色譜-質(zhì)譜同時測定飼料中6種雌激素類藥物的分析方法。樣品用乙醚提取后用三氯甲烷去除蛋白質(zhì)，使用HLB固相萃取柱凈化后進行衍生化，上機進行定量和定性分析。該方法的線性范圍寬，檢出限低，能夠滿足飼料中雌激素類藥物的檢測要求，可實現(xiàn)多種雌激素的同時測定，從而為提高檢測效率、維護飼料安全、防止非法添加、確保食品安全提供了理論依據(jù)。

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Simultaneous Determination of Six Estrogens in Feed by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LIN Xiao-li*,LI Ning,HUO Feng,DONG Yan-feng,PENG Wei

(Institute of Veterinary Drug and Food Control in Harbin，Harbin 150010，China)

A method was developed for the simultaneous determination of hexoestrolum,diethylstilbestrol,dienestrol,estrone,17β-estradiol and estriol in feed by solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).After extracted with ethyl ether and cleaned-up on an HLB phase extraction column,six kinds of estrogens were derived and quantified by GC-MS.The external standard calibration curves were used for the quantification.The results showed that the high linear ranges from 2.5 ng/mL to 250 ng/mL for hexoestrolum and from 5 ng/mL to 500 ng/mL for five other estrogens were obtained with correlation coefficients (r2) not less than 0.99.The limits of detection were in the range of 3-8 μg/kg and the average recoveries were 75.9%-96.3%.The results demonstrated that the developed method could be applied in the qualitative and quantitative determination of six kinds of estrogens in feed with low limit of detection and high accuracy.

gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);hexoestrolum;diethylstilbestrol;dienestrol;estrone;17β-estradiol;estriol;feed

2015-06-17；

2015-09-21

哈爾濱市科技攻關(guān)計劃(2014AB3BN041)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.011

O657.63;O629.8

A

1004-4957(2016)03-0322-05

*通訊作者：林小莉，高級工程師，研究方向：獸藥及獸藥殘留檢測管理，Tel：0451-84300879，E-mail:y84300879@126.com